Method Article

Volume segmentatie en analyse van biologische materialen met behulp van de SuRVoS (Super regio Volume segmentatie) Workbench

DOI:

10.3791/56162

⸱

August 23rd, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Science Division, Harwell Science and Innovation Campus, Diamond Light Source, 2School of Computer Science, University of Nottingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Segmentatie van driedimensionale gegevens uit vele beeldvormingstechnieken is een grote knelpunt in de analyse van complexe biologische systemen. Hier beschrijven we het gebruik van SuRVoS Workbench tot semi-automatisch segment volumetrische gegevens op verschillende lengte-schalen voorbeeld datasets van cryo-Elektronentomografie, cryo zachte X-ray tomografie en fase contrast X-ray tomografie technieken gebruiken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Segmentatie is het proces van het isoleren van de specifieke regio's of objecten binnen een verbeelde volume, zodat verdere studie kan worden ondernomen op deze gebieden van belang. Bij het overwegen van de analyse van complexe biologische systemen, is de segmentatie van de drie-dimensionale afbeeldingsgegevens een tijdrovend en arbeid intensieve stap. Met de toegenomen beschikbaarheid van vele beeldvormende modaliteiten en met geautomatiseerde gegevens inzamelingssystemen vormt dit een grotere uitdaging voor de moderne experimentele bioloog verplaatsen van gegevens naar kennis. Deze publicatie beschrijft het gebruik van SuRVoS Workbench, een programma dat is ontworpen om deze kwesties door middel van methoden tot semi-automatisch segment complexe biologische volumetrische gegevens. Drie datasets van verschillende vergroting en imaging modaliteiten worden hier gepresenteerd elk markeren van de verschillende strategieën voor het uitvoeren van de segmentactie met SuRVoS. Fase contrast X-ray tomografie (microCT) van de fruiting body van een plant wordt gebruikt om aan te tonen met behulp van model opleiding segmentatie, cryo Elektronentomografie (cryoET) van menselijke bloedplaatjes wordt gebruikt om aan te tonen met behulp van super - megavoxels, en cryo zachte segmentatie X-Ray tomografie (cryoSXT) van een regel van zoogdiercellen wordt gebruikt om aan te tonen van het label splitsen van hulpmiddelen. Strategieën en parameters voor elk gegevenstype worden ook gepresenteerd. Door een selectie van semi-automatische processen in een enkele interactieve tool te mengen, biedt SuRVoS verschillende voordelen. Over het geheel genomen wordt tijd om volumetrische segmentgegevens verminderd met een factor vijf in vergelijking met handmatige segmentatie, een steunpilaar in vele afbeeldingsvelden voor verwerking. Dit is een aanzienlijke besparingen wanneer volledig handmatige segmentatie weken van inspanning nemen kunt. Subjectiviteit is bovendien gericht door middel van computationeel vastgestelde grenzen, en verdelende complexe verzamelingen van objecten door hun berekende eigenschappen in plaats van op een case-by-case basis.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De SuRVoS-Workbench is een stuk software ontworpen om onderzoekers wetenschappelijk relevant om informatie te extraheren uit volumetrische gegevens van verschillende monsters, ongeacht de structuur van belang, de resolutie of de imaging modaliteit1, 2. Volumetrische gegevens zoals deze worden vaak verzameld met behulp van systemen voor X-ray of electron tomografie, routinematig gebaseerd op grote laboratoria of gecentraliseerde faciliteiten vanwege hun complexiteit. Zowel van deze methoden, en andere technieken, produceren grote informatie rijke datasets die bewijzen uitdagend om segment met beide semi-automatische methoden of handmatig. In het bijzonder vereisen in de buurt van-native staat cryo-geïmmobiliseerd datasets lage dosis imaging voorwaarden, wat resulteert in een lage signaal-/ ruisverhouding en slechte contrast, vooral in cryo electron tomografie (cryoET)3,,4,5 . Een bijkomende factor in sommige 3D datasets is de aanwezigheid van artefacten geïntroduceerd door de uitdagende proefomstandigheden betrokken, bijvoorbeeld kantelen ontbrekende wig artefacten als gevolg van het verzamelen van gegevens over een beperkt bereik, wat resulteert in ontbrekende informatie en rek in de richting van de lichtbundel3,4,5. Zelfs wanneer lage signal-to-noise of ontbrekende wig artefacten zijn niet problematisch (bijvoorbeeld gericht ion beam SEM6 of seriële blok geconfronteerd met SEM7), de complexiteit en de driedimensionale aard van het monster, en de grote hoeveelheid gegevens betekenen analyse nog steeds profiteren van een geautomatiseerd proces voor gegevens segmentatie.

Op dit moment bij het overwegen van biologische hoeveelheid cellen, zijn er vele opties voor het automatisch of halfautomatisch omlijning zeer specifieke cellulaire, zoals actine, microtubuli of specifieke eiwitcomplexen, met behulp van een sjabloon gebaseerde zoeken, of omlijning in specifieke soorten datasets (bijvoorbeeld hoge contrast, bevlekt, hars-embedded monsters)8,9,10,11,12. In deze gevallen een priori zijn informatie of specifieke monster voorbereiding protocollen echter noodzakelijk, beperking van de brede toepasbaarheid van deze segmentatie-strategieën. Er zijn ook hulpmiddelen beschikbaar die model opleiding op het niveau van de voxel om te leren van het uiterlijk van de verschillende structuren van belang indien hiervoor gegeven user input13uitvoeren. Op dit niveau kunnen de complexiteit van de opleiding en het testen van de modellen echter vergissing-geneigd en rekenkundig duur. Gezien de uitdagende omstandigheden van de afbeelding en het gebrek aan breed toepasbare, semi-automatische segmentatie strategieën, is handmatige segmentatie gebruikelijk, zelfs wanneer u werkt met complexe biologische materialen14,15, 16 , 17. het wordt echter algemeen aanvaard dat het proces van handmatige segmentatie niet alleen tijdrovend, maar ook vergissing-geneigd, subjectieve en variabele4,5,18,19 is ,20. Sommige programma's van segmentatie bieden tools om te verlichten de segmentering van de handmatige proces (dat wil zeggen interpolatie, lasso of klap tools)21,22, in gevallen van luidruchtige datasets, ze zijn echter moeilijk toe te passen met succes, en zelfs wanneer ze worden gebruikt met succes, is het proces nog steeds subjectief en variabele.

Van oudsher, segmentaties hebben gebruikt op twee verschillende manieren: kwalitatief of kwantitatief opzicht. Naarmate beeldtechnologieën en segmentatie strategieën te verbeteren, is het geworden gemeenschappelijkere eigenschappenstijl segmentatie als een kwantitatieve hulpmiddel biologische vragen te beantwoorden en als een "grond truth" algoritme ontwikkeling8,12, 15,23,24,25. Om dit te doen, moeten gedetailleerde checks & balances om variabiliteit en subjectiviteit gedurende het proces26te verlagen. Echter verhogen deze voorzorgsmaatregelen verder de tijdrovende aard van segmentatie. Vanwege dit is het van cruciaal belang om te zorgen voor een snellere en minder variabele segmentatie-strategie.

