Door een dubbele behandeling met colchicine kan een plantaardige toxine die delende cellen doodt, zenuwvrije Hydra vulgaris gegenereerd worden. Deze Hydra kunnen niet op zichzelf voeden of opkomen. Dit artikel beschrijft een verbeterde methode voor langdurig onderhoud van zenuwvrije Hydra vulgaris in het laboratorium.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie en langdurig onderhoud van zenuwvrije
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De interstitiële cellijn van Hydra omvat multipotente stamcellen, en hun derivaten: kliercellen, nematocyten, kiemcellen en zenuwcellen. De interstitiële cellen kunnen worden geëlimineerd door twee opeenvolgende behandelingen met colchicine, een plantaardig afgeleid toxine dat delende cellen doodt, waardoor het potentieel voor vernieuwing van de gedifferentieerde cellen die afgeleid zijn van de interstitiale stamcellen wissen. Dit zorgt voor de generatie van Hydra die zenuwcellen ontbreekt. Een zenuwvrije poliep kan zijn mond niet openen om osmotische druk te voeden, te bevestigen of te reguleren. Dergelijke dieren kunnen echter overleven en onbeperkt in het laboratorium worden gekweekt als ze regelmatig worden gevoed en geborsteld. Het gebrek aan zenuwcellen zorgt voor studies van de rol van het zenuwstelsel bij het reguleren van diergedrag en regeneratie. Voorheen gepubliceerde protocollen voor zenuwvrij Hydra onderhoud behoren verouderde technieken zoals mondpipetten met handgetrokken micropipette tIps om de Hydra te voeden en te reinigen. Hier wordt een verbeterd protocol voor het onderhoud van zenuwvrije Hydra geïntroduceerd. Met fijngespoten tangen worden de mond opengemaakt en vers gedood Artemia . Na de krachtvoeding wordt de lichaamsholte van het dier gespoeld met vers medium met behulp van een spuit en een inktnek om ongeversteld materiaal te verwijderen, hierna aangeduid als "boren". Deze nieuwe methode van krachtvoeding en borstende zenuwvrije Hydra door het gebruik van tang en spuiten elimineert de behoefte aan mondpipettering met handgetrokken micropipette tips. Het maakt het proces dus veiliger en aanzienlijk meer tijd efficiënt. Om ervoor te zorgen dat de zenuwcellen in het hypostome zijn geëlimineerd, wordt immunohistochemie gebruikt met anti-tyrosine-tubuline.
Inleiding
Het zenuwstelsel van Hydra bestaat uit een zenuwnet, met neuronen geassocieerd met beide epitheliale weefsellagen 1 . Het zenuwnet is dikker in de hypostome en de peduncle en minder dicht in de lichaamskolom 2 . De zenuwcellen zijn afkomstig van interstitiële stamcellen, die multipotente stamcellen zijn die aanleiding geven tot secretory cellen, nematocyten, kiemcellen en neuronen 1 . Het is mogelijk om de interstitiële cellen van Hydra vulgaris te elimineren door middel van behandeling met colchicine 3 , 4 , een plantaa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Dubbele Colchicine Behandeling
- Maak een 0,4% colchicine (gewicht / volume) oplossing in Hydra medium 3 , 4 , 17 .
Let op: Colchicine is acuut giftig, fataal bij inslikken, kan genetische afwijkingen veroorzaken en kan oogletsel veroorzaken. Hanteer het poeder in een dampkoker en draag volledige persoonlijke beschermende uitrusting (PPE). - Incubate Hydra vulgaris (AEP stam werd hier gebruikt) die 24 uur in 0,4% colchicine bij een verhouding van 5 Hydra per ml colchicine oplossing in een Petri schotel ge....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Onmiddellijk na de eerste 8 uur colchicine behandeling, overleven alle Hydra . Sommige van deze Hydra hebben alleen nog tentakelstubben ( Figuur 3 A ), terwijl anderen hun tentakels volledig zullen hebben verloren ( Figuur 3 B ). Over de volgende 1 of 2 dagen zullen de tentakels blijven krimpen totdat alle Hydra hun tentakels hebben verloren. Ongeveer 1 week na de beha.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hydra interstitiële cellen kunnen worden geëlimineerd via een dubbele colchicine behandeling 3 , 4 . In de dagen na de eerste behandeling is het van cruciaal belang om contact tussen individuele Hydra te vermijden om fusie van Hydra- stukken in vervormde Hydra te vermijden. Ook kunnen dieren die ongeassistreerd zijn na de eerste behandeling verwijderd worden, omdat de tweede colchicinebehandeling wellicht niet voldoende is om .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Dick Campbell (UC Irvine) voor discussies over het oorspronkelijke protocol voor het opwekken en onderhouden van zenuwvrije dieren, mevrouw Rui Wang voor hulp bij het aanpassen van de spuit- en naaldtechniek, en mevrouw Danielle Hagstrom en dr. Rob Steele (UC Irvine) voor opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de RCSA en NSF-subsidie CMMI-1463572.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Kan lokaal worden gekocht |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | Een 27G naald kan ook worden gebruikt |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4'6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Lengte van de pipet doet er niet toe |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Kan worden gekocht bij lokale bouwmarkt |
Referenties
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migratio....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
