Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

Samenvatting

Een nieuwe generatie van cel-vrije transcriptie-vertaling platforms is ontworpen voor de bouw van biochemische systemen in vitro middels het uitvoeren van gene circuits. In dit artikel beschrijven we hoe bacteriofagen, zoals MS2, ΦΧ174 en T7, worden gesynthetiseerd uit hun genoom met behulp van een alle E. coli cel-vrije TXTL systeem.

Samenvatting

Een nieuwe generatie van cel-vrije transcriptie-vertaling (TXTL) systemen, ontworpen om een grotere veelzijdigheid en modulariteit, bieden nieuwe mogelijkheden voor het uitvoeren van fundamentele en toegepaste wetenschappen in reageerbuis reacties. In het afgelopen decennium, cel-vrije TXTL geworden tot een krachtige techniek voor een breed scala aan roman multidisciplinair onderzoek gebieden gerelateerd aan kwantitatieve en synthetische biologie. De nieuwe TXTL-platforms zijn vooral handig om te bouwen en ondervragen biochemische systemen middels het uitvoeren van synthetische of natuurlijke gene circuits. In vitro TXTL heeft bewezen handig om snel een prototype regelgevende elementen en biologische netwerken alsmede over recapituleren moleculaire zelf-assemblage mechanismen gevonden in levende systemen. In dit artikel beschrijven we hoe besmettelijk bacteriofagen, zoals MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), en T7 (dsDNA), volledig worden gesynthetiseerd uit hun genoom in één-pot reacties met behulp van een alle Escherichia coli, cel-vrije TXTL systeem. Synthese van de drie coliphages is gekwantificeerd aan de hand van de bepaling van de plaque. Laten we zien hoe de opbrengst van gesynthetiseerde bacteriofaag hangt af van de biochemische instellingen van de reacties. Moleculaire verdringing, geëmuleerd door middel van een gecontroleerde concentratie van PEG 8000, beïnvloedt de hoeveelheid gesynthetiseerde bacteriofagen bij beschikkingen van grootheden. Ook beschrijven we hoe de bacteriofagen versterken en hoe om te zuiveren van hun genoom. De set van protocollen en resultaten gepresenteerd in dit werk moet van belang zijn voor multidisciplinaire onderzoekers die betrokken zijn in de cel-vrij van synthetische biologie en studierichtingen Bio-ingenieur.

Inleiding

In het afgelopen decennium, is de cel-vrije expressie-technologie ontworpen voor adres nieuwe toepassingen in de opkomende multidisciplinair onderzoek gebieden verband houden met synthetische en kwantitatieve biologie. Oorspronkelijk gebruikt om eiwitten onafhankelijk van een levend organisme, zijn nieuwe cel-vrije TXTL systemen ontwikkeld voor zowel fundamentele en toegepaste wetenschappen^1,2, aanzienlijk uitbreiding van het toepassingsgebied van deze technologie. De nieuwe generatie van TXTL platforms is ontworpen als gebruikersvriendelijke, efficiënter (bereiken eiwitsynthese in batch mode³2 mg/mL), meer veelzijdig op het niveau van transcriptie⁴en modulaire om gemakkelijk te integreren roman natuurlijke of synthetische functies die de mogelijkheden van de bestaande biologische systemen^5,6uitbreiden. In het bijzonder, cel-vrije TXTL systemen geworden handig voor de rapid prototyping van genetische programma's, zoals regelgevende elementen of kleine genetische circuits^7,8,9, door het verminderen van de ontwerp-bouw-test Fietsen naar een paar dagen. Opmerkelijk, de nieuwe TXTL systemen zijn ook geschikt voor de verwerking van grote DNA-programma's zoals de complete synthese van coliphages^10,11, waaruit blijkt sterk genoeg optredens ter ondersteuning van de reconstitutie van actieve genomic DNA gecodeerd levende wezens.

