Methodenartikel

Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

12.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56185

⸱

21 augustus 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of California, 2Program in Immunology, University of California, 3Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University, 4Department of Pathology, Stanford University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te veroorzaken verlamming en opticospinal ontsteking door overdracht van aquaporin-4 (AQP4)-specifieke T-cellen van de AQP4- / - muizen in WT muizen. Daarnaast tonen we hoe met seriële optische coherentie tomografie controleren visuele systeem dysfunctie.

Samenvatting

Hoewel wordt erkend dat aquaporin-4 (AQP4)-specifieke T-cellen en antilichamen deelnemen in de pathogenese van neuromyelitis optica (NMO), een menselijke centrale zenuwstelsel (CNS) demyeliniserende auto-immuunziekte, de oprichting van een AQP4-gerichte model met beide klinische en histologische uitingen van CNS autoimmuniteit uitdagende heeft bewezen. Immunisatie van wild-type (WT) muizen met AQP4 peptiden ontlokte T-celproliferatie, hoewel die T-cellen niet ziekte naar naïef ontvangende muizen kunnen worden overgebracht. Onlangs, twee roman AQP4 T-cel epitopen, peptide (p) 135-153 en p201-220, werden geïdentificeerd als immuun reacties op AQP4 in AQP4-deficiënte (AQP4- / -) muizen, suggereren T cel reactiviteit aan deze epitopen studeren wordt normaal bestuurd door serie negatieve selectie. AQP4- / - Th17 gepolariseerde T cellen gevuld tot p135-153 of p201-220 geïnduceerde verlamming in ontvangende WT muizen, die werd geassocieerd met overwegend leptomeningeale ontsteking van het ruggenmerg en de optische zenuwen. Ontsteking omliggende optische zenuwen en betrokkenheid van de binnenste retinale lagen (IRL) waren gemanifesteerd door veranderingen in seriële optische coherentie tomografie (OCT). Hier, illustreren we de benaderingen die zijn gebruikt voor het maken van dit nieuwe in vivo model van AQP4-gerichte CNS autoimmuniteit (ATCA), die nu kan worden gebruikt om te bestuderen van de mechanismen waarmee de ontwikkeling van pathogene AQP4-specifieke T-cellen en hoe kunnen zij samenwerken met B cellen in NMO pathogenese.

Inleiding

Neuromyelitis optica (NMO) is een centraal zenuwstelsel (CNS) auto-immune inflammatoire demyeliniserende ziekte die veroorzaakt terugkerende episoden van verlamming en visuele verlies leidt tot blijvende neurologische invaliditeit1. NMO wordt momenteel beschouwd als voornamelijk een humorale auto-immune ziekte2 als het wordt geassocieerd met antilichamen (Igs) gericht op aquaporin-4 (AQP4), een water-kanaal uitgedrukt overvloedig op astrocyten3,4. CNS ontsteking is echter een voorwaarde voor CNS vermelding van AQP4 Ig5,6. Het is dus niet mogelijk om een model van de NMO door overdracht van anti-AQP4 Igs alleen geweest. De bevindingen zijn (1) pathogene AQP4-specifieke Igs bij NMO patiënten IgG11,2, een T-cel-afhankelijke Ig subklasse7 (2) T-cellen worden geïdentificeerd in NMO laesies8,9 (3) NMO is gekoppeld met bepaalde genen MHC II (bijvoorbeeld HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10, en (4) proinflammatoire AQP4-reactieve DR-beperkte Th17 cellen worden uitgevouwen in NMO patiënten11,12 alle geven dat AQP4-specifieke T-cellen hebben een sleutelrol in NMO pathogenese. Het is dus belangrijk om dierlijke modellen om te bepalen hoe AQP4-specifieke T-cellen kunnen bijdragen tot de NMO pathogenese te ontwikkelen.