De SuRVoS-Workbench begint deze kwesties door de gebruiker te voorzien van een selectie van machinaal leren en beeldprocessing tools die de gebruiker bij het proces van segmentatie, helpen terwijl ook begeleiden de gebruiker door de vereiste stappen. Om dit te bereiken, zijn de twee belangrijkste innovaties samen geïmplementeerd in SuRVoS. Ten eerste, gebruikt het een super regio hiërarchie aan groep soortgelijke, nabijgelegen regio's van de gegevens op basis van hun intrinsieke eigenschappen. Elk van de regio's in de hiërarchie vertegenwoordigt hetzelfde volume met behulp van minder elementen, terwijl nog steeds de naleving van de sterke grens. Dus, Super regio's verminderen van de complexiteit van het segmenteren van een volume door verschillende ordes van grootte, maar vormen nog steeds de gegevens zonder een significant verlies van informatie27. Ten tweede, biedt SuRVoS een semi-automatische segmentatie-strategie die gebruikmaakt van minimale handmatige segmentatie ingangen te trainen classificaties, die vervolgens gebruikt worden om het segment van de resterende volume28,29. Deze strategie vermindert handmatige segmentatie, sterk verminderen van de hoeveelheid tijd besteed aan het uitvoeren van de segmentactie en bij het gebruik van Super-regio's, verwijdert u handmatig afbakening van de grenzen, potentieel vermindering van variabiliteit en subjectiviteit.

Een ander belangrijk kenmerk van SuRVoS is de knop Label Splitter, waarbij een gebruiker een reeks al gesegmenteerde objecten op basis van hun intrinsieke eigenschappen kunt classificeren. Na de segmentatie van objecten van belang, deze tool kan worden gebruikt om de set onderverdelen in subklassen gebaseerd op maatregelen zoals de gemiddelde object intensiteit, variantie, grootte, locatie, etc. dit is handig wanneer grote groepen objecten waarbij de indeling hoge complexiteit. Bijvoorbeeld, een groep van cellulaire organellen kan worden gesplitst in de mitochondriën, lege blaasjes, lipide druppels, enz.; of een reeks van materiaal insluitsels kunnen worden gescheiden op basis van grootte of vorm. Zodra de afzonderlijke etiketten gesegmenteerd kan splitsen in groepen met behulp van een willekeurig aantal classificaties, vermindering van identificatie bias.

De SuRVoS-Workbench is met succes gebruikt om gesegmenteerde gegevens van verschillende beeldvormingstechnieken. Hier, wordt synchrotron X-ray fase contrast tomografie (microCT) van de fruiting body van een plant gebruikt om aan te tonen van de segmentatiover het gebruik van model opleiding, cryo Elektronentomografie (cryoET) van menselijke bloedplaatjes wordt gebruikt om aan te tonen van segmentatie, met behulp van super- en megavoxels en cryo zachte X-ray tomografie (cryoSXT) van een regel van zoogdiercellen wordt gebruikt om aan te tonen van het label splitsen tools

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: over het algemeen nuttig reeksen van parameters voor elke stap van de verwerking en de specifieke parameters voor elk gegevenstype hieronder vindt u in tabel 1.

1. voorbereiden van een werkruimte en laden gegevens

  1. lanceren SuRVoS Workbench, klik op de knop open dataset, en in de daaruit voortvloeiende popup-venster, selecteer het gegevensbestand worden gesegmenteerd. Kies een passende oriëntatie van de dataset. Vervolgens kies of maak een map waar de werkruimte en de bijbehorende bestanden moeten worden opgeslagen. Het wordt aanbevolen dat deze map leeg is bij het starten van een nieuwe segmentatie. Nadat de gegevens is geladen, de workbench wordt geopend met de Plugins deelvenster aan de linkerkant, het deelvenster visualisatie aan de rechterkant en een set gereedschap sneltoetsen tussen de twee deelvensters ( Figuur 1).

2. Voorbewerken en gegevensvertegenwoordiging

  1. In the Selecteer ROI tabblad input het x, y en z-begin en einde coördinaten voor de regio van belang en klik op toevoegen. Om te kiezen van de juiste y en x wanneer coördinaten de muisaanwijzer op een punt op het beeld. Kies z-coördinaten met behulp van de schuifregelaar boven aan het deelvenster visualisatie. Zodra een regio is toegevoegd, Controleer of dat het is ingeschakeld door het controleren van het vak aan de rechterkant. Alle downstream berekeningen worden uitgevoerd op het geselecteerde gebied. In het algemeen, te beginnen met een klein, representatief regio van belang (ROI), optimaliseren van de parameters en het vervolgens opnieuw toe te passen deze parameters op het gehele gebied te worden gesegmenteerd wordt geadviseerd.
  2. In de functie kanalen tabblad, gebruik het drop-down menu kies een functie/filter en het aan de wachtrij toevoegen boven (zie bespreking voor meer info over functie kanalen). Zodra een functie/filter is toegevoegd en geselecteerd door te klikken op de naam, het wijzigen van opties die specifiek zijn voor de functie/filter en kies de input dataset waarvoor wilt uitvoeren van de functie/filter. Zodra alle opties hebt gekozen, klikt u op het vakje rechts van de naam van de functie/filter te berekenen.
    1. Voor het optimaliseren van de parameters voor een nieuwe dataset, meerdere filters/functies toevoegen en kies de parameters voor hen, voordat wordt berekend in volgorde, de ene na de andere. Om dit te doen, toevoegen van elke nieuwe filterfunctie en selecteren van de juiste parameters, vinkt u het vakje links van elk filter/onderdeel moet worden uitgevoerd en klik op het vak compute functies boven aan het deelvenster. Discussie Zie voor extra informatie.

3. Genereren van passende Super regio

  1. In the Super Regions tabblad in de sectie Supervoxels kunt de bron drop-down menu Selecteer de gefilterde dataset die supervoxels wordt gemaakt. Geef vervolgens de vorm, de afstand en de compactheid van de supervoxels (zie discussie en Figuur 2 voor meer details). Tenslotte, klik op de knop toepassen voor het genereren van de supervoxels. Zodra de supervoxels zijn gemaakt ze kunnen worden weergegeven in het deelvenster visualisatie, ingeschakeld of uitgeschakeld en hun transparantie gecontroleerd in de visualisatie tabblad en Viewer venster binnenweg.
  2. In de Super regio's tabblad in de sectie Megavoxels gebruiken de bron drop-down menu om te Selecteer de gefilterde dataset die megavoxels wordt gemaakt. Volgende, geef de lambda, numBins en Gamma parameters van de megavoxels (zie bespreking voor nadere bijzonderheden). Zodra de megavoxels zijn gemaakt ze kunnen worden weergegeven in het deelvenster visualisatie, ingeschakeld of uitgeschakeld en hun transparantie gecontroleerd in de visualisatie tabblad en Viewer venster binnenweg.

4. Inleiding tot de aantekening

  1. In de aantekeningen-tab gebruik de knop niveau toevoegen om toe te voegen een niveau van de aantekening. Nadat een niveau heeft toegevoegd, de Label toevoegen knop gebruiken in dat niveau om een label voor de aantekening toevoegen. Zodra toegevoegd, de naam en de kleur van het etiket kunnen worden gewijzigd voor het gemak van aantekening.
  2. Om te beginnen annoteren, selecteer vervolgens het pen-pictogram van de sectie van de tool snelkoppeling. Als deze optie is geselecteerd verschijnen een aantal opties boven aan het deelvenster visualisatie. Deze opties bepalen de penbreedte en of voxels, supervoxels of megavoxels wordt gebruikt om aantekeningen te voorzien.
    1. Met het oog op model opleiding, in het algemeen, selecteer supervoxels in de aantekening niveau drop-down box en een middelmatig tot grote penbreedte moet worden gebruikt. Selecteer in het tabblad aantekeningen, het label door het controleren van het vak aan de rechterkant van de labelgegevens van aantekeningen worden voorzien. Klik vervolgens in het deelvenster visualisatie te annoteren van een interne supervoxel, of klik en sleep om te veel aantekeningen.
      Opmerking: Voxels en megavoxels kunnen worden geselecteerd in het vak van de vervolgkeuzelijst aantekening niveau en gebruikt om aantekeningen op dezelfde manier, die, in het geval van megavoxels, vele duizenden van soortgelijke voxels kunnen te worden gesegmenteerd met een enkele klik van de muis te.

