Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Samenvatting

Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.

Samenvatting

Glioblastoma (GBM) is de meest voorkomende en meest dodelijke primaire hersentumor bij volwassenen, waardoor ongeveer 14.000 doden elk jaar in de VS alleen. Mediane overleving na diagnose is minder dan 15 maanden met maximale chirurgische resectie, straling en temozolomide chemotherapie. De uitdagingen die inherent zijn aan de ontwikkeling van effectievere behandelingen GBM steeds duidelijk geworden, en omvatten de onverzettelijke invasiviteit, haar weerstand tegen standaard behandelingen zijn genetische complexiteit en moleculaire aanpassingsvermogen en subpopulaties van GBM cellen met fenotypische overeenkomsten met normale cellen van de stam, hierna te noemen glioblastoma stamcellen (GSCs). Omdat GSCs vereist voor tumorgroei en progressie zijn, vertegenwoordigt differentiatie gebaseerde therapie een levensvatbare behandeling modaliteit voor deze ongeneeslijke gezwellen.

Het volgende protocol beschrijft een verzameling van procedures om een hoge throughput screening platform gericht op de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van de GSC astroglial differentiatie. De kern van het systeem is een gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) differentiatie verslaggever-construct. Het protocol bevat de volgende algemene procedures: (1) tot oprichting van de GSC differentiatie verslaggever lijnen; (2) testen/valideren de relevantie van de verslaggever voor GSC zelf-vernieuwing/clonogenic capaciteit; en (3) hoge capaciteit stroom-cytometry gebaseerd drug screening.

De screening-platform biedt een eenvoudige en goedkope aanpak ter identificatie van de kleine moleculen ter bevordering van de differentiatie van de GSCs. Gebruik van bibliotheken van FDA-goedgekeurde geneesmiddelen houdt bovendien de mogelijkheden voor de identificatie van agenten die sneller andere doelen kan worden gebruikt. Ook worden therapieën die bevordering van Kanker stamcel differentiatie geacht te werken synergetisch met huidige "standaard van zorg" therapieën die te richten en te elimineren vooral meer gedifferentieerde kankercellen is gebleken.

Inleiding

Recente studies hebben aangetoond dat tumoren een kleine populatie bevatten van cellen, cellen van de stam van kanker (CSCs) of inleiding van de tumor cellen, genoemd die belast zijn met progressie van de tumor, uitzaaiingen en weerstand tegen chemo - en radio-therapieën ^{1, 2}. de aanwezigheid van cellen van de stam van kanker en hun meer gedifferentieerde nakomelingschap binnen tumoren wordt beschouwd als een belangrijke factor die bevordering van intratumoral heterogeniteit en vormt aldus een grote hindernis in het behandelen van kankers³. Tumor cel hiërarchie, geboden door de theorie van de stamcel kanker, heeft de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de behandeling van kankers ⁴geïnspireerd. Een aanpak voor het richten van de cellen van de stam van kanker is het identificeren en remmen signaalroutes waarvan bekend is dat tijdens de embryonale ontwikkeling van het betrokken orgaan verplicht worden. Inderdaad, wij en anderen eerder hebben gepubliceerd meerdere documenten beschrijven de voortdurende eis van de neurale stamcellen-relevante signaalroutes Sonic Hedgehog en Notch in glioblastoma^5,6,7. Dit werk heeft geholpen bij het stollen van de motivering van de verschillende GBM klinische proeven. Een tweede aanpak voor het richten van de cellen van de stam van kanker is het bevorderen van hun differentiatie. Deze aanpak heeft ontvangen veel steun als gevolg van de gunstige resultaten van preklinische en klinische studies in het behandelen van acute promyelocytic leukemie met retinoic zuren (ATRA, een vitamine-A-analoog). Hier bleek ATRA te verwijderen van het blok van rijping en kanker cel differentiatie⁸te bevorderen. Meer recent, Piccirillo en collega's elegant is gebleken dat BMP-4 GSC differentiatie in astrocyten met belangrijke anti-GBM effecten in vitro en in vivo^{9 bevordert}.