TXTL systemen presenteren veel technische voordelen ten opzichte van traditionele in vitro constructieve biochemische tests. Het proces van genexpressie verbindt cel-vrije TXTL met het eindproduct in een beperkte en open omgeving, in tegenstelling tot het complexe cytoplasma van een levende cel. TXTL maakt gebruik van DNA te reconstrueren biochemische systemen in vitro, die met de moderne technieken van DNA vergadering, is betaalbaar en snel naast niet kieskeurig eiwit zuivering stappen vereist. Cel-vrije meningsuiting biedt directe toegang tot de meeste van de componenten in de biochemische reacties, waardoor een diepere dissectie van de moleculaire interacties¹². In de reactie van een TXTL, kan een wijzigen de biochemische en biofysische instellingen wil, die bijna onmogelijk in een levende cel is. Gezien deze voordelen en recente verbeteringen, wordt de TXTL-technologie steeds meer en meer populair als een alternatief platform voor synthetische en kwantitatieve biologie. Hoewel de wetenschappelijke wereld met behulp van TXTL snel groeiende is en TXTL een standaardtechnologie in studierichtingen Bio-ingenieur wordt, is het essentieel om te begrijpen hoe met dergelijke platforms te ontwikkelen passende praktijken in verband met de uitvoering van TXTL reacties en de interpretatie van de resultaten.

In dit artikel beschrijven we hoe u met een al systeem van de TXTL van de E. coli synthetiseren, in één-pot-reacties, bacteriofagen van hun genoom¹¹, zoals MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), en T7 (dsDNA, 40 kb). We laten zien hoe het bedrag van bacteriofagen gesynthetiseerd wijzigingen met betrekking tot bepaalde biochemische-instellingen van de reacties (concentraties magnesium en kalium). Moleculaire verdringing, geëmuleerd via een scala van PEG 8000 concentraties, heeft een dramatisch effect op de bacteriofaag synthese over verschillende ordes van grootte. De realisatie van dergelijke grote biochemische systemen in één reageerbuis reacties die recapituleren gelijktijdig de processen van transcriptie, vertaling, en zelf-assemblage, is interessant voor het aanpakken van fundamentele kwesties in verband met biologie en biofysica ¹⁰ (genregulatie, zelf-assemblage), evenals voor ontwikkeling van toepassingen, zoals de herbestemming van phage functies om te bouwen van nieuwe nanostructuren¹³. Naast een praktische op TXTL voorzien we in methoden faag amplificatie, genoom extractie en zuivering en kwantificering van de bacteriofaag door de plaque-bepaling. De methoden die in dit manuscript gepresenteerd zijn geschikt voor onderzoekers die E. coli extract gebaseerd cel-vrije systemen gebruiken en zijn geïnteresseerd in bacteriofagen.

De protocollen gepresenteerd in dit werk kunnen worden samengevat als volgt: 1) Phage versterking (dag 1: bereiden van inoculatie cellen, dag 2: enkele plaque, meerdere faag groei, en concentratie en dag 3: zuivering van bacteriofaag), 2) Double-stranded genoom-DNA-extractie (fenol/chloroform extractie), en 3) cel-vrije faag reactie en titer experiment (dag 1: plaat van cellen van de gastheer en maak agar platen, dag 2: reactie cel-vrij en gastheer cel pre cultuur en dag 3: host cel cultuur en phage titer).

Protocol

Opmerking: de volgende stappen van de versterking en extractiemethode zijn grotendeels generaliseerbaar voor vele double-stranded DNA bacteriofaag, bijvoorbeeld bacteriofaag T7, enterobacteria faag T4 of enterobacteria faag λ (L). Ze worden voornamelijk gebruikt voor een bacteriofaag waarvan genoom niet beschikbaar voor aankoop uit commerciële bronnen is.

1. versterking van phage

Opmerking: de single-plaque, multi cycle (SPMC) faag productietechniek is goed beschreven voor de T4 bacteriofaag in Chen, et al.. ¹⁴ het volgende faag versterking en DNA extractiemethode is een generalisatie voor gebruik met E. coli double-stranded DNA bacteriofagen, bijvoorbeeld, T7, T4 of L. Het uiteindelijke succes van het protocol is sterk afhankelijk van de geselecteerde host cel stam ' s vermogen om superinfectie voorwaarden te weerstaan. Als de cellen van de gastheer instabiel onder superinfectie zijn, of superinfectie nooit wordt bereikt en lysis nooit tijdens deze kritieke fase wordt bereikt, is het best om door te gaan met een confluente lysis-protocol. Dit omvat het cellulaire puin via high-speed centrifugeren en phage pillering ultracentrifugatie snelheden te scheiden. Alle volgende voorwaarden en parameters zijn bedoeld als een algemene uitgangspunt. De optimale voorwaarden voor de cellijn van een lokale host kunnen afwijken; bepalen en voldoen aan de passende voorwaarden.

