Oplosbaarheid van hydrofobe bestanddelen in waterige oplossing met behulp van combinaties van het zelf monteren van Peptide en aminozuur

Summary

Dit protocol beschrijft een klinisch-middelen uit het oplossen van de hydrofobe bestanddelen in een waterige omgeving met behulp van combinaties van het zelf monteren van peptide en aminozuur oplossingen. Onze methode is opgelost een belangrijke beperking van hydrofobe therapeutics, die veilig en efficiënt vervoermiddel oplosbaarheid en levering methoden in klinische instellingen.

Abstract

Zelfassemblerende peptiden (SAPs) zijn veelbelovend voertuigen voor de levering van hydrofobe therapeutics voor klinische toepassingen; de eigenschappen van hun amphipathic laten ontbinden hydrofobe bestanddelen in het waterige milieu van het menselijk lichaam. Zelfassemblerende peptide oplossingen hebben echter slechte bloed compatibiliteit (b.v., lage osmolariteit), belemmeren hun klinische toepassing via intraveneuze overheidsdiensten. We hebben onlangs een veralgemeende platform ontwikkeld voor hydrofobe drug delivery, die sappen met aminozuur oplossingen (SAP-AA combineert) te verbeteren van de drug oplosbaarheid en formulering osmolariteit te bereiken van de eisen voor klinische toepassingen te verhogen. Deze formulering strategie werd grondig getest in het kader van drie structureel verschillende hydrofobe verbindingen – PP2, rottlerin en curcumine-om aan te tonen van de veelzijdigheid. Bovendien, we onderzocht effecten van formulering onderdelen wijzigen door het analyseren van 6 verschillende sappen, 20 natuurlijk bestaande aminozuren bij lage en hoge concentraties, en twee verschillende co oplosmiddelen dimethylsulfoxide (DMSO) en ethanol. Onze strategie bleek effectief in het optimaliseren van onderdelen voor een bepaalde hydrofobe drug en therapeutische functie van de geformuleerde remmer, PP2, werd waargenomen, zowel in vitro als in vivo. Dit manuscript schetst onze algemene formulering-methode met behulp van SAP-AA combinaties voor hydrofobe verbindingen, en analyse van oplosbaarheid als een eerste stap naar potentiële gebruik van deze formuleringen in meer functionele studies. Wij omvatten van representatieve oplosbaarheid resultaten voor de formulering van de hydrofobe samengestelde, curcumine, en bespreken hoe onze methodologie fungeert als een platform voor toekomstige biologische studies en ziekte modellen.

Introduction

Sappen zijn een klasse van biomaterialen die uitgebreid als 3D steigers in regeneratieve geneeskunde^1,,^2,,^3,4zijn bestudeerd. Meer recentelijk echter, hebben ze benut als voertuigen voor de levering van therapeutics vanwege hun unieke biologische eigenschappen^5,6,7,8. Sappen natuurlijk samenvoegen tot stabiele nanostructuren⁹, waardoor een middel van drug inkapselen en bescherming. Sappen zijn amphipathic, bestaat uit een specifiek patroon van hydrofobe en hydrofiele aminozuur wordt herhaald, rijden hun zelf-assemblage^9,10 en het toestaan van hen om te dienen als een medium tussen hydrofobe en hydrofiele omgevingen. Bijgevolg voor de klinische levering van hydrofobe medicijnen – die hebben extreem lage biologische beschikbaarheid en de opname in het lichaam door gebrek aan oplosbaarheid in waterige omgevingen^11,12 -sappen zijn veelbelovend als een levering voertuig. Bovendien, hun volgorde patroon ook impliceert dat SAPs rationeel kunnen worden ontworpen en gebouwd om te maximaliseren van de compatibiliteit met een bepaalde drug of samengestelde (dat wil zeggen, op basis van functionele groepen) en oplosbaarheid maar ook verdere assistentie.