De reden voor de huidige studie is gebaseerd op een "omgekeerde engineering" aanpak voor het richten van de GSCs. Gezien de grote heterogeniteit aanwezig in GBM en met arme differentiatie wordt een van de kenmerken van de kanker, vroegen we als we een meer gunstige fenotype - differentiatie in een Astrocyt-achtige toestand kunnen bevorderen. Wij hebben hier geen voorkennis van de signaalroutes die handhaven GSCs een gegeven tumor specimen maar veeleer streven naar een gewenste fenotype (bijvoorbeeld GFAP positiviteit).

Dit verslag beschrijft de procedures die zijn gebruikt om de GSC differentiatie verslaggever-lijnen van de transductie van GSC-verrijkt culturen aan GSC kloonselectie. Het glioblastoma neurosphere lijnen gebruikt werden opgericht aan het laboratorium van Professor Angelo Vescovi van patiënten met een diagnose van primaire glioblastoma bij ziekenhuis San Raffaele - Milano, Italië. Deze lijnen zijn uitvoerig bestudeerd in verschillende publicaties ^{6,10,11,12,13,14}. Het is sterk aanbevolen dat personen die geïnteresseerd zijn in het implementeren van deze technieken in hun laboratorium bepalen de relevantie van de verslaggever voor Kanker stamcel zelf-vernieuwing capaciteit in de cellen die zij van plan om te studeren (dit geldt voor elke verslaggever). Een gedetailleerd protocol voor één van de in vitro clonogenic tests geaccepteerd in het veld wordt geleverd aan het bereiken van deze^15,16. Ten slotte, een gedetailleerd protocol met een beschrijving van het gebruik van de differentiatie verslaggever-lijnen in een flow-cytometry gebaseerd drug scherm wordt geleverd aan het eind. Van de nota, hebben ook aan het astroglial differentiatie systeem hier beschreven, we met succes vastgesteld en gevalideerd GSC verslaggever lijnen integratie van een MAP2:GFP (neuronale differentiatie) verslaggever. Daarom de methoden beschrijven in dit papier kan worden toegepast om te bestuderen van celdifferentiatie in verschillende geslachten van de cel.

Enkele van de cijfers in dit verslag kan worden gevonden in een recente publicatie: "Atracurium Besylate en andere neuromusculaire blokkering agenten bevorderen astroglial differentiatie en afbreken van glioblastoma stamcellen¹⁸.

Protocol

Opmerking: Astroglial en neuronale lentivirus verslaggever systemen werden aangekocht als voorverpakte, geconcentreerde lentivirale preparaten. Basiskennis van stroom cytometry techniek is vereist. Voor een optimaal gebruik van dit protocol moet de gebruiker ook toegang tot een cytometer van de stroom met hoge doorvoersnelheid capaciteit (accepteert 96-wells-platen als monsterbron).

1. lentivirale transcriptionele verslaggever systeem

Opmerking: In alle stroom cytometrische analyses, gebruik ouderlijke, niet-getransduceerde, cellen of cellen met vector-getransduceerde (niet-tl) voor de vaststelling van basislijn fluorescentie. Ook, merk op dat in alle maatregelen waar mechanische verpulvering wordt aangedrongen, te zacht. Harde verpulvering kan doden van een groot aantal van de kwetsbare GSCs en stroom cytometry resultaten beïnvloeden.