1. Bereiden inoculatie cellen
   1. beënten 10 mL Luria Bertani (LB) media in een tube van 15 mL cultuur met E. coli gastheer cellen, bijvoorbeeld B of K12.
   2. Plaats in een shaker ingesteld op 250 rpm en 37 ° C. laat 's nachts groeien tot verzadiging.
2. Single-plaque, multi cycle faag groei en concentratie
   1. ter voorbereiding van een plaat van bevoegde faag plaques, warm verschillende LB-agar platen bij 37 ° C gedurende 1 uur, of 's nachts.
   2. Maak verschillende verdunningen van phage materieel (bijvoorbeeld T7, T4 of L) van bekende concentratie in LB-media, streven naar ~ 10 ² -10 ³ faag/mL.
   3. Voeg 100 µL van overnachting geconcentreerde host celgroei aan elke plaat.
   4. Kies volumes van de voorbereide faag verdunningen overeenkomt met een bereik van 10-100 faag/plaat. De vereiste hoeveelheid faag verdunningen toevoegen aan elke plaat (bijvoorbeeld, 100 µL van 10 ³ faag/mL; dit moet het produceren van ~ 100 plaques). Incubeer bij 37 ° C platen en beginnen een count-up timer (+ 0 h). Incubeer gedurende 4-5 h.
   5. Bereiden 49 mL LB media in een erlenmeyer van 250 mL en plaats in de Roteermolen, ingesteld op 250 rpm en 37 ° C.
   6. Op + 2,5 h, verdunde cellen 50 x door toevoeging van 1 mL verzadigde celkweek van overnachting groei in een voorverwarmde maatkolf met 49 mL LB medium. Zodra de cellen bereiken log groei (+ 4-5 h), meet extinctie op 600 nm (OD ₆₀₀). Bepaal de concentratie van cellen met behulp van de conversie OD ₆₀₀ van 1.0 = 8 x 10 ⁸ cellen/mL.
   7. Dilute 2 x 10 ⁷ cellen/mL met behulp van extra LB groei media. Verwijder de agarplaat met de bacteriofaag plaques van de incubator. Meteen gebruik het einde van een steriele Pipet van Pasteur te kern en een enkele plaque te verwijderen. Blazen de plaque in de verdunde cellen en Incubeer bij 37 ° C voor een extra 2 h (+ 6-7 h).
   8. Test voor volledige infectie een 500 µL door monster te nemen in een tube 1,5 mL toevoegen 10 µL chloroform (CHCL ₃) en onmiddellijk vortexing met hoge snelheid. Let op als de oplossing heeft verduidelijkt. Vroeger cellen volledig zitten septisch, Incubeer gedurende een ander 2 h (+ 8-9 h).
      Opmerking: Wanneer de cellen volledig zijn geïnfecteerd, ze zal snel lyse (< 2 min) en verduidelijking van de oplossing. Andere resultaten worden beschouwd als in de discussie sectie hieronder. De cellen zal worden superinfected, maar niet tot op dit punt zal lyse. Als lysis begint, de toevoeging van DNase en oogsten door centrifugeren moet onmiddellijk beginnen om te voorkomen dat de aantasting van de bacteriofaag.
   9. Toevoegen DNase 5 µg/mL en centrifuge cellen bij 8.000 x g bij 4 ° C tot pellet. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 10 mL van de 1 x TRIS magnesiumchloride (TM) (50 mM Tris bij pH 7,8, 10 mM MgCl ₂) buffer met 5 µg/mL DNase. Voeg 500 µL van CHCL ₃ en vortex op hoge snelheid Lyse de cellen. Verduidelijken door centrifugeren bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Decant de bovendrijvende substantie in een conische tube van 15 mL en bewaren bij 4 ° C.

2. Zuivering van Phage

Opmerking: sacharose zuivering is grotendeels afhankelijk van de grootte van de bacteriofaag. Overwegingen voor de massa van de bacteriofaag worden geïsoleerd moeten worden aangebracht en aanpassingen van de helling, mits het uitgevoerd. Laatste virale titers van meer dan 10 ¹³ faag/mL zijn gemakkelijk haalbaar met deze methode.