Enkele jaren geleden, werden meerdere AQP4 T-cel epitopen geïdentificeerd in wild-type (WT) de muizen13,de14 en ratten15. Terwijl het werd waargenomen dat AQP4-reactieve T cellen opticospinal ontsteking in naïef ontvangende ratten15,16 induceren kunnen, belangrijke klinische symptomen van ziekte van de CNS niet zijn nageleefd. Ook directe immunisatie van WT muizen met peptiden met AQP4 T-cel epitopen14,17, of overdracht van proinflammatoire T cellen die determinanten17targeting, veroorzaakten geen klinische symptomen of histologische bewijs van CNS autoimmuniteit.

Onlangs, het werd waargenomen dat immunisatie van C57BL/6 AQP4-deficiënte (AQP4- / -) muizen met AQP4 peptide (p) 135-153 of p201-220, twee determinanten voorspeld te binden van MHC II (ik-A-b) met hoge affiniteit18, ontlokte sterke CD4 + T cel reacties17. Deze twee peptiden ontlokte daarentegen slechts bescheiden proliferatieve reacties in WT muizen. Verder was de T cel receptor (TCR) repertoire gebruikt voor erkenning van deze determinanten door T cellen van AQP4- / - muizen uniek. Gezamenlijk deze bevindingen wijzen erop dat T cel erkenning van AQP4 wordt gereguleerd door serie negatieve selectie. AQP4 p135-153 - of p201-220-specifieke Th17 cellen van AQP4- / - donor muizen geïnduceerde verlamming in bijna 100% van de naïeve ontvangende WT muizen; Dit ging gepaard met opticospinal van T cellen, B-cellen en monocyten infiltreert. Seriële opticospinal coherentie tomografie (OCT) aangetoond dynamische visuele systeem betrokkenheid. Muizen met AQP4-gerichte CNS T cellen gemedieerde autoimmuniteit (ATCA) worden verlamming en visuele systeem schade verhaald. In tegenstelling tot de EAE geïnduceerd door myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) p35-55-specifieke T-cellen, die hebben geleid tot aanhoudende klinische ziekte, was ATCA geïnduceerd door T cellen alleen niet geassocieerd met axonale verlies of vermindering in netvlies peesknoopcellen (RGCs). Onze resultaten hebben duidelijk aangetoond dat er meerdere pathogene AQP4 T cel determinanten zijn. Dit nieuwe model van ATCA is nuttig voor het bestuderen van mechanismen beheersen van de ontwikkeling van pathogene AQP4-specifieke T-cellen, leren hoe die cellen veroorzaken CNS ontsteking en hoe kunnen zij samenwerken met AQP4-specifieke B-cellen en antilichamen ter bevordering van de NMO pathogenese .

In het onderhavige verslag beschrijven we de protocollen gebruikt om te induceren en evalueren van T-cel-geïnduceerde ATCA. We beginnen met de technieken die worden gebruikt voor immunisatie, T celkweek en Th17 polarisatie voor het genereren van pathogene AQP4-specifieke T-cellen, stroom cytometry analyse te bevestigen van polarisatie en adoptief overdracht van deze T-cellen. Vervolgens beschrijven we methodes voor de evaluatie van de klinische en histologische ziekte en het gebruik van seriële LGO te controleren visuele systeem schade in ontvangende muizen.

Protocol

alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met inachtneming van experimentele richtsnoeren goedgekeurd door de Universiteit van Californië, San Francisco institutionele Animal Care en gebruik Comité. C57BL/6 (H-2 b) vrouwelijke muizen, 8 weken oud, werden aangekocht en C57BL/6 AQP4 - / - muizen werden verstrekt door A. Verkman.