5. Segmentatie met behulp van Model opleiding aangetoond met een microCT dataset.

Opmerking: de eerste segmentatie voor vele datasets is te onderscheiden van meerdere grote regio's van elkaar. Bijvoorbeeld, het scheiden van de kern van het cytoplasma of de cel uit de externe structuur van ijs en ondersteuning. Voor dit type van segmentatie, met duidelijk afgebakende grenzen en grote gebieden, is model opleiding handig. Ter demonstratie X-ray fase contrast tomografische gegevens van Goosegrass zullen gebruikt worden.

  1. De gegevens laden, voorbehandelen met behulp van de filter en functie suite en bepalen van passende supervoxels en/of megavoxels zoals beschreven in de bovenstaande secties met behulp van de parameters van tabel 1 als een gids. Ongeveer sommige grote gebieden van de dataset, blijven gebruiken van de parameters van tabel 1 en de instructies in hoofdstuk 4, aantekeningen, zoals afgebeeld in Figuur 3.
    Opmerking: De dataset hoeft niet te worden op dit punt volledig gesegmenteerd.
  2. In the Model Training tabblad de predict niveau instelt op het niveau dat de handleiding opleiding aantekeningen bevat, en in de "descriptor" sectie stelt u de regio op Supervoxels. Selecteer vervolgens de descriptoren die worden gebruikt om te onderscheiden regio's van de gegevens door te klikken op de vervolgkeuzelijst van bronnen selecteren en controleren van de vakken van de eigenschappen en filters van keuze (Zie tabel 1 en discussie).
  3. Klik vervolgens op de knop predict. Nadat de berekening is voltooid, zal het deelvenster Visualization worden bijgewerkt met de voorspellingen voor elk van de niet-label voxels waaruit blijkt welke van de aantekening klassen dat ze zijn voorspeld te behoren tot. In het algemeen de standaardparameters voor elke classificatie methodologie vormen een goed uitgangspunt, en de gebruiker moet alleen hoeft te schakelen tussen classificaties te vinden van een goede pasvorm. Voor deskundige en ervaren gebruikers de opties voor elke classificatie zijn echter beschikbaar en kunnen worden gewijzigd.
  4. Na beoordeling van het effect van de trainingsmethoden en een te kiezen, gelden extra verfijning door te klikken op de verfijnen vervolgkeuzelijst in de sectie verfijning. At de bodem van de Model-opleiding tab, in de " Update aantekeningen " afdeling, ervoor te zorgen dat de visualisatie drop-down menu is ingesteld op PredictioNS. Gebruik de schuifregelaar vertrouwen toewijzen min of meer van de unannotated supervoxels aan de geselecteerde aantekening etiketten.
  5. Nadat een passend niveau van vertrouwen is geselecteerd gebaseerd op visuele inspectie, gebruik de opslaan-knoppen naast de etiketten aan de onderkant van het gereedschap vertrouwen om op te slaan van de voorspellingen in specifieke etiketten. Het deelvenster visualisatie wordt bijgewerkt met de wijzigingen worden weergegeven. Elk etiket afzonderlijk kan worden opgeslagen, en inderdaad, etiketten kunnen worden gered van kleinere subregio's door te klikken op de knop Opslaan voor elk etiket en het invoeren van waarden in de van en naar z, y en x dozen.
  6. Adres kleine beleidseenheden verdere opleiding door gegevens te verstrekken zoals beschreven in sectie 4. Nadat de juiste voorspellingen worden toegevoegd aan etiketten, herhaal het proces voor model training met verfijning en hoge vertrouwen voorspellingen toevoegen totdat er niet meer zijn ongelabelde supervoxels. Dit is effectief omdat telkens het opleidingsproces model draait er meer supervoxels om te trainen met zijn toegewezen, en vandaar het proces wordt meer robuust als de iteraties toenemen.

6. Segmentatie, met behulp van Super-regio's, aangetoond met een CryoET Dataset.

Opmerking: aangezien Super regio segmentatie is nuttig voor kleinere, discreet afhankelijke gebieden, de nadruk ligt hier zullen over segmentatie van de organellen en microtubuli binnen deze dataset. Model opleiding gewend was snel segment de bloedplaatjes van het ijs van de achtergrond en de koolstof; deze parameters zijn niet verder besproken, maar zijn opgenomen in tabel 1.

  1. De gegevens laden, voorbehandelen met behulp van de filter en functie suite en bepalen van passende supervoxels en/of megavoxels zoals beschreven in de bovenstaande secties met behulp van de parameters van tabel 1 als een gids.
  2. Toevoegen passende niveaus en etiketten naar de aantekeningen-tab, selecteer een label en beginnen annoteren met behulp van een middelmatige breedte pen met supervoxels geselecteerd. Wees bewust van de noodzaak om te kiezen van verschillende labels voor objecten dicht bij elkaar om te voorkomen dat de etikettering van hen als een enkel object.
  3. Om het schoonmaken van de aantekeningen verder, morfologische verfijning methoden (dilatatie, erosie, openen, sluiten en vul gaten) gebruiken. Deze opties vindt u onder aan het tabblad aantekeningen. Selecteer om ze te gebruiken, de segmentatie label en verfijning. Voer een straal waarde en kies het toepassen van de verfijning. Klik vervolgens op verfijnen.

7. Indeling en analyse van Data objecten gebaseerd op inherente kenmerken, aangetoond met een CryoSXT Dataset

Opmerking: over het algemeen, is de volgende stap na segmentatie analyse van de gegevens. De knop label splitter in SuRVoS voorziet in de classificatie van gesegmenteerde objecten met behulp van regels op basis van de intrinsieke eigenschappen van de objecten, zoals gemiddelde object intensiteit, variantie, volume of positie. De knop label statistieken zorgt voor de visualisatie van de relaties tussen deze maatregelen voor elke nieuwe objectklasse. Dit zijn krachtige nieuwe hulpmiddelen voor het analyseren van complexe 3D datasets na segmentatie.

  1. De gegevens laden, voorbehandelen met behulp van de filter en functie suite, bepalen van de juiste supervoxels en/of segment zoals beschreven in de bovenstaande secties met behulp van de parameters van tabel 1 als een gids en megavoxels.
  2. Na segmentatie, klik op het tweede tabblad van het deelvenster Visualization genaamd Label Splitter. Dit zal een nieuw gebied toevoegen aan de rechterkant van het venster - het deelvenster regels.
  3. Op de top van dit gebied, selecteer een passend niveau en etiketten voor het splitsen van het etiket. Selecteer vervolgens de dataset opvragen en klik op Label. Alle objecten in de geselecteerde labels zullen nu worden aangegeven in blauw als afzonderlijke objecten in het deelvenster visualisatie en een plot weergegeven: de gemiddelde intensiteit van de objecten wordt weergegeven in het deelvenster regels. Als u wilt wijzigen de maatregel wordt getoond in de plot, klik op de drop-down box aan de bovenkant van de rechterkant.
  4. Om te beginnen te splitsen van de objecten in de relevante klassen, klikt u op nieuwe label aan de onderkant van het deelvenster regels toevoegen. De naam en de kleur die is verbonden met dit nieuwe label kunnen worden gewijzigd, zoals eerder is beschreven.
    1. Klik op Voeg nieuwe regel en met behulp van de drop-down en vrije invoervakken definiëren de regel worden toegepast. Klik op toepassen als u wilt zien welk effect de nieuwe regel in het deelvenster visualisatie en het plot in het deelvenster regels. Meerdere regels kunnen worden toegepast op een enkel etiket en meerdere labels kunnen worden gemaakt binnen de dezelfde dataset.
      Opmerking: Om te verzamelen alle labelloze objecten, een nieuw label maken en in plaats van een regel toe te voegen, klikt u op Selecteer anderen.
  5. Wanneer de objecten van belang zijn gesplitst naar nieuwe labels, maakt u een nieuwe, lege niveau in het tabblad aantekeningen. Vervolgens kies dit niveau in de regel creatie tabblad en klik op Opslaan etiketten. Dit bespaart de nieuwe etiketten tot dit lege niveau.
  6. Aan de rand van het deelvenster visualisatie, klik op het tabblad Label statistieken. Hiermee opent u een nieuwe visualisatie deelvenster dat kan worden gebruikt om te beginnen te begrijpen van relaties tussen objectklassen in de gegevens. Aan de top, een passend niveau en etiketten en de dataset aan query te selecteren.
    1. Selecteer een paar van de maatregelen van belang door het controleren van de vakken ernaast. Klik vervolgens op Label. Dit zal produceren paarsgewijze vergelijking percelen voor elk van de geselecteerde maatregelen. Om bij te werken van de percelen, selecteer of deselecteer passende maatregelen en klik op Update perceel.