1. Bereiden van 5% en 45% w/v sacharose in 1 x TM buffer 12 mL.
2. Voorbereiden 4 x 5-45% sacharose verlopen door pipetting 2,5 mL van 45% sucrose in 4 ultracentrifuge buizen. Top met ~ 5 gewichtspercenten sacharose, stoppen wanneer vloeistof 2 mm van de rand van de buis bereikt 2,6 mL.
   Opmerking: Plaats het uiteinde van de pipet in contact met het oppervlak van de sacharoseoplossing en zeer langzaam afzien vloeistof. De lichtere sacharoseoplossing zal drijven op de top van zwaardere, vormen een duidelijke grens. Een goed gelaagde oplossing ~ 1 mm interface zal hebben als gehouden tegen de achtergrond licht.
3. Meng de verlopen door tilt proefbuisjes rotatie met behulp van een kleurovergang vormen instrument voor 43 s op 86° 23 rpm. Indien niet onmiddellijk nodig, bedek met paraffine film en bewaren bij 4 ° C.
4. Verwijderen 500 µL vanaf de bovenkant van elk bereid sacharose gradiënt met een 1 mL pipet en evenwicht binnen ± 0.002 g.
5. Zwembad faag schorsingen van alle buizen (stap 1.2.9). Met behulp van een pipet 1 mL, toevoegen 500 µL van de schorsing door de tip contact vloeistofoppervlak en heel langzaam het volume op de bovenkant van de helling van sacharose, voorzichtig om te mengen niet via snelle pipetteren verstrekking. Centrifugeer bij 70.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.
   Opmerking: Evenwicht de bereid verlopen naar binnen ± 0.002 g. kleinere bacteriofagen kunnen duren tot 1 h.
6. Verwijderen van de bacteriofaag bands met behulp van een steriele injectiespuit en botte canule.
   Opmerking: Wanneer van de zijkant gezien, de bacteriofaag band zal dik en melkachtig ten opzichte van de omgeving, ongeveer 5 mm in hoogte, en ligt halverwege de centrifugebuis.
   1. Submerge bot canule in de oplossing tot de tip is gecentreerd op de bovenrand van de bacteriofaag band. Verwijderen van de band door te tekenen op de plunjer van de injectiespuit tot de meerderheid van de bacteriofaag band is verwijderd.
7. De sacharose volume met de geschorste faag toevoegen aan 3-4 ultracentrifuge buizen. Voeg niet meer dan 1,5 mL/buis. Opvulling aan ~ 3-4 mm van de bovenkant van de buis met koude 1 x TM. Bedek met paraffine film en omkeren als u wilt mengen. Plaats terug in een ultracentrifuge en spin bij 145.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C aan de pellet. Kleinere bacteriofagen duurt maximaal 2 h.
8. Snel giet af het supernatant en afvoer ondersteboven op wegwerp doekjes. Veeg de binnenkant van de buis met steriele wattenstaafje te verwijderen overtollige supernatant.
9. Verdelen 200-400 µL koude 1 x TM in alle pellets en resuspendeer 's nachts bij 4 ° C; geen schudden vereist.
   Opmerking: Als de pellet niet schoon is, bijvoorbeeld stringy stukjes membraan, DNA, enz., bundelen en extra centrifugeren uit te voeren in een microcentrifuge op 17.000 x g.
10. De dag alvorens titers, bereiden een cultuur van E. coli gastheer cellen in 10 mL LB groei media en laat in een schudden incubator ingesteld op 250 rpm en 37 ° C's nachts. Incubeer de juiste hoeveelheid cultuur platen bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur alvorens titers van de bacteriofaag voorraad.
    Opmerking: Het aantal platen aan het broeden is afhankelijk van het aantal verdunningen van phage voorraad te worden bekleed: elke unieke verdunning van phage voorraad vereist twee cultuur platen (bijvoorbeeld vier verschillende verdunningen van phage materieel nodig acht cultuur platen).
11. Bereiden 100 mL top agar door 2,5 g LB en 0.6 g bacto-agar toe te voegen aan een fles van 100 mL. Los de lichamen in gedeïoniseerd water op een volume van 100 mL en autoclaaf. Na autoclaaf, langzaam omkeren de fles 6 - 8 keer tot het homogeniseren van de agar in de oplossing. Plaats de fles in waterbad van 45 ° C gedurende 15-20 minuten naar equilibreer de temperatuur .
12. Seriële verdunning van phage voorraden bij de LB oplossing bereiden.
    1. Toevoegen 990 µL LB tot en met 10 µL faag voorraad voor een 100-fold verdunning. Vortex te homogeniseren. Voor een verdunningsfactor 10, voeg 100 µL van phage voorraad aan 900 µL pond Vortex te homogeniseren.
    2. Herhaal de bovenstaande verdunningsreeks zo vaak als nodig te verkrijgen van een aftelbaar aantal plaques (10-100 platen).
       Opmerking: Om dit te bereiken, Verdun de bacteriofaag voorraad 2-3 ordes van grootte minder is dan het rendement van de verwachte bacteriofaag in termen van phage/mL reactie. Bijvoorbeeld, als een bepaalde faag voorraad 10 ¹¹ besmettelijke faag/mL bevat, de bacteriofaag voorraad plaat op een 10 ⁸-voudige of 10 ⁹-vouwen verdunning.
13. Faag titers een gebied voorbereiden door het monteren van 14 mL cultuur buizen (het aantal cultuur buisjes gelijk aan het aantal faag voorraad verdunningen te worden verguld). Plaats de verdunde faag voorraad monsters uit stap 2.12 en bacteriële cellen van de gastheer van stap 2.10 op ice.
14. Bereiden een master mix door pipetteren 5,25 mL top agar (stap 2.11), 220 µL verdund faag monsters (stap 2.12) en 50 µL host bacteriecellen (stap 2.10) aan een cultuur van 14 mL tube. Het GLB van de buis van de cultuur en de vortex op hoge snelheid.
    1. De resterende faag oplossing bewaren bij 4 ° C.
15. Twee cultuur platen (stap 2.10) ophalen uit de 37 ° C incubator. Voeg 2,5 mL voor master mix langzaam naar het midden van de eerste plaat (zonder bubbels). Zachtjes draaien de plaat met de hand om de master mix gelijkmatig verdelen zodat het omspant de hele cultuur plaat. Herhaal met de tweede plaat. Wacht 20 minuten om ervoor te zorgen de stolling van de bovenste agar. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 4-7-h.
16. Tellen de plaques en bepaal de concentratie van de bacteriofaag voor elk monster reactie.
    Opmerking: Plaques wordt weergegeven als 1-2 mm duidelijk cirkels in het ondoorzichtige tapijt van cellen van de gastheer. Zie afbeelding 1 voor representatieve resultaten. De productie van een succesvolle bacteriofaag zal resulteren in de eindconcentraties van 10 ¹² -10 ¹³ faag/mL.