1. immunisatie van muizen met AQP4 peptiden

  1. bereiden volledige Freund ' s adjuvans (CFA) werken voorraad.
    1. Fijn vermalen een gedroogde voorbereiding van M. tuberculosis (H37Ra) met behulp van een mortier en een stamper.
    2. Toevoegen gemalen H37Ra om onvolledige Freund ' s adjuvans aan een eindconcentratie van 4 mg/mL. CFA kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.
  2. Los gelyofiliseerd antigeen (Ag) AQP4 peptide in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL. Bewaren bij 4 ° C of op ice.
  3. Voorbereiding van de vergadering van 2 luer-lock spuiten, samen met een afsluiter, met de CFA-/ peptide emulsie.
    1. Toevoegen een glas luer-lock spuit zonder plunjer naar een 3-weg nylon afsluiter met 2 mannelijke luer-lock-aansluitingen. Sluit de afsluiter door over te schakelen van de hendel naar de spuit. Plaats het open einde van de injectiespuit omhoog, waardoor de spuit om te fungeren als een reageerbuis. Plaats deze in een rek van de buis voor extra stabiliteit.
    2. Vortex de CFA werken voorraad en de Ag-oplossing. Toevoegen van een volume van 1:1 van peptide / CFA aan de open spuit. 200 µL van CFA/Ag (4 x 50 µL) is vereist per muis.
      Opmerking: Normaal gesproken ongeveer 1 mL voorbereiding gaat verloren in de afsluiter, die het beschikbare bedrag voor immunisatie verminderen zal. Daarom is het belangrijk om te nemen in de berekening van het totale volume vereist.
      Voorbeeld: voor immunisatie van 5 muizen: (200 µL/dier x 5 dieren) + 1 mL extra volume = 2 mL totale CFA/Ag vereist.
    3. Plaatst u de plunjer glas in de spuit terwijl het bedrijf dat in de plaats, de injectiespuit omkeren zodat de afsluiter is naar boven gericht. De afsluiter hendel naar de ongebruikte vrouwelijke verbinding in te schakelen Zorgvuldig druk uitoefenen op de zuiger van het glas om het verwijderen van overtollige lucht uit de spuit. De vloeistof vult de tweede mannelijke luer-lock-aansluiting van de afsluiter.
    4. Sluit een tweede glas spuit (plunjer volledig ingevoegd) aan de tweede mannelijke luer-lock-aansluiting van de afsluiter. Dit moet een gesloten systeem van 2 glazen spuiten in verband met een afsluiter met als weinig overtollige lucht mogelijk.
    5. Maken van een emulsie, Meng door duwen de plunjers geschiedde de vloeistof afwisselend tussen de 2 spuiten voor ongeveer 2 min. Chill de spuiten op ijs voor ongeveer 10 min. Herhaal het koelen en mengen totdat er een duidelijke verandering in de viscositeit van het preparaat is , wat resulteert in een zeer stijf, witte emulsie. Het spuiten met de emulsie bij 4 ° C koelen of te handhaven op ice.
  4. Al de emulsie overbrengen in een glas luer-lock spuit, de spuit leeg glas verwijderen en vervangen door een spuit van 1 mL luer-lock voor injectie. Vul de nieuwe spuit met emulsie, verwijderen uit de afsluiter en hechten een naald (25G x 5/8).
  5. " water-test " de emulsie voor consistentie. Uitzetting van een daling van de emulsie in een kleine schotel van water. De emulsie moet niet verspreiden, wat aangeeft dat het geschikt is voor injectie.
    1. Als de emulsie verspreidt, is het niet klaar voor de injectie; overdracht de vloeistof terug in het glas spuiten en blijven mengen en vervolgens chill opnieuw totdat de emulsie stijf is.
    2. Test de emulsie opnieuw tot de juiste consistentie heeft bereikt.
  6. Donor AQP4 - / - muizen subcutaan injecteren (SC) met emulsie met de AQP4 peptide. Elke muis ontvangt 4 x 50 µL s.c. injecties (200 µL totale (100 µg peptide)). De 4 sites bevatten beide kanten van de onderbuik, die afwateren in de inguïnale lymfeklieren (LN), en beide zijden van de mediale aan elke oksel, borst muur die afwateren in LN. axillaris De adoptieve overdracht vergt 1-2 geïmmuniseerde donor muizen per geadresseerde muis.