8. Exporteren van gegevens en segmentaties

  1. de percelen en de ruwe meetgegevens exporteren door te klikken op exporteren plot en gegevens exporteren, respectievelijk in het Label statistieken tabblad van het deelvenster Visualization.
  2. Worden de afbeeldingsgegevens en segmentaties exporteren door te klikken op het tabblad Export in het deelvenster Plugins. Eerst, klik op een map waar de gegevens worden opgeslagen. Selecteer vervolgens de output (onbewerkte gegevens, ruwe aantekeningen, segmentatie maskers of gemaskerde gegevens) en de indeling (HDF5, MRC of TIFF). Ten slotte selecteert u de aantekening niveau (s) worden geëxporteerd met behulp van de selectievakjes uit en klik op exporteren. De gegevens kunnen worden geschaald en ondersteboven vóór het exporteren indien nodig. Als u de gemaskerde gegevens exporteert, de dataset die de mask(s) zal worden toegepast op kan worden geselecteerd gebruikend een drop-down menu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drie volume datasets verzameld uit drie verschillende technieken (microCT, cryoET en cryoSXT) werden gebruikt om aan te tonen van de drie belangrijke kenmerken van SuRVoS Workbench: Model opleiding, Super regio segmentatie en het splitsen van het etiket. De datasets vertegenwoordigen een diverse groep van experimentele resultaten, voor elk van die volledige verwerkingsparameters worden geleverd (tabel 1).

Om aan te tonen model training met behulp van SuRVoS Workbench, werd een dataset relatief hoog contrast met de regio grenzen definiëren gekozen. Deze dataset van de vrucht van Kleefkruidof goosegrass, werd verzameld met behulp van X-ray fase contrast tomografie op de I13-2 Diamond-Manchester Imaging Beamline op Diamond lichtbron, Chilton, Oxfordshire, Verenigd Koninkrijk. Het vers monster was gemonteerd in lucht op een goniometer basis op de top van de rotatie-fase, op een afstand van de monster-detector van 30 mm. blootstelling tijden waren 0.10 s met de roze balk spectrum die een gemiddelde energie van ongeveer 22 heeft keV. Projecties werden verzameld door middel van 180° met een stap grootte van 0,1 °. Tomografische reconstructies werden uitgevoerd met behulp van Savu30,,31 met de Paganin filter voor vermeerdering gebaseerde fase contrast beelden32 gevolgd door wederopbouw van de gefilterde terug projectie in de ASTRA toolkit33 , 34. deze gegevens vervolgens werd ingekrompen met 2 x 2 x 2 weggooien als u wilt de bestandsgrootte verkleinen voordat de SuRVoS Workbench wordt ingevoerd.

Ten eerste, de invoergegevens (figuur 3A) werd gefilterd en geklemd (bovenste en onderste om intensiteitswaarden te verwijderen in de gegevens) (figuur 3B). Op deze manier de achtergrond en voorgrond werden gemaakt gemakkelijker te onderscheiden en de textuur van de interne structuur van de vrucht is geaccentueerd. Vervolgens werden de supervoxels gebouwd op de top van de gefilterde dataset (Figuur 3 c). Om te beoordelen van de kwaliteit van de supervoxels, hingen ze zonder de gegevens te controleren dat de relevante gegevens van de dataset waren goed vertegenwoordigd door de supervoxels (afbeelding 3D). Volgende, handmatige aantekeningen met behulp van de supervoxels werden verstrekt als trainingsgegevens op drie segmenten van het volume (figuur 3E, donkere kleuren). Deze trainingsgegevens volstond om te trainen van de classificatie te voorspellen (lichte kleuren) de gebieden die overeenkomt met de achtergrond (groen), vruchten bristle (rood), zaad materiaal (paars), en de omliggende vlees (blauw). Morfologische verfijningen werden gebruikt om schoon te maken de segmentaties door vullen gaten, groeien of krimpen als nodig (figuur 3F). De totale tijd besteed om te bepalen van de juiste parameters en segmenteren van deze dataset was 2 h.

Om aan te tonen van Super regio segmentatie, met behulp van SuRVoS Workbench, werd een luidruchtig en complexe dataset15gekozen. Deze dataset werd verzameld met behulp van cryoET aan het National Center voor macromoleculaire denkbaar ter Baylor College of Medicine, Houston, TX USA. Bloedplaatjes waren kort, duik bevroren op gloed geloosd en gouden fiducial behandeld een koolstof TEM rasters. Tilt serie werden verzameld uit ±65 ° met een toename van 2°. De tilt-serie werd vervolgens gereconstrueerd met behulp van gewogen terug projectie in de IMOD35.

Na het laden van de gegevens in SuRVoS (figuur 4A), een regio van belang werd geselecteerd en een geschikte filter set werd toegepast. In dit geval werd een smoothing Gaussiaans filter, gevolgd door een totale variatie-filter met het contrast geklemd gebruikt om te accentueren de randen en de texturen van de gegevens (figuur 4B). Vervolgens werd model opleiding met minimale supervoxel gebaseerde gebruikersinvoer gebruikt om het segment van de bloedplaatjes van de achtergrond ijs en koolstof. Vervolgens werd semi-hand segmentatie met megavoxels en supervoxels gebruikt om het segment van de organellen. Ten slotte, de supervoxel-parameter source werd veranderd in een zwakkere denoising filter en supervoxel vorm kleiner (Zie tabel 1) werd gemaakt om beter behouden de microtubuli grenzen voor segmentatie (figuur 4C). Voor zowel de organellen en de microtubuli, snelle handmatige aantekeningen werden gebruikt elke 5-10 segmenten te selecteren van de supervoxels die het beschrijven van de kenmerken van belang (Figuur 4 d & 4E). De totale tijd besteed om te bepalen van de juiste parameters en segmenteren van de regio van belang gepresenteerd was 6 h.

Om aan te tonen label splitsen met behulp van SuRVoS Workbench, werd een dataset met vele, gevarieerde organellen gekozen. Deze dataset werd verzameld met behulp van cryoSXT op beamline B24 op Diamond lichtbron, Chilton, Oxfordshire, Verenigd Koninkrijk-36. Kort, HEK293 cellen werden gekweekt op gouden finder rasters, gepaste afmetingen gouden fiducials werden toegevoegd en de grid was duik bevroren een EM met rug-zijdige bevlekken. Tilt serie werden vervolgens verzameld op een Microscoop van ±65 ° met een 0.5° increment. De tilt-serie werd vervolgens gereconstrueerd met behulp van gewogen terug projectie in de IMOD35.

