Cryopreservatie van zebravis testis van hele Testes Needle ondergedompeld Ultra snelle koeling

Samenvatting

Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Daarnaast is de herhaalbaarheid van de methode in vijf verschillende zebrafish stammen was getest.

Samenvatting

Huidige trends in science en biotechnologie leiden tot de oprichting van duizenden nieuwe lijnen in modelorganismen, waardoor de noodzaak voor nieuwe methoden voor de veilige opslag van genetische hulpbronnen buiten de gemeenschappelijke praktijken van het houden van de kolonies kweken. Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Cryopreservatie van beginnende geslachtscellen door hele teelballen NIV biedt mogelijkheden voor de opslag van zebravis genetische hulpbronnen, vooral omdat na de transplantatie ze in zowel mannelijke als vrouwelijke gameten rijpen kunnen. Teelballen waren weggesneden, gevestigd op een acupunctuur-naald, geëquilibreerd in twee cryoprotective media (oplossing met 1,5 M methanol en 1,5 M propyleenglycol; en verglazing oplossing met dimethylsulfoxide van 3 M en 3 M propyleenglycol) en duik in vloeibare stikstof. Monsters werden opgewarmd in een reeks van drie oplossingen voor daaruit voortvloeiende opwarming van de aarde. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn (1) het ontbreken van spermatozoïden na vertering van verwarmde teelballen waardoor downstream manipulaties; (2) Ultra snelle koeling waardoor de optimale Gasbedwelming met behulp van weefsels vloeibare stikstof, dus het maximaliseren van de koeling en het verminderen van de vereiste concentratie van cryoprotectant, waardoor hun toxiciteit; (3) synchrone Gasbedwelming met behulp van verschillende teelballen cryoprotectant en vloeibare stikstof; en (4) herhaalbaarheid aangetoond door het verkrijgen van de levensvatbaarheid van boven de 50% in vijf verschillende zebrafish stammen.

Inleiding

Nieuwe trends in science en biotechnologie hebben geleid tot de oprichting van duizenden nieuwe mutant lijnen van muizen, Drosophila, zebravis en andere soorten gebruikt als modelorganismen transferoefeningen biomedische en andere wetenschappen¹. Bovendien, als nieuwe technologieën worden ontwikkeld en beschikbaar, de nummers van mutant lijnen verhogen gestaag². Dit leidt tot de noodzaak voor een veilige opslag van genetische hulpbronnen buiten de gemeenschappelijke praktijken van het houden van de kolonies kweken. Als een methode waarmee de veilige opslag van genetische hulpbronnen voor onbepaalde tijd, cryopre....

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Hongaarse Animal Welfare wet.

1. reagens voorbereiding

1. Stamoplossingen
   1. Bereiden 1 M trehalose door 0.378 g trehalose dihydraat toe te voegen in 1 mL dH₂O. Mix, goed tot het volledig oplost.
   2. Bereiden 1 M sacharose door toe te voegen 0.342 g van sacharose in 1 mL dH₂O. Mix goed totdat het volledig oplost.
   3. Bereiden 1 M HEPES door 0.238 g HEPES toe te voegen aan 1 mL dH₂O. Mix, goed tot het volledig oplost.
   4. 20 mg/mL collagenase (290 U/mg) voor te bereiden door 100 mg 5 ml PBS toe te voegen. Meng t....

Resultaten

Gemiddeld, het aantal beginnende kiemcellen geïsoleerd uit een enkele verse zebrafish testis varieerde tussen de 40.000 en 200.000 cellen afhankelijk van de grootte van de vis. Wanneer verteren verse zebrafish teelballen in alle 5 stammen, waren vroege-kiemcellen niet de enige cellen aanwezig in de cel suspensies (Figuur 2). Naast de beginnende geslachtscellen, werden talrijke spermacellen teruggevonden. Aan de andere kant, waren er veel minder spermacellen n.......

Discussie

Het voornaamste doel van deze studie was ondergedompeld Ultra snelle koeling procedure ontwikkeld voor aviaire en zoogdieren soorten^10,11,12 te cryopreservatie van vis testis (zebravis als model aan te passen van de naald organisme). Allermeest naar de eerdere studies ten aanzien van cryopreservatie van genetische hulpbronnen van de zebravis waren voornamelijk gericht op cryopreservatie van zebravis sperma²

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Leibovitz media (L-15)	Sigma-Aldrich	L1518	Supplemented met L-glutamine
Fetaal bovien serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Tricaine methaansulfonaat (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Sucrose	Acros Organics	57-50-1
Trehalose	Acros Organics	99-20-7	Dihydraat
Methanol	Reanal	20740-0-08-65
Propyleenglycol	Reanal	08860-1-08-65
Dimethylsulfoxide	Reanal	00190-1-01-65
Collageenase	Gibco	9001-12-1
Trypsine	Sigma-Aldrich	T8003
DNase I	Panreac AppliChem	A3778
Trypanblauw	Sigma-Aldrich	T6146
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	Tabletten voor bereiding van 200 ml PBS-oplossing