Sappen zijn toegepast als effectieve drug leverende voertuigen in vele in vitro en in vivo instellingen^13,14,15,16. Zij hebben ook aangetoond grote veiligheid en biocompatibiliteit. Echter, als gevolg van lage osmolariteit van SAP-drugs preparaten, ze niet worden gebruikt voor intraveneuze injecties in klinische instellingen¹³. Gezien deze terughoudendheid, hebben we onlangs een strategie die sappen met aminozuur oplossingen combineert om het gebruik van giftige co oplosmiddelen en verhoging van de osmolariteit van de formulering, ontwikkeld en daarom klinische relevantie. We kiest om te gebruiken aminozuren zijn de bouwstenen van sappen, zijn al klinisch geaccepteerde, en in combinatie met sappen, ze hydrofobe drug oplosbaarheid verhogen terwijl het verminderen van de hoeveelheid SAP vereist^17,18.

We hebben onderzocht SAP-AA combinaties als een veralgemeende platform voor hydrofobe drug oplosbaarheid en latere levering door een pijpleiding scriptingregel screening te maken en toe te passen op de Src-remmer, PP2, als een model hydrofobe compound. In dit proces onderzochten we het effect van het wijzigen van de onderdelen van de formulering-uiteindelijk testen 6 verschillende sappen, alle 20 aminozuren op 2 verschillende concentraties (laag en hoog, laag gebaseerd op concentraties in bestaande klinische toepassingen, en hoge concentraties waren 2 x, 3 x of 5 x de klinische concentratie op basis van de maximale oplosbaarheid van elk aminozuur in water), en 2 verschillende co oplosmiddelen – en geselecteerde combinaties die ontbindend PP2 voor verdere analyse. De formulering van deze drug bewezen effectief als een drug leveringsvoertuig in celkweek, evenals in vivo modellen met behulp van zowel intratracheale en intraveneuze overheidsdiensten. Ook onze werkzaamheden aangeraakt op de veelzijdigheid van SAP-AA combinaties in solubilizing meerdere, structureel-verschillende hydrofobe bestanddelen in waterige omgevingen; in het bijzonder de drugs rottlerin en curcumine¹⁸. Dit manuscript schetst de SAP-AA formulering methode en de analyse van curcumine oplosbaarheid als een voorbeeld van de primaire stap in onze screening-pijplijn. Dit protocol biedt een eenvoudige, reproduceerbare manier naar scherm voor de optimale combinaties van de SAP-AA, die los van een bepaalde hydrofobe verbinding.

Protocol

1. bereiding van de oplossingen van de Amino Acid

1. voorbereiden en label twee 50 mL conische centrifuge buizen voor elk aminozuur (een voor elk voor beide " lage " en " hoge " concentraties).
2. Bereiden een grote 2 L kolf met gezuiverde water (18.2 MΩ·cm bij 25 ° C).
3. Berekent het bedrag van elk aminozuur (in gram) te bereiken van de gewenste concentraties, en de juiste hoeveelheid aminozuur wegen in hun respectieve 50 mL centrifuge buizen met behulp van een spatel.
   Opmerking: Voor de " hoge " concentratie van de twee negatief geladen aminozuren, PBS wordt gebruikt in plaats van water. We kunnen niet hun concentraties als gevolg van hun oplosbaarheid in laag water, en het gebruik van PBS in plaats van water helpt om de lage pH verhogen. Bovendien werden de berekeningen van de concentratie verkregen met behulp van een eindvolume van 40 mL voor elke aminozuur-oplossing. Alle aminozuur concentraties zijn beschreven in tabel 3. Zorg ervoor dat te spoelen van de spatel tussen aminozuren om verontreiniging te voorkomen. Het is raadzaam een water spoelen, gevolgd door af te vegen met 70% ethanol.
4. Voeg toe 40 mL van gezuiverd water (of PBS) in elke 50 mL-buis met behulp van een precisiepipet serologische. Cap buizen en vortex of schud krachtig tot het is opgelost. Water bad ultrasoonapparaat (kamertemperatuur, 130 W, 40 kHz) kan ook worden gebruikt om te helpen in het proces van de oplosbaarheid.
   Opmerking: De volgende aminozuur oplossingen zijn gevoelig voor licht en moet worden bedekt met aluminiumfolie: tryptofaan, fenylalanine, en tyrosine (die bestaan uit aromatische ring-achtige structuren) en cysteïne (reactieve - SH groeperen).