2. T celkweek en Proinflammatory T cel polarisatie

  1. 10-12 dagen na immunisatie, LN van de muizen verzamelen.
    1. In een bakje ijs bereiden 60 mm petrischaaltjes voorzien van een cel zeef (maaswijdte grootte 70 µm) en met gekoelde RPMI media met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en 100 U/mL penicilline-100 µg/mL streptomycine (pen-strep) (RFPS).
    2. Euthanaseren muizen door blootstelling aan CO 2, gevolgd door cervicale dislocatie. Onderdompelen van muizen in 70% ethanol en vervolgens pin elke struikrover aan een dissectie.
    3. Gesneden een middellijn huid incisie van de lies naar de hals en naar beneden elk been. Trek de huid uit de buurt van het buikvlies en pin het strak op het bord. Lies en axillaire LN ontleden en plaats in de petrischaal met Inkoopproces, op ijs. 19
    4. voor adoptief overdracht experimenten, combineren LN van alle dieren die binnen dezelfde immunisatie groep. Voor stroom cytometrische analyses van Vβ gebruik, LN te scheiden van individuele dieren.
  2. Plaats de zeef van de cel met de LN op een 50 mL centrifugebuis met Inkoopproces. Gebruik het platte einde van een steriele 5 mL spuit zuiger om te drukken de LN-cellen door de zeef, wassen met 20-30 mL RFPS om terugwinning van de cellen te vergemakkelijken. LN cellen op ijs gedurende de verwerking tot tijd voor cultuur behouden.
  3. Wassen tweemaal, centrifugeren bij 393 x g gedurende 5 min. Na de tweede wash, resuspendeer de cellen LN in T cel media (TCM). TCM bevat RPMI met 10% warmte-geïnactiveerd FBS, 292 µg/mL L-glutamine, 110 µg Mo/mL natrium pyruvaat, en 55 µM 2-mercaptoethanol en pen-strep. Meestal wordt een volume van 5 mL TCM per donor muis gebruikt.
  4. LN cellen tellen. Verwachte opbrengst is ongeveer 3-6 x 10 7 LN cellen per geïmmuniseerde muis donor. 3-4 x 10 gereserveerd 6 voor een proliferatie assay (zie paragraaf 3 hieronder).
  5. Instellen polariserende culturen voor adoptief overdracht (afdeling 6).
    1. Bereiden een Th17 polariserende cultuur van 5 x 10 6 LN cellen per mL met 10 µg/mL Ag, 20 ng/mL recombinante muis Interleukine (IL) -23 en 10 ng/mL recombinant muis IL-6 in TCM.
    2. Als alternatief voor Th1 polarisatie, bereiden een cultuur van 5 x 10 6 LN cellen per mL met 10 µg/mL Ag en 10 ng/mL recombinant muis IL-12 in TCM.
    3. , Voeg 2 mL (1 x 10 7 cellen) per putje van de polariserende cultuur mengsel in een 12-well-plaat. De LN-cellen van 2-4 donor muizen vult een 12-well plaat. Handhaven van culturen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 voor 72 h.
    4. Visueel controleren de LN-cellen in cultuur voor activering op 48 uur en 72 h. actieve cellen zullen uitgebreide clusters vormen en de T-cellen zal toenemen in grootte, steeds meer pleomorfe. De toename van de stofwisseling zal leiden tot een verlaging van de pH in de media, wijzigen van perzik tot oranje. Als de pH laag genoeg is om de media te geel, voeg 1 mL verse TCM om te voorkomen dat toxiciteit voor de cellen in de resterende 24 h.
      5. Ga verder naar de sectie 6
    5. voor de overdracht van de adoptie. Polarisatie-efficiëntie kan worden geverifieerd door intracellulaire cytokine kleuring (ICS), descrIBED in sectie 5.
  6. Opzetten van culturen met LN uit individuele muizen voor flow cytometrische analyse van oppervlakte Vβ meningsuiting (afdeling 4).
    1. Bereiden 5 x 10 6 LN cellen per mL met 10 µg/mL Ag in TCM.
    2. , Voeg 2 mL (1 x 10 7 cellen) van de cultuur per putje in een 12-well-plaat. Culturen moeten worden gehandhaafd in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 voor 10 dagen. Gaat u verder met sectie 4.

