Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe geurstoffen met lage volatiliteit voor single-sensillum-opname van Drosophila- olfactorische receptorneuronen kunnen optreden die reageren op lang-keten-cutulaire feromonen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Insecten vertrouwen op hun reukzin om een breed scala aan gedragingen te leiden die kritisch zijn voor hun overleving, zoals voedselzoekende, roofdier vermijding, ovipositie en paring. Veelvoudige chemische stoffen met wisselende volatiliteiten zijn geïdentificeerd als natuurlijke geurstoffen die insectenolfactor Receptor Neurons (ORN's) activeren. Het bestuderen van de geurfactorische reacties op luchtspuiten met een laag volatiliteit is echter belemmerd door een onvermogen om dergelijke stimuli effectief aan te bieden door gebruik te maken van conventionele reukafleveringsmethoden. Hier beschrijven we een procedure die de effectieve presentatie van geurstoffen met een lage vluchtigheid toelaat voor in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Door de afstand tussen de geurbron en het doelweefsel te minimaliseren, kan deze methode de toepassing van biologisch opvallende maar tot nu toe ontoegankelijke geurstoffen, waaronder palmitoolzuur, een stimulerende feromoon met een aangetoond effect op ORN's die betrokken zijn bij het hof en het paren gedrag 1 .Onze procedure biedt dus een nieuwe weg om een gastheer van lage-vluchtige geurstoffen te analyseren voor het bestuderen van insuline- en feromooncommunicatie.
Inleiding
Drosophila ORNs reageren op een groot aantal geurstoffen, met veel uiteenlopende koolstofketenslengten en een verscheidenheid aan functionele groepen, waaronder esters, alcoholen, ketonen, lactonen, aldehyden, terpenen, organische zuren, aminen, zwavelverbindingen, heterocyclische verbindingen en aromaten 2 , 3 . Geurstoffen die gevarieerd zijn in hun fysisch-chemische eigenschappen kunnen opmerkelijk verschillende volatiliteiten hebben, aangegeven door de dampdruk van de verbinding. Met name, biologisch relevante geurstoffen voor Drosophila melanogaster verschillen enorm in hun volati....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de hardware voor at4 opname
- Gebruik een pipettrekinstrument om elektroden voor te bereiden met aluminosilicaatglas capillairen (OD 1.0 mm, ID 0.64 mm). Knop het uiteinde van de referentieelektrode lichtjes aan met een paar fijne tangen om de invoeging in de clypeus van de vlieg te vergemakkelijken ( dwz een afgeronde plaat aan de voorzijde van de vliegkop boven de monddelen).
OPMERKING: In deze studie werden 7-jarige WT-mannen (Berlijn) gebruikt. Gebruik AHL-zoutoplossing 14 als de elektrolyt voor beide elektroden. - Bereid 1 liter AHL door het mengen van 900 ml gedestilleerd water met 6,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Onze techniek werd succesvol toegepast om de relatieve werkzaamheid van de trans ( Figuur 5A ) versus cis ( Figuur 5B ) isomeren van palmitoolzuur te bepalen. De representatieve gegevens tonen aan dat trans -palmitoleic zuur een effectievere ligand voor Or47b ORNs vergeleken met het cis-isovorm (figuur 5C). Een enkele neuron werd geregistreerd van elke vlieg, met .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een procedure waarbij de reacties van Or47b ORNs op palmitolezuur robuust kunnen worden geïnduceerd en opgenomen. Wij hebben een conventionele methode voor afgifte van lange afstand geur 2 , 7 , 10 aangepast om het probleem van onvoldoende feromoongeurstofafgifte te oplossen. We hebben de kwestie van vluchtige luikantilatiteit aangepakt door de verbinding via geurpatronen te leveren, waarvan de opening binne.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Ye Zhang voor de hulp met de voorbeeldsporen en Tin Ki Tsang voor de hulp met de foto's. Dit werk werd ondersteund door een Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award en een NIH-subsidie (R01DC015519) aan C.-YS en NIH subsidies (R01DC009597 en R01DK092640) aan JWW
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Prep Setup & Diverse Materialen | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA | P97 | Pipette Puller |
| Borosiliekaatglas Capillaire | World Precision Instruments Sarasota FL USA | 1B100F-4 | om holding rods te maken |
| Aluminosiliekaatglas Capillaire | Sutter Instruments Novato CA USA | AF100-64-10 | om elektroden te maken |
| Superfrost Microscoopglazen | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA | 12-550-143 | voor vlieg-prep station |
| Permanent Dubbelzijdige Tape | Scotch St. Paul MN USA | NA | voor vlieg-prep station |
| Staande microscoop | Olympus Shinjuku Tokyo Japan | BX51 | voor opname rig |
| Plastalina modelklei | Van Aken North Charleston SC USA | B0019QZMQQ | voor prep station en om de holding rod te stabiliseren |
| Rapid-Flow steriele wegwerpfiltereenheid met SFCA-membraan, 0,45 mm | Nalgene Rochester NY USA | #156-4045 | om AHL-oplossing te steriliseren |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Cartridge Materialen | |||
| 200 µL pipettetip | VWR Radnor PA USA | 53508-810 | om geurcartridges en vlieg-prep te maken |
| Filterpapier | Whatman Maidstone Kent UK | 740-E | om geurcartridges te maken |
| Vacuum Droogkast | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA | VX-06514-30 | om ethanol op te lossen |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Geurmaterialen | |||
| cis-palmitoleic zuur | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA | #10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b geur |
| trans-palmitoleic zuur | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA | #9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b geur |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA | E1028-500MLGL | om palmitoleic zuur te verdunnen |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Rig Setup Materialen | |||
| Geurcartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA | MX130R | om de olfactometer te positioneren |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA | FLOWVISIONSC | software om de stroomsnelheid te regelen |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA | MC-2SLPM-D | om de stroomsnelheid voor bevochtigde lucht te regelen |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA | MC-500SCCM-D | om de stroomsnelheid voor geuropwekkende stimulatie te regelen |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA | Ver. 10.4 | Data-acquisitiesoftware |
| Luchttoevoerbuis | Ace Glass Vineland NJ USA | 8802-936 | om bevochtigde lucht te leveren |
| 50X objectieflens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan | LMPLFL50X | opname rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA | Ver. 10.4 | software voor spike-analyse |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA | Ver. 6.37 | software voor gegevensanalyse |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA | NPIEXB-AUDIS-08B | Rapporteert akoestisch individuele spikes |
| Extracellulaire Versterker | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA | NPIEXT-02F | om de amplitude van elektrische signalen te verhogen |
| Ventilatie Controller | Warner Instruments | VC-8 | om de opening van de klep voor geuropwekkende stimulatie te regelen |
| Opname Elektrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA | MP-285 | om opname elektrode te positioneren |
| Headstage Versterker | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA | EQ-16.0008 | om de amplitude van elektrische signalen te verhogen |
| Oscilloscoop | Tektronix Beaverton OR USA | TDS2000C | Visueel rapport van individuele spikes |
Referenties
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