Na het laden van de gegevens in SuRVoS (figuur 5A), een regio van belang werd geselecteerd en een juiste totale variatie filter werd gebruikt om de grenzen van de organellen in het volume (figuur 5B). Vervolgens waren organellen semi-manually gesegmenteerd met behulp van megavoxels en supervoxels, en vervolgens verfijnd met opvulling gaten, sluiten en dilatatie randen (figuur 5C) vloeiend. De totale tijd voor het bepalen van de juiste parameters en segment van de regio van belang gepresenteerd was 4 h. Zodra de segmentatie was afgerond, werd de Label Splitter gebruikt om elke organel visualiseren als een object in de dataset (figuur 5D) en verschillende kenmerken over elk object in de plot van de gegevens (figuur 5E). De Label Splitter-interface is interactief, de kleur die is verbonden met elke nieuwe label klasse in zowel de visualisatie en de plot gegevens bijwerken. Dit zorgt voor de oprichting van verschillende regels op basis van de kenmerken die inherent zijn aan de gegevens die kunnen worden gebruikt om te scheiden van de objecten in nuttige klassen (figuur 5F).

figure-results-1
Figuur 1. De lay-out en de algemene kenmerken van SuRVoS Workbench.
De GUI-interface is aan de linkerkant, terwijl de visualisatie-deelvenster aan de rechterkant is. Deze twee gebieden worden gescheiden door een kolom met gereedschappen en snelkoppelingen. De GUI is gerangschikt te lopen van de gebruiker via de belangrijkste stappen in het voorbewerken van de gegevens, supervoxel en/of megavoxel parameters, kiezen de gegevens te segmenteren en indien nodig met behulp van model opleiding, voorafgaand aan de segmentaties exporteren. Het deelvenster visualisatie kan in drie modi worden gebruikt: fundamentele visualisatie en segmentatie om de gegevens te bekijkenen een filters hebt toegepast en de gegevens in segmenten label splitter te categoriseren van objecten in de nieuwe labels op basis van aspecten die inherent zijn aan de gegevens, en ten slotte label statistieken om te meten en visualiseren van de kenmerken van de gesegmenteerde objecten. Voor elk van deze modi, het drop-down menu in de top links hoek besturingselementen die gegevens wordt weergegeven, en de schuifregelaar aan de bovenkant bepaalt u de z-as. De Tool snelkoppelingen biedt gemakkelijke toegangscontrole over contrast, de doorzichtigheid van de lagen, zoomen, pannen en terug te keren naar "huis" in de visualisatie deelvenster, en de opening hulpmiddelen voor aantekening zoals beschreven in het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2. Super regio hiërarchie vermindert complexiteit van beeldsegmentatie.
Een afbeelding uit de Berkeley segmentatie Dataset (BSDS50037) werd gebruikt om aan te tonen van de eigenschappen en effecten van Super regio's. De oorspronkelijke afbeelding (links) bestaat uit duizenden voxels, die vervolgens wordt verzameld in een aangrenzende, soortgelijke subgroepen te maken van een paar honderd supervoxels (midden). Supervoxels kunnen ook worden verzameld in een aangrenzende, soortgelijke subgroepen maken enkele tientallen megavoxels (rechts). Met elke groepering daalt de complexiteit van de taak van de segmentatie, voor zowel de handmatige als de computationele middelen. Nog belangrijker is, een 2D voorbeeld hier wordt getoond, zowel supervoxels als megavoxels zijn echter 3D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3. Verwerking van een microCT Dataset met behulp van een Model opleidingsstrategie segmentatie.
A. een enkel 2D sneetje van de ruwe gegevens. B. een geklemd totale variatie filter toepassen op de ruwe gegevens verbeterd de grenzen tussen de verschillende aspecten van de fruiting body. C. passende supervoxel parameters werden gekozen. D. een regio van belang (rode doos in C) wordt weergegeven om aan te tonen dat de grenzen van de gegevens in de supervoxels zelf aanwezig zijn. E. drie segmenten van het volume met handmatige annotaties van verschillende gebieden van de dataset weergegeven in donkere kleuren (groen, rood, blauw en paars) en voorspellingen na het uitvoeren van de model opleiding weergegeven in dezelfde lichte kleuren. F. de dezelfde drie segmenten met de definitieve segmentatie nadat de opleiding modelvoorspellingen hebben aanvaard. Schaal bars zijn 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4. Verwerking van een cryoET Dataset met behulp van een super regio segmentatie strategie.
A. een enkel 2D sneetje van de ruwe gegevens. B. een regio van belang (rode doos a) met een set van de gelaagde filter toegepast om te accentueren de grenzen van de organellen. C. voorbeeld van aantekeningen maken een organel met behulp van Super-regio's. Een enkele organel getoond met supervoxels bedekt met de handmatige gebruiker aantekening weergegeven in zwart (links) en de supervoxels gekozen met die aantekening weergegeven in blauw (rechts). D. voorbeeld van aantekeningen maken een microtubulus met behulp van Super-regio's. Een enkele regio van microtubulus wordt weergegeven met de handmatige gebruiker aantekening weergegeven in zwart (links) en de supervoxels gekozen met die aantekening in het groen (rechts) weergegeven. E. de definitieve segmentatie met de bloedplaatjes gesegmenteerd van de achtergrond met behulp van model opleiding (zie tabel 1 voor details), diverse organellen en microtubuli gesegmenteerd met behulp van een super regio segmentatie strategie. Kleuren doen niet geven aan specifieke organel typen als ze hier voor indeling worden weergegeven. Bars in schaal A, B en E zijn 1 μm en in C en D zijn 0,5 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-5
Figuur 5. Analyse van een cryoSXT Dataset met het symbool Label Splitter.
A. een enkel 2D sneetje van de ruwe gegevens. B. een regio van belang (rode doos a) met een totale variatie filter om te accentueren de organellen. C. de definitieve segmentatie met supervoxels bedekt. D. De visualisatie gedeelte van de label splitter met de organellen ingedeeld aan de hand van de regels in Fweergegeven. E. het perceel gedeelte van de label-splitter weergeven van de gemiddelde intensiteit binnen elk object, met de regels weergegeven in F toegepast. Elke verticale lijn langs de x-as een afzonderlijk object en kleurgecodeerde overeenkomt met de klasse die is toegewezen aan is. F. de regels van de classificatie van het voorbeeld om te scheiden van de verschillende objecten op basis van hun intrinsieke eigenschappen. Schaal bars zijn 1 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Naam / DatasetBronP1P2P3P4
Gaussiaans FilterSigma
Assortiment / standaard-[0.5, 10] / 1
(G1) cryoETOnbewerkte gegevens1
CryoET (G2)Onbewerkte gegevens2
Totale variatieLambdaAfstand# IterKlem
Assortiment / standaard-[0.1, 30] / 10[0.1, 10] / 1[50, 500] / 100-
(TV1)-microCTOnbewerkte gegevens101100(1,-)
(TV2) cryoETG171200-
(TV3) cryoETG2101100-
(TV4) cryoSXROnbewerkte gegevens71100-
DrempelmethodeVminVmax
Assortiment / standaard
(TH1)-cryoET TV3 0 - Gauss centreren Sigma Assortiment / standaard - [0.5, 10] / 2 (GC1) microCT TV1 2 Gauss normalisatie Sigma Assortiment / standaard - [0.5, 10] / 2 (GN1) microCT TV1 2 Laplaciaan van de Gaussiaan Sigma Propageren Reactie Assortiment / standaard - [0.5, 10] / 2 [Ja/Nee] / Nee [Bright/Dark] / helder (LG1) microCT TV1 2 No Helder Verschil van Gaussians Sigma Init Sigma verhouding Assortiment / standaard - [0.5, 10] / 2 [1.1, 3] / 1.6 (DG1) microCT TV1 2 1.6 (DG2) cryoET TV3 2 1.6 Det. structuur Tensor Sigma1 Sigma gebied Assortiment / standaard - [0.5, 10] / 2 [0.5, 10] / 2 (ST1) cryoET TV3 2 2 Supervoxels Vorm Afstand Compactheid Assortiment / standaard - [1, 10] / 10 [0,1, 5] / 1 [1, 200] / 20 (SV1) microCT TV1 (10, 10, 10) (1, 1, 1) 30 (SV2) cryoET TV3 (10, 10, 10) (1, 1, 1) 50 (SV3) cryoET TV2 (3, 5, 5) (1, 1, 1) 50 (SV4) cryoSXT TV4 (10, 10, 10) (1, 1, 1) 30 Megavoxels Lambda # Opslaglocaties Gamma Assortiment / standaard - [0.01, 1] / 0.1 [10, 200] / 20 Geen auto of [0, 1] / geen (MV1) cryoET SV2 0.1 50 Auto TV1 CryoSXT (MV2) SV4 0.4 50 Geen TV4 Model opleiding Regio Classificatie Verfijning Beschikbaar / standaard [voxel / supervoxel] [Ensembles, SVM, Online lineaire modellen] / [Geen, Potts, uiterlijk] / uiterlijk Ensemble - RF microCT TV3 SV1 Willekeurige Forest: Uiterlijk TH1 GC1 -# Boom: -Lambda: GN1 [10-, 100] / 100 [1, 500] / 10 LG1 100 50 DG1 cryoET TV2 DG2 ST1 SV2 Willekeurige Forest: Uiterlijk -# Boom: -Lambda: [10-, 100] / 100 [1, 500] / 10 100 50 Aantekening verfijning Straal Assortiment / standaard [1, 20] / 1 microCT Opening 5 Opvulling-Holes 1 Dilatatie 2 cryoET Opening 3 Opvulling-Holes 1 Dilatatie 2 cryoSXT Opening 3 Opvulling-Holes 1 Dilatatie 2