3. Proliferatie Assay

Opmerking: dit gaat verder vanaf punt 2.4.

  1. Bereiden van LN cellen in een buis, op 2 x 10 mL 3-4-6 cellen per mL in TCM.
  2. Voorzichtig mengen de cellen door het omkeren van de buis meerdere keren, en vervolgens overbrengen naar een steriele trog.
  3. Gebruik een meerkanaals pipet te plaat 100 µL per putje cellen naar een 96-Wells-ronde bodemplaat weefselkweek. Typisch, plaat 15 putten voor drievoudige testen van 4 Ag concentraties en een geen verwijzing van de Ag.
  4. Verdun de Ag in TCM in diverse concentraties, meestal 80, 20, 5, 1 en 0 µg Mo/mL (voor 2 x voorraden). Voeg 100 µL voor elke concentratie in drievoud voor een eindconcentratie van 40 10, 2.5. 0,5 en 0 µg Mo/mL. Incubeer gedurende ongeveer 72 uur bij 37 ° C.
    Opmerking: stappen 3.5 via 3.7 betrekken radioactieve materialen. Correct gebruik, monitoring en verwijdering van radioactieve stoffen moeten worden uitgevoerd, institutionele en gouvernementele reglementeringen.
  5. Bereiden een werken-stockoplossing van 3 H-thymidine (40 µCi/mL) door toevoegen van 1 mCi 3 H-thymidine aan 25 mL RPMI, en dit te bewaren bij 4 ° C. Pipetteer 0,5 mL van de werkoplossing in een steriele trog.
  6. Voeg toe 25 µL van 3 H-thymidine (1 µCi) per goed met behulp van een meerkanaals Pipetteer. Incubeer gedurende een extra 18 uur bij 37 ° C.
  7. Oogsten van cellen op een glas filter mat met behulp van een 96-Wells cel harvester en spoel met 70% ethanol. Na het drogen, zegel het filter mat in een kunststof bemonsteringszak met 5 mL Scintillatie vloeistof. Maatregel radioactiviteit in elk goed met een teller scintillatie.

4. Stroom Cytometry analyse voor cel oppervlak TCR Vβ expressie

Opmerking: dit gaat verder vanaf punt 2.6. Antilichamen voor muis TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 en 5.2, 6, 7, 8.1 en 8.2, 8.3, 9, 10, 11, 12, 13, 14 en 17 bis zijn beschikbaar commercieel voor het testen van de expressie van de TCR Vβ.

  1. Voor de detectie van TCR Vβ, T-cellen van de cultuur-plaat te verjagen door meerdere malen pipetteren en cellen overbrengen in een buis.
  2. Wassen met FACS buffer (FB) met 2% FBS, 0,1% natriumazide en 2 mM EDTA in PBS.
  3. Overdracht cellen naar een V-bodem 96-wells-plaat duikt met een dichtheid van 1 x 10, 5, 3 x 10 6 cellen per putje. Als de gehele Vβ paneel wordt getest, de cellen moeten worden verdeeld in meerdere wells (één putje per Vβ wordt getest).
  4. Uitsluiten dode cellen flow cytometrische analyse door kleuring met een LIVE/DEAD levensvatbaarheid kleurstof, die met gratis amines blootgesteld door necrotische cellen reageert. Volg de fabrikant ' s instructies voor centrifugeren en hersuspensie in levensvatbaarheid kleurstof. Incubeer op ijs voor 10-20 min. in de cel kleuring van procedures, cellen beschermen tegen licht en houden op ice.
  5. Na incubatie, wassen van de plaat eenmaal in FB. U wilt opsporen TCR Vβ, schorten de cellen in 100 µL van FB met een verdunning van de 1:100 van antilichamen voor CD4 (kloon RM4-5) en TCR Vβ. Incubeer gedurende 15 tot 60 min op ice.
  6. Wassen van de plaat eenmaal in FB en monteren van de cellen door het toevoegen van 200 µL van 4% paraformaldehyde verdund in PBS. Incubeer gedurende 20 min op ijs. Wassen van de plaat in FB en analyseren door stroom cytometry.