3. Double-stranded DNA-extractie genoom

Opmerking: verdunning, schudden, en centrifugeren stappen moeten worden geoptimaliseerd voor het ontwikkelen van een dikke, stevige eiwit grenslaag tussen de fenol en waterige fasen. Dit leidt tot het hoogste zuiverheid genoom die vrij van verontreinigingen van de eiwitten zijn. De eerste verdunning is afhankelijk van de uiteindelijke faag titer. Een extreem hoge titer faag voorraad (≥ 10 ¹³ faag/mL) wellicht een verdunning van de 10-20-voudige vóór de extractie, terwijl lage titer voorraden (~ 10-¹⁰ -10 ¹¹ faag/mL) alleen wellicht een 2-fold of geen. Het is moeilijk om een stevige eiwit laag vormen in opeenvolgende stappen of de waterige suspensie te plakkerig te zijn werkbare vanwege de hoge concentratie van DNA is, overweeg een hogere verdunning van phage voorraden voordat u verdergaat extractie. Tijdens elke stap van genoom-behandeling, is het belangrijk met wide-boring Pipetteer tips als pipetteren een waterige fasen. Vele faag genomen zijn vrij groot en gemakkelijk gefragmenteerde via Pipetteer schuintrekken. Bovendien, elke vortexing uitdrukkelijk moet worden voorkomen, aangezien dit zal ernstig het genoom schuintrekken.