Tabel 1. Geoptimaliseerde Parameters gebruikt voor het verwerken van elk van de drie Datasets (microCT, cryoET en cryoSXT).>
Voor elke parameter worden een algemene doel bereik en standaard gegeven. In veel gevallen, wordt de gefilterde gegevens gebruikt als een bron voor downstream processing. In deze gevallen is een afkorting gebruikt ter aanduiding van de nieuwe bron dataset. Bijvoorbeeld, G1 (de Gaussiaanse gefilterde cryoET ruwe gegevens) werd gebruikt als input tijdens een totale variatie filter maken van TV2. Informatie is alleen bedoeld voor aspecten van de werkbank die werden gebruikt voor het verwerken van elke dataset. Bijvoorbeeld, Model opleiding niet werd gebruikt tijdens de verwerking van de dataset van de cryoSXT die hier gepresenteerd, dus geen parameters worden gegeven voor dit.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SuRVoS Workbench verschilt van andere programma's van segmentatie optimalisatie van parameters is een noodzakelijke en belangrijke stap vóór het begin van de werkelijke segmentatie. In sommige programma's handmatig of semi-handmatig segmentatie begint de gebruiker segmenteren binnen ogenblikken na het openen van een nieuw project. Met SuRVoS, omdat grote hoeveelheden van het volume zal worden gesegmenteerd met zeer weinig gebruikersinvoer en grenzen zijn afgebakend door het programma, is het optimaliseren van de parameters cruciaal voor een succesvolle segmentatie. In het bijzonder zijn functie kanalen en Super regio gebouw twee gebieden waar de aandacht moet worden besteed.

Functie kanalen en model opleiding

Naast de ruwe data kan SuRVoS de gebruiker aanvullende datasets of kanalen die zijn afgeleid van een bestaande dataset te maken. Deze kanalen kunnen worden gemaakt met behulp van een selectie van computationele methoden of functie extractors. Elk van de vertegenwoordigingen van de gegevens zijn beschikbaar in parallel en afzonderlijk kan worden weergegeven om te beoordelen van de resultaten van de functie of filter toepassing. Vanwege deze kenmerken, worden ze aangeduid als functie kanalen in SuRVoS. Er zijn vele functie Kanaalopties binnen SuRVoS verstrekt. Voor informatie over de opties en parameters die hier worden gebruikt, Zie tabel 1, voor een volledige lijst en beschrijving van de beschikbare functie kanalen bezoek https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ 2. Eerste, lawaaierige datasets profiteert van denoising met de Gaussian of totaal variatie filter. Het is aanbevolen dat verdere functie kanaal en supervoxel/megavoxel berekeningen worden uitgevoerd met behulp van een van deze ontstoorde datasets als gegevensbron. In het algemeen, de totale variatie ontstoorde dataset wordt gebruikt als de brongegevens voor de functie kanaal en supervoxel/megavoxel berekeningen. Er is voorgesteld om eerst uitvoeren met de standaardwaarden, beoordelen van het resultaat in 3D en ten slotte iteratief het optimaliseren van de parameters voor de dataset. Bovendien functie kanalen kunnen worden opgebouwd in "filter sets," specifiek isoleren van aspecten van de dataset, en deze kan dan worden gebruikt als gegevensbronnen voor het maken van supervoxels en megavoxels. Terwijl deze strategie is in hoge mate afhankelijke dataset, zou het nuttig kan zijn.

Functie kanalen worden ook gebruikt als bronnen om te leiden van de classificatie in model opleiding. Bij de beslissing op welke functie kanalen te gebruiken, is het aanbevolen dat een paar krachtige functie kanalen (bijvoorbeeldvan blob detectie, textuur en structuur of robuuste functies Categorieën) bij het werken met een kleine hoeveelheid aantekeningen worden gebruikt om te trainen de classificatie. Wanneer u werkt met een grote hoeveelheid gegevens van de opleiding, het wordt aanbevolen om meer functie kanalen over het algemeen uit een van de categorieën gebruiken zolang ze gevarieerde informatie aan de classificatie verstrekken (bijvoorbeeldtoevoegen aan de bovenstaande lijst functie kanalen van lokaal functies en Gaussiaans functies Categorieën).

Er zijn drie hoofdonderdelen model opleiding: verstrekt invoergegevens bronnen die de gegevens beschrijven, met behulp van deze ingangen om te leiden van een classificatie, en ten slotte het verfijnen van de voorspellingen van de uitvoer. Over het algemeen vergt kleinere regio's van de gegevens meer gebruiker aantekeningen te nauwkeurig het trainen van de classificatie, terwijl grotere regio's van de gegevens minder gebruiker aantekeningen vereisen zal. Model opleiding kan eerst zonder te selecteren een verfijning worden gebruikt om te vinden van de beste voorspellingen. Vervolgens omvatten de verfijning en optimaliseren van de lambda-parameter zo nodig bij het herstellen van problemen met de voorspellingen zoals gaten of rafelige randen.