5. Stromen van de cytometrische analyse voor intracellulaire Cytokine productie

  1. voor intracellulaire cytokine kleuring (ICS), behandelen T celculturen met een verdunning van de 1:1,000 van eiwitreagens vervoer remmer (bijvoorbeeld GolgiPlug) in TCM, 4 uur voorafgaand aan ICS om te voorkomen dat cytokine secretie. Op dat moment, T-cellen met 50 ng/mL phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en 500 ng/mL ionomycin te activeren om te induceren eiwitproductie.
  2. Na 4 uur van cultuur bij 37 ° C, cellen van de cultuur-plaat te verjagen door pipetteren op en neer, en overbrengen in een centrifugebuis (15 of 50 mL).
  3. Wassen met FB. Resuspendeer de cellen in de FB en transfer naar een V-bodem 96-wells-plaat duikt met een dichtheid van 5 x 10, 5 tot en met 3 x 10 6 cellen per putje.
  4. Vlek cellen met levensvatbaarheid kleurstof zoals hierboven (punt 4.2) beschreven. Na de incubatie, wassen van de plaat eenmaal in FB.
  5. Antilichamen voor detecteren van merkers van de oppervlakte als volgt toevoegen:
    1. voor de detectie van oppervlakte markers, schorten de cellen in 100 µL van FB met een verdunning van de 1:100 van antilichaam voor CD4 (kloon RM4-5).
    2. Desgewenst ook antilichamen voor B220 (kloon 30-F11) en CD11b (kloon M1/70) bij een verdunning 1:100 ter verbetering van gating van B-cellen en monocyten/macrofagen, respectievelijk. In het algemeen, PE-Cy7 anti-CD4, FITC anti-B220 en PerCP-Cy5.5 anti-CD11b werken goed. Keuze van geconjugeerde antilichaam/fluorescerende moet laten leiden door configuratie van stroom cytometer moet worden gebruikt voor analyse, en optimale concentraties van antilichamen moeten worden bepaald empirisch.
    3. Incubeer gedurende 15 tot 60 min op ice.
  6. Wassen van de plaat met FB en resuspendeer de cellen in 200 µL van fixatie/Permeabilization oplossing voor 20 min op ijs. Dit zal vast de cellen en permeabilize van de membranen.
  7. Teneinde de permeabilization van de celmembranen tijdens de intracellulaire kleuring, gebruik Perm/afwas buffer (PW) (verdunde 1:10 van de 10 X voorraad) in plaats van FB. Was de putjes in 200 µL van PW.
  8. Voor ICS, maak een 1:100 verdunning van de antilichamen voor interferon (IFN)-γ en IL-17A met behulp van 1 x PW. É㠩 n optie is APC anti-IFN-γ (kloon XMG1.2) en PE anti-IL-17A (kloon eBio17B7) die goed werkt. Resuspendeer de cellen in 100 µL van het intracellulaire antilichaam cocktail en vervolgens Incubeer gedurende minstens 15 min. Het is ook mogelijk te blijven de kleuring 's nachts bij 4 ° C.
  9. Wassen van de putten in 200 µL van PW en hersuspensie in FB voor stroom cytometry.
  10. Parallel, bereiden een onbevlekt monster (cellen in FB zonder antilichamen) detector spanningen en één gebeitste monsters voor elke individuele fluorescerende (dat wil zeggen, cellen of compensatie kralen gekleurd met slechts één antilichaam/fluorescerende) te optimaliseren compensatie spill-over waarden bepalen.
  11. Met behulp van een stroom cytometer, verwerven ≥ 10.000 cellen (gebeurtenissen), gating op levensvatbare (LIVE/DEAD-negatief) CD4 + cellen. Om ervoor te zorgen nauwkeurige gating van T-cellen, het uitsluiten van de B220 + en CD11b + cellen (B-cellen en monocyten/macrofagen, respectievelijk). Binnen de CD4 + T-cel populaties, bepalen van het percentage cellen uiting van IFN-γ (Th1 bloedlijn) of IL-17A (Th17 bloedlijn).