1. Een deel van phage aandelenkapitaal uit stap 2.9 tot 400 µL met 1 x TM buffer in een tube van verse 1,5 mL verdund.
2. Voeg een gelijk volume Tris:Phenol:Chloroform met de verdunning. Schud het mengsel zachtjes op een laboratorium rocker, of met de hand, voor 5 min. Centrifugeer de resulterende emulsie op 17.000 x g in een centrifuge benchtop gedurende 5-10 minuten
   Opmerking: Een overzichtelijke, witte eiwit laag op het oppervlak van de onderliggende fenol fase aanwezig is.
3. Verwijderen de bovenste waterfase aan een nieuwe buis verzorgen niet te verstoren de interfase grens.
4. Herhaal stappen 3.2-3.3 een extra 2 keer voor een totaal van 3 fenol extracties. De waterfase overbrengen in een verse buis en voeg een gelijk volume CHCl ₃. Schudden en centrifugeren (stap 3.2). De waterige DNA-monster overbrengen in een schone buis.
5. Raming van de omvang van de gezuiverde DNA. Voeg 0.4 volumes van 3 M Natriumacetaat (CH ₃ COONa) en 3 volumes van 95% ethanol (EtOH). Plaats in de vriezer-20 ° C voor overnachting neerslag. Centrifuge op 17.000 x g in een benchtop Centrifugeer gedurende 10-15 min.
   Opmerking: Het DNA zal onmiddellijk uitdrogen en zichtbaar als een massa in de suspensie in de buis. De juiste resulterende pellet is wit en goed verpakt tegen de onderkant van de buis.
6. Verwijderen en verwijder het supernatant door decanteren of pipetteren. Voeg 500 µL 70% EtOH en zachtjes schudden de buis totdat de pellet gratis vanaf de onderkant van de buis drijft. Centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 5 min. verwijderen en negeren EtOH, verzorgen niet verstoren de pellet.
7. Herhaal stap 3.6. Lucht drogen de pellet op benchtop voor 30-60 min. toevoegen 50 µL ddH ₂ O aan de pellet en incubeer gedurende 1 h op RT of overnacht bij 4 ° C tot resuspendeer. Bepaal de concentratie van de DNA met behulp van absorptie metingen op 280 nm.
   Opmerking: De verwachte concentraties zijn 0,5-5 µg/µL met behulp van deze techniek. Delen door het totale genomic moleculaire gewicht om te bepalen van de concentratie van de uiteindelijke genoom.