2. Bereiding van de oplossingen van SAP-AA

1. bereiden 20 mL Scintillatie flesjes voor het het zelf samenstellen van peptiden. Voor een bepaalde zelfassemblerende peptide, bereiden een flesje per bereid aminozuur oplossing (elke combinatie zal worden gemaakt in een aparte flesje).
2. Met behulp van een hoge prestaties analytische balans (met een leesbaarheid tot 0.1 mg of minder), wegen ongeveer 1 ± 0,2 mg van peptide in de bodem van elke flacon. Na het wegen van het GLB en het exacte gewicht van de peptide op de cap.
3. Het juiste volume van aminozuur oplossing (bereid in afdeling 1) Pipetteer in elke flacon met peptide, om te komen tot de gewenste concentratie van het zelf monteren van peptide (0,1 mg/mL voor lange peptides met een lengte van 16 aminozuren, of 0,2 mg/mL voor Kortere peptides met een lengte van 8 aminozuren).
4. Sonicate gedurende 10 minuten in een water bad ultrasoonapparaat (130 W, 40 kHz) bij kamertemperatuur, ervoor te zorgen de oplossingen binnen de flesjes worden volledig ondergedompeld in het waterbad.

3. Voorbereiding van Drug-DMSO of Drug-Ethanol voorraad oplossingen

1. combineren 1 mg van drug (in dit geval, curcumine met 100% DMSO), en een ander 1 mg met 100% ethanol maken twee stamoplossingen.
   Opmerking: We toegevoegd 200 µL van DMSO en 400 µL ethanol te maken van DMSO-curcumine en ethanol-curcumine voorraden die 5 mg/mL en 2,5 mg/mL, respectievelijk als gevolg van verschillende oplosbaarheid in elke oplosmiddel werden; het is echter belangrijk op te merken dat de concentratie van de voorraad moet worden aangepast afhankelijk van de hydrofobe drug van belang. Factoren zoals drug oplosbaarheid en effectieve biologische concentratie zijn belangrijk bij het bepalen van deze waarde. Ook, houd er rekening mee dat de voorraad zal worden verdund 100-fold en 50-fold in DMSO en ethanol formuleringen, respectievelijk, in combinatie met SAP-AA oplossingen (zie punt 4). Het kan zijn voorkeur voor te bereiden van een groter volume van voorraad afhankelijk van het aantal formuleringen vereist – in dit geval meer dan 1 mg drug zou worden gebruikt. De voorraad kan worden achtergelaten bij-20 ° C; dooi op ijs en vortex vóór gebruik.
2. Vortex flesjes voor 15 s tot volledig los van de drug.

4. Voorbereiding van drugs formuleringen

1. voorbereiden duidelijk, 1,5 mL microcentrifuge buizen voor elke formulering. Zorg ervoor dat u label buizen met de beoogde zelf monteren peptide, aminozuur (en concentratie), en co-solvent.
2. Voeg toe 10 µL van Drug-DMSO voorraad of 20 µL Drug-Ethanol voorraad buizen van passende microcentrifuge.
3. Toevoegen 990 µL van SAP-AA zure oplossingen naar de juiste label microcentrifuge buizen met Drug-DMSO voorraad en 980 µL naar scripts die Drug-Ethanol voorraad. Dit levert 1 mL drugs formuleringen met 1% DMSO of 2% ethanol.
   Opmerking: De uiteindelijke concentratie van alle curcumine formuleringen was 0,5 mg/mL volgens het protocol. Nogmaals, dit zal variëren wanneer met behulp van andere hydrofobe verbindingen en/of beginnen met een verschillende voorraad concentratie (zie stap 3.1)
4. Vortex krachtig gedurende 30 s en toestaan van formuleringen te rusten voor 30 min.