1. 1 x 10⁶ cellen in 2 mL zuiver volledige neurale stamcellen groeimedium in een 6-multiwell plaat plaat.
2. Transduce cellen door toevoeging van lentivirus verslaggever aan een veelheid van infectie (moi) gelijk is aan 5.
3. Voeg 2 µL van polybrene voor een eindconcentratie van 8 µg/mL.
4. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO₂ 's nachts.
5. De volgende dag, vervang groeimedium om niet-afhankelijke virus te verwijderen. Plaats de plaat terug in de incubator bij 37 ° C en 5% CO₂ en incubeer gedurende 24 uur.
6. Oogst 0,5 mL van het totale volume; spin down cellen bij 360 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een conische buis 15 mL en de bovendrijvende vloeistof verwijderen door aspiratie. Voeg 0,5 mL verse neurale stamcellen groeimedium aan de resterende cellen en de plaat terug naar de incubator voor verdere uitbreiding.
7. Voeg 200 µL van dissociatie reagens en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
8. Distantiëren cellen door pipetteren zachtjes op en neer.
   Opmerking: Harde verpulvering kan resulteren in aanzienlijke doden van GSCs, volledige dissociatie wordt gewoonlijk bereikt na 20 - 30 keer.
9. Toevoegen om te minimaliseren cel bijlage of aggregatie, 800 µL van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) voor een eindvolume van 1 mL.
10. Breng 200 µL van elke celsuspensie aan een putje van een 96-multiwell plaat.
11. Gebruik voor deze procedure een benchtop stroom cytometer met het vermogen van de 96-wells-plaat voorzien van een blauwe laser voor excitatie en het vermogen van het opsporen van groen fluorescent proteïne. Stroom cytometrische analyses uitvoeren met het ten minste 10.000 levensvatbare cellen voor elke aankoop.
12. Het bepalen van het percentage GFP-positieve cellen door stroom cytometry.

2. subclone selectie, uitbreiding en validatie

1. De cellen van de plaat in 100 µL van neurale stamcellen medium bij een dichtheid van 0,7 cellen per putje van een 96-multiwell plaat.
2. Cultuur klonen voor 11 dagen bij 37 ° C en 5% CO₂. Deze stap is zeer celtype afhankelijk en zal waarschijnlijk vereisen een aanpassing gebaseerd op de cellijn gebruikt. Als algemene regel is een bol diameter ≥ 100 µm een goede indicatie van de aanwezigheid van clonogenic GSCs in de neurospheres.
3. Met behulp van een fluorescente microscoop voorzien van een FITC-filter, markeren de putjes waarin een enkele neurosphere waar ~ 1-5% van de cellen GFP-positief zijn.
   Opmerking: Het bepalen van dat het exacte percentage van GFP-positieve cellen is niet te kritisch op dit punt. Elk van de subklonen zal later behandeld worden door stroom cytometry. Deze stap wordt uitgevoerd ter vermindering van het totaal aantal klonen te analyseren met nadruk op neurospheres die afkomstig van zijn gedifferentieerdeproductie, GFAP-negatief, GSC.
4. Vouw de geselecteerde verslaggever klonen totdat er een voldoende aantal cellen voor analyse door stroom cytometry. Een sub confluente goed van een 6-multiwell plaat met ≤ 1.5x10⁵ cellen/mL dient een voldoende aantal cellen.
   Opmerking: Een gedetailleerde procedure voor de isolatie en de uitbreiding van de GSCs is beschikbaar ¹⁷.

3. bepaling van GFAP:GFP expressie door Stroom Cytometry

1. Oogst een hoeveelheid cellen (0,5 mL) van elke verslaggever kloon en niet-getransduceerde besturingselementen om te bepalen van het exacte percentage van GFP-positieve cellen. Overwegen verslaggever klonen met ~ 1-5% GFP-positieve cellen.
2. Spin cellen bij 360 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en bovendrijvende vloeistof verwijderen door aspiratie.
3. Elke pellet, voeg 200 µL van cel dissociatie reagens en Incubeer de buizen in een waterbad ingesteld op 37 ° C.
4. Triturate cellen zachtjes om de schorsing van een eencellige (meestal tussen de 20 tot 30 keer).
5. Toevoegen om te minimaliseren cel bijlage of aggregatie, 800 µL HBSS tot een eindvolume van 1 mL.
6. 200 µL per putje van een 96-multiwell plaat van elke celsuspensie overbrengen.
7. Gebruik voor deze procedure een benchtop stroom cytometer met het vermogen van de 96-wells-plaat. Stroom cytometrische analyses uitvoeren met het ten minste 10.000 levensvatbare cellen voor elke aankoop.

