Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Summary

Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.

Abstract

Glioblastoma (GBM) is de meest voorkomende en meest dodelijke primaire hersentumor bij volwassenen, waardoor ongeveer 14.000 doden elk jaar in de VS alleen. Mediane overleving na diagnose is minder dan 15 maanden met maximale chirurgische resectie, straling en temozolomide chemotherapie. De uitdagingen die inherent zijn aan de ontwikkeling van effectievere behandelingen GBM steeds duidelijk geworden, en omvatten de onverzettelijke invasiviteit, haar weerstand tegen standaard behandelingen zijn genetische complexiteit en moleculaire aanpassingsvermogen en subpopulaties van GBM cellen met fenotypische overeenkomsten met normale cellen van de stam, hierna te noemen glioblastoma stamcellen (GSCs). Omdat GSCs vereist voor tumorgroei en progressie zijn, vertegenwoordigt differentiatie gebaseerde therapie een levensvatbare behandeling modaliteit voor deze ongeneeslijke gezwellen.

Het volgende protocol beschrijft een verzameling van procedures om een hoge throughput screening platform gericht op de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van de GSC astroglial differentiatie. De kern van het systeem is een gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) differentiatie verslaggever-construct. Het protocol bevat de volgende algemene procedures: (1) tot oprichting van de GSC differentiatie verslaggever lijnen; (2) testen/valideren de relevantie van de verslaggever voor GSC zelf-vernieuwing/clonogenic capaciteit; en (3) hoge capaciteit stroom-cytometry gebaseerd drug screening.

De screening-platform biedt een eenvoudige en goedkope aanpak ter identificatie van de kleine moleculen ter bevordering van de differentiatie van de GSCs. Gebruik van bibliotheken van FDA-goedgekeurde geneesmiddelen houdt bovendien de mogelijkheden voor de identificatie van agenten die sneller andere doelen kan worden gebruikt. Ook worden therapieën die bevordering van Kanker stamcel differentiatie geacht te werken synergetisch met huidige "standaard van zorg" therapieën die te richten en te elimineren vooral meer gedifferentieerde kankercellen is gebleken.

Introduction

Recente studies hebben aangetoond dat tumoren een kleine populatie bevatten van cellen, cellen van de stam van kanker (CSCs) of inleiding van de tumor cellen, genoemd die belast zijn met progressie van de tumor, uitzaaiingen en weerstand tegen chemo - en radio-therapieën ^{1, 2}. de aanwezigheid van cellen van de stam van kanker en hun meer gedifferentieerde nakomelingschap binnen tumoren wordt beschouwd als een belangrijke factor die bevordering van intratumoral heterogeniteit en vormt aldus een grote hindernis in het behandelen van kankers³. Tumor cel hiërarchie, geboden door de theorie ....

Protocol

Opmerking: Astroglial en neuronale lentivirus verslaggever systemen werden aangekocht als voorverpakte, geconcentreerde lentivirale preparaten. Basiskennis van stroom cytometry techniek is vereist. Voor een optimaal gebruik van dit protocol moet de gebruiker ook toegang tot een cytometer van de stroom met hoge doorvoersnelheid capaciteit (accepteert 96-wells-platen als monsterbron).

1. lentivirale transcriptionele verslaggever systeem

Opmerking: In alle stroom cytometrische analyses, gebruik ouderlijke, niet-getransduceerde, cellen of cellen met vector-getransduceerde (niet-tl) voor de vaststelling van basislijn fl....

Results

Drie onafhankelijke patiënt afkomstige neurospheres lijnen werden getransduceerde met de lentivirus astroglial verslaggever codering voor een groen fluorescent proteïne (GFP) gesmolten in-frame met een Zeocin weerstand cassette en gedreven door het menselijke element van GFAP promotor ( Figuur 1). Volgende individuele klonen werden geïsoleerd door plating 0.7 cellen per putje in een 96 goed bord (Figuur 2), dit werd gevolgd door .......

Discussion

Terwijl de meeste van de eerdere studies van GSCs was vooral gericht op de markeringen die ze bepalen, in dit onderzoek besloten hebben we om de omgekeerde aanpak. We concentreren ons vooral op de gedifferentieerde nakomelingschap gegenereerd door GSCs (bijvoorbeeld cellen uiten van astroglial en neuronale stiften). Hier tonen we het gebruik van een hoge-doorvoer-cel-gebaseerde drug screening systeem, dat gebaseerd is op menselijke GFAP promotor-afhankelijke expressie van GFP. Alle experimenten werden uitgevoerd met behu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)	Sigma Aldrich	H6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
50 ml sterile disposable reagent reservoirs	Corning	4870
6 well plate	Thermo Fisher Scientific	130184
96 well plate	Falcon	353072
Biolite T25 cm² Flask Vented	Thermo Fisher Scientific	130189
Biolite T75 cm² Flask Vented	Thermo Fisher Scientific	130190
15 ml Centrifuge tubes	Celltreat	229411
1.5ml Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL	VistaLab Technologies	1060-0020
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL	VistaLab Technologies	1060-0250
Multi 12-channel pipette tips 25 μl	VistaLab Technologies	4060-1002
Multi 12-channel pipette tips 250 μl	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer	EMD Millipore	0500-4005
NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries	Evotec
Name	Company	Catalog Number	Comments
For the preparation of neural stem cell media (500 mL)			Final concentration
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0.20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
Heparin sodium salt	Sigma Aldrich	H3149	0.0002%
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5.4 mM
Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14.5 mM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
Progesterone	Sigma Aldrich	P8783	16 nM
Putrescine	Sigma Aldrich	P5780	4.8 µM
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Human	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Use to filter sterlize media