5. Oplosbaarheid testen

1. na de rusttijd, vortex krachtig nogmaals voor 30 s.
2. Centrifugeer de formuleringen bij 14,220 x g gedurende 1 min.
3. Analyseren van de onderkant van de microcentrifuge-buizen voor neerslag (door visualisatie).

Results

Voor de hydrofobe drug, curcumine, geproduceerd we formuleringen met behulp van alle 20 bestaande natuurlijk aminozuren in lage concentraties, in combinatie met slechts één SAP, EAK16-II, als een bewijs-van-principe. We testten ook formuleringen met behulp van DMSO zowel ethanol als co oplosmiddelen. In totaal produceerde dit 40 curcumine formuleringen, elk met verschillende onderdelen. Het is belangrijk op te merken dat we onze eerdere studies met behulp van de Src-remmer, PP2, meer opti...

Discussion

In de formulering procedure zijn er verschillende kritische stappen en punten te overwegen bij het oplossen. Ten eerste, als we met diverse componenten en concentraties werken, meerdere vortex stappen in het gehele protocol zorgen ervoor dat alle concentraties uniforme en correcte. Enkele van de oplossingen van de hoge-concentratie, hydrofoob aminozuur kan nog niet worden volledig ontbonden na vortexing, en in dit geval, zij krachtig kunnen worden geschud met de hand om te helpen in het proces. Ook is het essentieel dat ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EAK16-I	CanPeptide Inc.	Aangepast peptide	Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylering en C-terminus amidering, >95% puur door HPLC
EAK16-II	CanPeptide Inc.	Aangepast peptide	Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylering en C-terminus amidering, >95% puur door HPLC
EAK16-IV	CanPeptide Inc.	Aangepast peptide	Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylering en C-terminus amidering, >95% puur door HPLC
EFK8-II	CanPeptide Inc.	Aangepast peptide	Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylering en C-terminus amidering, >95% puur door HPLC
A6KE	CanPeptide Inc.	Aangepast peptide	Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylering en C-terminus amidering, >95% puur door HPLC
P6KE	CanPeptide Inc.	Aangepast peptide	Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylering en C-terminus amidering, >95% puur door HPLC
Alanine	Sigma-Aldrich	A7469-100G	L-Alanine
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I7403-100G	L-Isoleucine
Leucine	Sigma-Aldrich	L8912-100G	L-Leucine
Methionine	Sigma-Aldrich	M5308-100G	L-Methionine
Proline	Sigma-Aldrich	P5607-100G	L-Proline
Valine	Sigma-Aldrich	V0513-100G	L-Valine
Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P5482-100G	L-Phenylalanine
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941-100G	L-Tryptophan
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T8566-100G	L-Tyrosine
Glycine	Sigma-Aldrich	G8790-100G	L-Glycine
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159-100G	L-Asparagine
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540-100G	L-Glutamine
Serine	Sigma-Aldrich	A7219-100G	L-Serine
Threonine	Sigma-Aldrich	T8441-100G	L-Threonine
Histidine	Sigma-Aldrich	H6034-100G	L-Histidine
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-100G	L-Lysine
Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-100G	L-Arginine
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G	L-Aspartic Acid
Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G8415-100G	L-Glutamic Acid
Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-100G	L-Cysteine
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	DMSO
Ethanol	Sigma-Aldrich	277649-100ML	Anhydrous
Curcumin	Sigma-Aldrich	08511-10MG	Hydrofobe drug, curcumin
Rottlerin	EMD Millipore	557370-10MG	Hydrofobe drug, rottlerin
PP2	Enzo	BML-EI297-0001	Hydrofobe drug, PP2
Scintillatievialen	VWR	2650-66022-081	Borosiliculaatglas, met schroefdop, 20 mL. Vialen voor het wegen van peptide.
Falcon 50 mL Conische Centrifugatiebuizen	VWR	352070	Polypropyleen, steriele, 50 mL. Voor aminozuuroplossingen.