4. ELDA zelf-vernieuwing Assay te beoordelen van Clonogenic capaciteit

Opmerking: Voor besturingselementen, zowel ouders, niet-getransduceerde, evenals GFP-uiten lentivirus-getransduceerde cellen, moet worden gebruikt om te bepalen van het potentieel van de relatieve clonogenic van de GSC differentiatie verslaggever lijnen naar de oorspronkelijke GSC culturen waaruit ze waren afgeleid.

1. Distantiëren differentiatie-reporter subklonen in eencellige schorsingen zoals hierboven beschreven.
2. De cellen van de plaat in 96-multiwell platen in 100 µL van volledige neurale stamcellen groei media op cel dichtheden variërend tussen 5 en 500 cellen per putje.
3. Incubeer de cellen gedurende 9 tot 11 dagen bij 37 ° C en 5% CO₂.
4. Scoren positief putten door rechtstreekse visualisatie van neurospheres onder een lichte Microscoop. Een goed moet worden overwogen "positief" als het bevat minimaal één grote neurosphere.
5. Sluit de gegevens: totale wells geanalyseerd en het aantal positieve putjes met behulp van de ELDA online interface beschikbaar op http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.

5. drug bibliotheek verdunning voorbereiding

1. Bibliotheek platen verwijderen uit opslag bij-80 ° C, dek af met aluminiumfolie (Bescherm lichtgevoelige stoffen). Voor ongeveer 30 min tot een uur op kamertemperatuur ontdooien.
2. Gebruik een 12-kanaals meerkanaals pipet om te verdunnen van de verbindingen van de bibliotheek tot 0.2 mM in volledige neurale stamcellen medium. DMSO verdunnen tot 10% in groeimedium
   Opmerking: De uiteindelijke concentratie van DMSO moet 0,1% wanneer toegevoegd aan de cellen. Toxiciteit kan leiden tot een hogere concentratie van DMSO in de cultuur. Om deze reden is het aanbevolen om de gevoeligheid voor DMSO testen in de cellijn gebruikt, vóór de behandeling.
3. DMSO als voertuig controle gebruiken voor de behandeling van de cellen in de kolommen van het linker- en rechterkant van elke plaat (de kolommen 1 en 12; Wells A tot en met H).
4. Dekking van de verdunde bibliotheek platen met aluminiumfolie en de originele platen van de bibliotheek terug te keren naar de vriezer-80 ° C voor langdurige opslag.

6. drugs scherm

Opmerking: Cellen DMSO-behandeld moeten worden gebruikt om de fluorescentie basislijn instellen en aanpassen gating.