4. Cel-gratis Phage reactie en Phage Titer Experiment

1. voorbereiden 25 g LB medium en 15 g bacto-agar solid, giet in een 1 L-fles en Voeg gedeïoniseerd water toe tot 1 L. autoclaaf.
2. Na sterilisatie, omkeren de fles langzaam 6 - 8 keer het verzorgen om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen. De fles inversie zal het homogeniseren van de agar vaste in de 1 L oplossing. Plaats de fles in een waterbad van 58 ° C gedurende 20 minuten vóór de verstrekking op cultuur platen.
3. Zodra de temperatuur van de LB-agar-oplossing heeft geëquilibreerd, bereiden een vlam naast de platen van de cultuur te steriliseren van het milieu in de buurt van de open cultuur platen. Houd de fles 1 L in het waterbad te voorkomen van stollen van agar terwijl het maken van de aliquots. Voeg 25 mL in een 100 x 15 mm cultuur plaat. 1 L zal produceren 40 cultuur platen.
4. Opzij van de ene cultuur plaat en laat stollen gedurende ten minste 1 uur op RT; deze plaat zal worden gebruikt voor de cellen van de gastheer plating. Laat de andere 39 cultuur platen stollen voor 2 dagen op RT. Store bij 4 ° C of direct te gebruiken voor het maken van titers.
5. Plaat de cellen van de gastheer door de juiste bacteriële stam (bijvoorbeeld host strepen B voor T7) die is opgeslagen bij-80 ° C, op LB-agar cultuur bord. Streep naast een open vuur te voorkomen van verontreiniging van het milieu. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C. De cellen van de gastheer hebben geen resistentie tegen antibiotica dus werken in een steriele omgeving essentieel.
6. Cel-vrije reactie
   Opmerking: De cel-vrije TXTL reacties zijn samengesteld uit 33% ruwe E. coli extract (8.9-9,9 mg/mL eiwit) met de overige 67% bestaat uit reactie buffer en phage genoom. Het ruwe extract is bedoeld als eerder beschreven ^{15 , 16}. Laatste reactie voorwaarden zijn: 8,9-9,9 mg/mL eiwitten (uit ruwe extract), 3-6 mM Mg-glutamaat, 40-100 mM K-glutamaat, 2-4% PEG 8000, 3-4 mM van elk aminozuur, bereid als hierboven beschreven ¹⁷, en een energie mix, beschreven oplossing eerder ¹⁵, samengesteld uit 0,33-3,33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1.5 mM ATP en GTP, 0,9 mM CTP en UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA 0.33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 0.068 mM folinic zuur, spermidine van 1 mM en 30 mM 3-PGA. DNA-type bacteriofagen vereisen genoom concentraties van 0,5-10 nM en RNA-type bacteriofagen een bereik van 50-150 nM. Laatste reactie concentraties zijn uniek voor de bepaalde faag gesynthetiseerd en zal binnen de marges vallen zoals hierboven beschreven. Voor optimale oxygenatie van de reacties moet de uiteindelijke reactie volumes tussen µL van 10-20. Er zijn kleine variaties in het protocol van de reactie, die afhankelijk van de vorm van de genomic molecule zijn. Bijvoorbeeld, vereisen lineaire genoom moleculen extra materiaal in de reactie voor de remming van de spijsvertering van lineaire DNA stukken door het recBCD enzym aanwezig in het ruwe extract.
   1. Voltooid de " reactie details " sectie in tabel 1 (PhageTXTL_JOVE) door het invoeren van het totale aantal reacties en eindvolume van reactie.
   2. Ontwerp het experiment door de vaststelling van de onderdelen van de constante en variabele componenten van de reactie. Voer het fractionele volumepercentage van de master mix, dat de verhouding van het totale volume van de componenten van de constante reactie aan het product van de uiteindelijke reactie volume en het aantal monsters is. Voer de voorraad en de eindconcentraties van de reagentia van de reactie in de " Master Mix reactie recept " sectie in PhageTXTL_JOVE. Voer de voorraad en de eindconcentraties van de variabele reagent(s) te beproeven.
      Opmerking: De volumes van de onderdelen van de reactie zal automatisch worden berekend op basis van het volume van de master mix en het eindvolume van elke individuele reactie.
   3. Verwijderen de benodigde hoeveelheid buizen (aangegeven de " buizen te ontdooien " sectie van PhageTXTL_JOVE.xlsx) van het ruwe cel extract, buffer energiemix, en aminozuur mix van-20 ° C of -80 ° C en dooi op ice.
      Opmerking: Eenmaal ontdooid, combineren meerdere aliquots van als onderdelen (indien nodig).
   4. Aliquot de aangegeven hoeveelheid ruwe extract, 33% van de uiteindelijke reactie volume, in een buis microcentrifuge.
   5. Bereiden de master mix volgens tabel 1. Meng alle onderdelen onder " Master Mix reactie recept " door vortexing. Het juiste volume van elke component toevoegen aan het ruwe extract.
   6. Als werken met een bacteriofaag met lineaire DNA-genoom (bijvoorbeeld T7) 1 µM van het eiwit gam van bacteriofaag lambda aan de reactie ¹¹ toevoegen. Vortex Meng de oplossing, en de reactie op het ijs gedurende 5 minuten. Dit remt de spijsvertering van de lineaire DNA stukken door het recBCD complex, die endogeen in het ruwe extract is.
   7. Na het toevoegen van de laatste component volgens tabel 1, meng de reactie door vortexing. Splitsen van de master mix in n microcentrifuge buizen.
      Opmerking: Het volume van elke split is het product van het volumepercentage fractionele master mix en het uiteindelijke volume van de reactie. Bijvoorbeeld, voor een fractionele master mix volumepercentage van 90% en het volume van de uiteindelijke reactie van 12 µL, het volume van elke splitsing is 10,8 µL.
   8. De aangegeven volumes van de variabele componenten toevoegen aan de basispagina mix-matrix (Zie tabel 1). Voeg water toe tot elke reactie op het bereiken van het gewenste uiteindelijke reactie volume. Meng elke reactie door vortexing. Incubeer de buizen van de microcentrifuge bij 29 ° C gedurende ten minste 8 uur of 's nachts.
7. Pre cultuur van de cel van de host
   Opmerking: de overnachting pre cultuur is verdunde 50: 1 om ervoor te zorgen dat de cellen van de gastheer gebruikt voor de titer experiment in de mid log-fase, die verhoogt de efficiëntie van de infectie. De mid log cellen worden vervolgens opnieuw geconcentreerd door 10-fold en opgeslagen op ijs.
   1. Met behulp van een steriele Pipetteer tip, een cultuur-tube van 5 mL LB met 3-5 gezonde gastheer cel kolonies beënten. Werk naast een open vuur om verontreiniging te voorkomen.
   2. Broeden de buis van de cultuur in een schudden incubator bij 37 ° C en 250 rpm voor 16 h of 's nachts. Cellen verzadiging fase kunnen bereiken door de volgende dag.
8. Host cel cultuur en sample voorbereiding faag titer
   1. afzien van 50 mL LB in een conische kolf van 500 mL en dek met aluminiumfolie. Verwarm de destillatiekolf bij 37 ° C gedurende 20 minuten
   2. De host overnachting pre celcultuur in de voorverwarmde pond Incubeer gedurende 3-4 uur bij 37 ° C en schudden bij 250 omwentelingen per minuut aliquoot 1 mL.
   3. Centrifuge de cultuur van de cel van het host 50 mL voor 10 min op 5000 x g. negeren de pond
   4. Resuspendeer de pellet met koud (4 ° C) 5 mL LB en houden op ice.
   5. Een uur voordat de titer experiment, Incubeer de platen van de cultuur bij 37 ° C.
      Opmerking: Elke unieke faag reactie (en bijbehorende verdunningsfactor) zal gebruik maken van twee platen. Bovendien, incubeer 4 platen voor experimentele besturingselementen (Zie afbeelding 1 voor representatieve positieve en negatieve controles).
   6. Bereiden 100 mL top agar (stap 2.11).
9. Maak een seriële verdunning van de cel-vrije reactie met LB oplossing als beschreven in punt 2.12.
10. Phage titer
    Opmerking: Beginnen te plaat na cultuur gerechten hebben gedurende ten minste 1 uur geïncubeerd en de bovenste agar in het waterbad van 45 ° C gedurende 15-20 minuten na verwijdering van de autoclaaf was.
    1. Titer de laatste cel-gratis reactie-LB oplossing zoals beschreven in sectie 2, stappen 2.14-2.16.