Supervoxels en megavoxels

Supervoxels zijn clusters van meerdere in de buurt, soortgelijk voxels38,39. Supervoxels beginnen als een standaard 3D grid overlay op de gegevens die vervolgens iteratief om te voldoen aan de onderliggende grenzen is misvormd, en dus de gegevens beter te vertegenwoordigen. Supervoxel creëren en vervorming wordt bestuurd door vier gebruikersinvoer: gegevensbron, superpixel vorm, spatiëring en compactheid. De gegevensbron biedt de gegevens "inputs" die worden doorzocht tijdens het maken van de supervoxel. Elke bron kan worden gebruikt, met inbegrip van gefilterde gegevensbronnen. De superpixel vorm parameters bepalen de startopstelling voor 3D en de geschatte gewenste vorm van het resulterende supervoxels. Het wijzigen van deze parameters kunt verhogen of te verlagen van de grootte van de supervoxels voordat de vervorming. De regelafstand parameters definiëren het belang van grenzen in elke richting. Wijzigen van deze parameters kan benadrukken grenzen in één of twee richtingen ten koste van de andere (s), wat betekent dat de resulterende supervoxels om betere follow gegevens grenzen in de bepaalde richting(en) zal vervormen. De laatste parameter, compactheid, bepaalt hoeveel de supervoxels kan vervormen. Een lage compactheid nummer staat de supervoxels te vervormen meer. Deze parameters moeten worden geoptimaliseerd zodat supervoxels waarmee de grenzen van de gegevens van belang. Opmerking: Op dit moment supervoxel vorm parameters moeten gelijk zijn aan 1024 of minder wanneer samen vermenigvuldigd.

In sommige opzichten, supervoxel parameters kunnen compenseren voor elkaar, wat betekent dat er bestaat geen "juiste antwoord" bij de beslissing over de parameters. Bijvoorbeeld, een grote startgrid (b.v. superpixel vorm: 10 x 10 x 10) en een lage compactheid nummer (ex. 20) supervoxels kan geven met soortgelijke grens hechting ten opzichte van een kleine startgrid (b.v. superpixel vorm 5 x 5 x 5) en een hogere compactheid nummer (bijvoorbeeld 50). Want er meer zijn, kleinere supervoxels in het tweede scenario, hoeven niet te vervormen als veel te vertegenwoordigen van de grenzen. Beide soorten parameters zou geschikt zijn voor segmentatie van de dataset.

De grootste overweging bij het kiezen van de supervoxel parameters is hoe goed het supervoxels vertegenwoordigen de gegevens. Weergeven van het supervoxels alleen, zonder gegevens onder hen, zoals in figuur 2D, is een goede manier om te beoordelen van de supervoxel parameters. Wanneer deze manier weergegeven, moeten de randen en de contouren van vormen die zijn gevonden in de data nog steeds zichtbaar zijn in de supervoxels.

Megavoxels zijn conglomeraten van meerdere aangrenzende, soortgelijk supervoxels38,-39. Ze zijn weer gecontroleerd door vier gebruikersinvoer: gegevensbron, lambda, numbins en gamma. Net als bij supervoxels, levert de gegevensbron de gegevens "inputs" die worden doorzocht tijdens het maken van de megavoxel. Zowel de numbins als de lambda invloed op de hechting van het formaat en de rand van de megavoxels. Aangezien de megavoxels groeien grotere (hoge lambda, lage numbins), vermindert de naleving van hun grens. Het omgekeerde is ook waar, de naleving van de grens zal toenemen met kleinere megavoxels (lage lambda, hoge numbins), maar aangezien het megavoxel verkleind, doet hun nut in het segmenteren van grote hoeveelheden voxels snel. De optionele gamma parameter regelt de gladheid factor ten opzichte van de kosten van het samenvoegen van de twee supervoxels samen. Kleine waarden van gamma kunnen de gelijkenis tussen de twee supervoxels, ten koste van het hebben van minder megavoxels algemene verbeteren.

Net als bij supervoxels, is de grootste overweging bij het kiezen en optimaliseren van de parameters van de megavoxel hoe goed het megavoxels de gegevens vertegenwoordigen. Weergeven van het megavoxels alleen als beschreven voor het supervoxels kan opnieuw worden gebruikt ter beoordeling van de parameters. Echter, omdat megavoxels over het algemeen veel groter worden zal en drie-dimensionale zijn, gebruik van de annotatie gereedschappen to Kies één megavoxels om ervoor te zorgen dat de grens tussen de regio's van belang is strak wordt ook aangeraden.

Aantekening strategie

Twee algemene aantekening strategieën zijn beschreven: een benadering van de opleiding model is handig voor het scheiden van grote gebieden van een dataset, terwijl een super regio segmentatie benadering handig voor kleinere, meer diverse functies zoals individuele organellen is. Aantekeningen kunnen worden georganiseerd in hiërarchische wijze, zodat is het mogelijk naar grote regio's eerste aantekeningen en verdeel ze in meer specifieke regio's met behulp van een ouder-kindrelatie. De bovenliggende label voor een label kan worden toegewezen door te klikken op het gebied aan de rechterzijde van de label kleurselectie en het kiezen van een passende bovenliggende label van een vorige niveau. In de praktijk gebruiken de meeste datasets model opleiding zowel de Super regio segmentatie strategieën specifieke regio's / kenmerken van belang in segmenten.

In de opleiding schoolvoorbeeld hier, werden een paar opleiding "inputs" (in de vorm van handmatige gebruiker supervoxel gebaseerde aantekeningen) gebruikt op drie gelijkelijk verdeelde segmenten van de gegevens. Op deze manier verhoogt het aspect van de opleiding model van SuRVoS enorm de snelheid waarmee segmentatie mogelijk, is vooral als regio's zoals de kloof tussen de regio's in de goosegrass fruiting body zoals benadrukt in werken met grote, gedifferentieerde Figuur 3.

Als model kan opleiding, als de voorspellingen niet zichtbaar, het noodzakelijk Ga naar het tabblad visualisatie en ervoor te zorgen dat de voorspellingen laag is ingeschakeld en ingesteld op een passende mate van transparantie. Ook, zal een vertrouwen van 0 elke labelloze supervoxel toewijzen aan een label, op basis van wat de dichtst match is. Vertrouwen van 100 zal alleen een label toewijzen als er slechts één categorie van label proportionele wedstrijd heeft. Alles daartussen is een afweging van deze twee uitersten. Bij het selecteren van een betrouwbaarheidsniveau wordt voorgesteld om te controleren enkele segmenten Inspecteer visueel of dat er geen onjuist voorspelde voxels voorafgaand aan het bewaren van de voorspelling op een etiket.

Een goede strategie voor aantekeningen maken met behulp van Super regio's is de vergroting-tool gebruiken om te zoomen op de gegevens, een paar organellen tegelijk op één segment, met gebruikmaking van een "snelle, rommelig" eerst (figuur 4C) van aantekeningen voorzien. Vervolgens omhoog of omlaag een paar plakjes in Z verplaatsen en herhaal dit proces. Omdat supervoxels drie-dimensionale zijn, worden veel van de fouten van de "messy" benadering opgelost door de aantekeningen die zijn gemaakt in het bovenstaande of onder segmenten. Op deze manier segmentatie is versneld en de grenzen worden verstrekt door de supervoxels in plaats van handmatig.

Voor de reiniging van een label, standaard segmentatie verfijning opties voorzien. Dilatatie zorgt ervoor dat het etiket van de geselecteerde segmentatie te groeien door de gegeven straal, erosie veroorzaakt te krimpen. Openen en sluiten zijn de toepassing van de eerste erosie en vervolgens dilatatie, of vice versa, respectievelijk. En vul gaten precies dat doet. De volgorde van deze operaties doet er toe. In het algemeen, het uitvoeren van vullen de gaten, dan openen, dan dilatatie werkt goed. Elke verfijning-methode kan worden toegepast op een enkel sneetje ("deze slice"), op alle segmenten in 2D ("alle segmenten (2D)") of 3D ("hele volume (3D)"). Alle segmenten (2D) wordt aanbevolen.