1. Plaat 5 x 10³ cellen in een 96-multiwell plaat in 99 µL van het groeimedium volledig neurale stamcellen.
2. Cellen met verdunde bibliotheek verbindingen op een eindconcentratie van 2 µM (1 µL van 0,2 mM drug in 99 µL celsuspensie) of DMSO (control) met behulp van een 12-kanaals meerkanaals Pipet, behandelen. Incubeer de platen gedurende 72 uur bij 37 ° C en 5% CO₂.
3. Met behulp van een 12-kanaals meerkanaals pipet 150 µL van cel dissociatie reagens toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
4. Distantiëren cellen door voorzichtig triturating met een 12-kanaals meerkanaals pipet totdat één celsuspensie is bereikt (meestal tussen de 20 tot 30 keer). De hoeveelheid tijd die vereist is om zich te distantiëren van de neurospheres volledig zal variëren tussen de GSC lijnen. Terwijl het aanbevolen cel dissociatie reagens (Zie materiaal) veilig is en incubatie gedurende 45 minuten had geen effect op leefbaarheid in meerdere regels van de GSC getest, Controleer of voor elke GSC lijn moet worden opgenomen in de screening.
   Let op: Het eindvolume in elk Nou moet ongeveer 250 µL (100 µL celsuspensie + 150 µL van cel dissociatie reagens).
5. Het bepalen van het percentage van de cellen, uiting geven aan de verslaggever van de GFAP:GFP door stroom cytometry. Gebruik standaard gating strategie. Eerst, plot voorwaartse en zijdelingse verstrooit om een algemeen gevoel van Celgrootte en levensvatbaarheid. Plaats dan een poort op de levensvatbare eencellige bevolking. Dit is de bevolking waarvoor groene fluorescentie (eGFP) zal worden bepaald. Ieder samengestelde dat resulteert in een toename van het percentage van GFP-positieve cellen door meer dan drie standaarddeviaties controle (DMSO-behandeld) wordt beschouwd als een positieve "hit". Deze drempel moet worden aangepast volgens de specifieke toepassing en de gewenste striktheid.
   Opmerking: Voor de hoge doorvoer scherm wordt aanbevolen met behulp van een enkele GSC verslaggever subclone. Na hit identificatie, elke hit moet worden gevalideerd tegen extra verslaggever subklonen uit de dezelfde GSC-lijn. Om te vergroten van het vertrouwen voor echte hits is raden ook aan het testen van verbindingen tegen verslaggever subklonen geïsoleerd uit verschillende GSC neurospheres lijnen.

Resultaten

Drie onafhankelijke patiënt afkomstige neurospheres lijnen werden getransduceerde met de lentivirus astroglial verslaggever codering voor een groen fluorescent proteïne (GFP) gesmolten in-frame met een Zeocin weerstand cassette en gedreven door het menselijke element van GFAP promotor ( Figuur 1). Volgende individuele klonen werden geïsoleerd door plating 0.7 cellen per putje in een 96 goed bord (Figuur 2), dit werd gevolgd door ...

Discussie

Terwijl de meeste van de eerdere studies van GSCs was vooral gericht op de markeringen die ze bepalen, in dit onderzoek besloten hebben we om de omgekeerde aanpak. We concentreren ons vooral op de gedifferentieerde nakomelingschap gegenereerd door GSCs (bijvoorbeeld cellen uiten van astroglial en neuronale stiften). Hier tonen we het gebruik van een hoge-doorvoer-cel-gebaseerde drug screening systeem, dat gebaseerd is op menselijke GFAP promotor-afhankelijke expressie van GFP. Alle experimenten werden uitgevoerd met behu...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)	Sigma Aldrich	H6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
50 ml steriele wegwerpreagensvoorraden	Corning	4870
6 welplaat	Thermo Fisher Scientific	130184
96 welplaat	Falcon	353072
Biolite T25 cm² Flask Vented	Thermo Fisher Scientific	130189
Biolite T75 cm² Flask Vented	Thermo Fisher Scientific	130190
15 ml Centrifuge tubes	Celltreat	229411
1.5ml Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Ovation Multi Channel Pipette, 12 kanaal, 0,5 - 20uL	VistaLab Technologies	1060-0020
Ovation Multi Channel Pipette, 12 kanaal, 5-250uL	VistaLab Technologies	1060-0250
Multi 12-kanaals pipetten tips 25 μl	VistaLab Technologies	4060-1002
Multi 12-kanaals pipetten tips 250 μl	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer	EMD Millipore	0500-4005
NIH Clinical Collections 1 en 2 kleine molecuulbibliotheken	Evotec
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Voor de bereiding van neurale stamcelmedia (500 mL)			Eindconcentratie
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0,20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
Heparine natriumzout	Sigma Aldrich	H3149	0,0002%
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5,4 mM
Insulin-Transferrine- Selenium (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14,5 mM
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
Progesteron	Sigma Aldrich	P8783	16 nM
Putrescine	Sigma Aldrich	P5780	4,8 µM
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Human	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Gebruik om media te filteren steriliseren