Resultaten

Laten we vier representatieve resultaten. In Figuur 1, presenteren wij een aantal negatieve controles om ervoor te zorgen dat de TXTL cel-vrij systeem en de phage DNA voorraden niet worden verontreinigd met levende cellen van E. coli . Wij verifiëren dat de TXTL cel-vrij systeem vrij van intact E. coli is cel besmetting door plating beide een leegte van genomic DNA (Figuur 1A en

Discussie

Na de techniek in Chen, et al.. ¹⁴ voor SPMC, een cruciale stap is bij het bepalen van de juiste voorwaarden voor superinfectie bereikt. De parameter waarmee een host-stam kunnen weerstaan superinfectie nauwst is vaak de beginconcentratie van de bacteriofaag infecteren. De gastheer cellen moeten in logaritmische groeifase vóór eerste infectie met een zeer kleine hoeveelheid phage. Uiteindelijk, de bacteriofaag logaritmische groei ook zullen bereiken en het doel is dat de nummers van de ba...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ultracentrifugation tubes	Beckman Coulter	344057
Conical tubes	Falcon	352070
Gradient maker	BioComp Gradient Master	zie Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula	Monoject	8881513918 en 888202017
Wide-bore pipette tips	Fischerbrand	02-707-134
Plaque counter	New Brunswik Scientific	Colony Counter Model C-110
Culture tubes	Fischerbrand	14-961-33
Cell-free system	Mycroarray Inc	Mytxtl
BioComp Gradient Master	BioComp Instruments	Model 105ME
LB agar plate recipe			25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents productnummer BP1426) en 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson en Company - productnummer 214010).