Betekenis en toekomstige richtingen

Efficiënt en nauwkeurig verlopen segmentatie is het volgende knelpunt bij de verwerking van 3D datasets, vooral met de routinematige automatische verzameling van terabytes van afbeeldingsgegevens tijdens lange-termijn-sessies. SuRVoS Workbench kan versnellen de segmentatie met een factor 5 ten opzichte van handmatige segmentatie. Ook, omdat de grenzen zijn afgebakend door supervoxels, de variabiliteit van de resulterende segmentaties moet verbeteren. Wij hopen in de toekomst te onderzoeken hoe de segmentatie van een representatieve 3D regio van belang als trainingsgegevens te gebruiken toe te passen op de rest van het volume, of zelfs een apart volume, met hoge vertrouwen. Dit voorschot zou verder afnemen, de hoeveelheid tijd in gebruikersmodus en input nodig segment zelfs complexe biologische volumes, helpt te verlichten de image processing en segmentatie bottleneck. Op zijn beurt, zal hierdoor de kwantitatieve vergelijking van biologische gegevens in verschillende Staten (bijvoorbeeld niet-ziekte, ziekte, behandeld) met robuuste experimentele nummers.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij wil erkennen en Rui Wang en Wah Chiu van Baylor College of Medicine voor het verstrekken van de dataset cryoET en Andrew Bodey van lichtbron van Diamond bedanken voor het helpen met de I13 beamtime. Delen van dit onderzoek werden ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie No. (P41GM103832) Wij erkennen Diamond lichtbron voor gezamenlijk financiering Imanol Luengo onder PhD STU0079.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
computern/an/aMoet draaien op het Linux-besturingssysteem en een NVidia GPU hebben met minimaal 4 GB aan geheugen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DiamondLightSource/SuRVoS: Version 1.0. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/247547 (2017).
  2. SuRVoS Workbench - Super Region Volume Segmentation. , Available from: https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ (2017).
  3. Frangakis, A. S., Förster, F. Computational exploration of structural information from cryo-electron tomograms. Curr Opin Struct Biol. 14 (3), 325-331 (2004).
  4. Lucić, V., Förster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
  5. Lučič, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  6. Milani, M., Drobne, D. Focused ion beam manipulation and ultramicroscopy of unprepared cells. Scanning. 28 (3), 148-154 (2006).
  7. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), (2004).
  8. Rigort, A., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 135-144 (2012).
  9. Förster, F., Han, B. -G., Beck, M. Visual Proteomics. Meth Enzymolb. 483, 215-243 (2010).
  10. Liu, Y., Sigworth, F. J. Automatic cryo-EM particle selection for membrane proteins in spherical liposomes. J Struct Biol. 185 (3), 295-302 (2014).
  11. Asano, S., et al. A molecular census of 26S proteasomes in intact neurons. Science. 347 (6220), 439-442 (2015).
  12. Garduño, E., Wong-Barnum, M., Volkmann, N., Ellisman, M. H. Segmentation of electron tomographic data sets using fuzzy set theory principles. J Struct Biol. 162 (3), 368-379 (2008).
  13. Sommer, C., Straehle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE Int Symp Biomed Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  14. Darrow, M. C., et al. Structural Mechanisms of Mutant Huntingtin Aggregation Suppression by the Synthetic Chaperonin-like CCT5 Complex Explained by Cryoelectron Tomography. J Biol Chem. 290 (28), 17451-17461 (2015).
  15. Wang, R., et al. Electron cryotomography reveals ultrastructure alterations in platelets from patients with ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (46), 14266-14271 (2015).
  16. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. eLife. 2, (2013).
  17. Dai, W., et al. Visualizing virus assembly intermediates inside marine cyanobacteria. Nature. 502 (7473), 707-710 (2013).
  18. Sandberg, K. Methods for Image Segmentation in Cellular Tomography. Methods Cell Biol. 79, 769-798 (2007).
  19. Volkmann, N. Methods for Segmentation and Interpretation of Electron Tomographic Reconstructions. Methods Enzymol. 483, 31-46 (2010).
  20. Tsai, W. -T., et al. From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data. J Vis Exp. (90), (2014).
  21. FEI. Amira & Avizo 3D: Software for Scientific and Industrial Data. , Available from: https://www.fei.com/software/amira-avizo/ (2016).
  22. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  23. Nguyen, H., Ji, Q. Shape-driven three-dimensional watersnake segmentation of biological membranes in electron tomography. IEEE trans med imaging. 27 (5), 616-628 (2008).
  24. Rusu, M., Starosolski, Z., Wahle, M., Rigort, A., Wriggers, W. Automated tracing of filaments in 3D electron tomography reconstructions using Sculptor and Situs. J Struct Biol. 178 (2), 121-128 (2012).
  25. Moussavi, F., Heitz, G., Amat, F., Comolli, L. R., Koller, D., Horowitz, M. 3D segmentation of cell boundaries from whole cell cryogenic electron tomography volumes. J Struct Biol. 170 (1), 134-145 (2010).
  26. Hecksel, C. W., et al. Quantifying Variability of Manual Annotation in Cryo-Electron Tomograms. Microsc Mpicroanal. 22 (3), 487-496 (2016).
  27. Achanta, R., Shaji, A., Smith, K., Lucchi, A., Fua, P., Süsstrunk, S. SLIC superpixels compared to state-of-the-art superpixel methods. IEEE trans pattern anal mach intell. 34 (11), 2274-2282 (2012).
  28. Luengo, I., Basham, M., French, A. P. Fast global interactive volume segmentation with regional supervoxel descriptors. Proc. SPIE. 9784, (2016).
  29. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation Workbench. J Struct Biol. 198 (1), 43-53 (2017).
  30. Wadeson, N., Basham, M. Savu: A Python-based, MPI Framework for Simultaneous Processing of Multiple, N-dimensional, Large Tomography Datasets. arXiv:1610.08015 [cs]. , Available from: http://arxiv.org/abs/1610.08015 (2016).
  31. DiamondLightSource/Savu: Version 1.2. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/198726 (2014).
  32. Paganin, D., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. J Microsc. 206 (Pt 1), 33-40 (2002).
  33. van Aarle, W., et al. Fast and flexible X-ray tomography using the ASTRA toolbox. Opt Express. 24 (22), 25129-25147 (2016).
  34. Palenstijn, W. J., Batenburg, K. J., Sijbers, J. Performance improvements for iterative electron tomography reconstruction using graphics processing units (GPUs). J Struct Biol. 176 (2), 250-253 (2011).
  35. Mastronarde, D. N. Dual-Axis Tomography: An Approach with Alignment Methods That Preserve Resolution. J Struct Biol. 120 (3), 343-352 (1997).
  36. Duke, E., Dent, K., Razi, M., Collinson, L. M. Biological applications of cryo-soft X-ray tomography. J Microsc. 255 (2), 65-70 (2014).
  37. Arbeláez, P., Maire, M., Fowlkes, C., Malik, J. Contour detection and hierarchical image segmentation. IEEE trans pattern anal mach intell. 33 (5), 898-916 (2011).
  38. Luengo, I., Basham, M., French, A. P. Hierarchical Piecewise-Constant Super-regions. arXiv:1605.05937 [cs]. , Available from: http://arxiv.org/abs/1605.05937 (2016).
  39. Luengo, I., Basham, M., French, A. P. SMURFS: superpixels from multi-scale refinement of super-regions. , Available from: http://www.bmva.org/bmvc/2016/papers/paper004/index.html 1-12 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SuRVoS WorkbenchVolume SegmentationSuper VoxelsModel TrainingLabel SplittingCryo Electron TomographyPhase Contrast X ray TomographyCryo Soft X ray TomographySuper Region SegmentationSemi automatic Segmentation

Related Articles