6. Adoptief Transfer van pathogene AQP4-specifieke T-cellen

Opmerking: deze stap volgt uit punt 2.5: T cel cultuur en proinflammatoire T cel polarisatie.

  1. Recover gepolariseerde cellen uit 12-Wells-platen door pipetteren omhoog en omlaag om te verjagen, en over te dragen naar een tube van 50 mL. Maintain op ijs tot injecties.
  2. Cellen tellen, wassen tweemaal in koude PBS en maak een suspensie van 1 x 10 8 cellen/mL in PBS. In het algemeen, injecteren cellen binnen het uur.
  3. Zachtjes Meng de cellen door zwenken en overbrengen naar een 1 mL spuit ten tijde van de injectie. Beheren van 200 µL van de cellen (2 x 10 7) intraveneus (i.v.) aan elke muis, via de staart vein.
  4. Injecteer elke ontvangende muis i.p. met 200 ng van B. pertussis toxine verdund in 200 µL van PBS die dag en 2 dagen later. Controleren van muizen dagelijks voor klinische ziektesymptomen.

7. Klinische evaluatie van ATCA

  1. onderzocht ontvangende muizen dagelijks voor klinische symptomen van CNS autoimmuniteit. In het algemeen zullen muizen vertonen tekenen van CNS autoimmuniteit 5-8 dagen na adoptie overdracht van AQP4-specifieke T-cellen. De muizen zal klinische symptomen vertonen van een neurologisch dysfunctie. Het is nuttig voor het uitvoeren van de evaluaties op de muis van een naïef om te definiëren van het normale vermogen van een muis.
  2. Evalueren muizen voor het verlies van de staart Toon. Houd de muizen zachtjes aan de voet van de staart en heffen rechtop. Een staart dat neerhangt voortdurend wordt omschreven als het verlies van de staart tone (score van 1). Verlies van de staart Toon is vaak het eerste teken van klinische ziekte.
  3. Test voor vergissingen reflex door het plaatsen van de muis op zijn rug op een vlakke ondergrond. Langzame wetswijziging is een teken van truncal incoördinatie (score van 2). Een naïeve muis zal volledig weerstaan elke poging om het op zijn rug, zodat elke traagheid in het vermogen naar rechts is scoorde als een dysfunctie. Het is typisch voor de muis 3 - 4 keer voor deze reflex testen.
  4. Evalueren houding en ambulation. Muizen beginnen te tonen van een verandering in houding wat resulteert in een verlaging of het slepen van de heupen tijdens ambulation (score van 2,5). Verdere ziekte resultaten in monoplegia, volledige verlamming van één hind ledematen (score van 3.0) en dwarslaesie, volledige verlamming van beide hind ledematen (score van 3.5). Matige quadraparesis, zwakte van alle vier ledematen, resulteert in erg traag voorwaartse beweging (score 4). Ernstige quadraparesis kan bijna geen voorwaartse beweging (score van 4.5). Ten slotte, met ernstige ziekte kunnen ze ten dode opgeschreven worden of sterven (score van 5).
  5. Beheren met muizen die verliest het vermogen om te verwerven van vloeistof of vast voedsel 1 mL 5% glucose in zoute i.p. anderzijds gebruik suppletie met vloeistof gel bekers, hoge calorische gel en spek softies tegen uitdroging en voedsel ontbering. Stervende muizen euthanaseren.

8. Weefsel voorbereiding en histologie

  1. verdoving muizen met 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine, en vervolgens pin elke struikrover aan een dissectie.
  2. Open op de borst, het hart bloot. Incise van de lever om toe te staan van de uitstroom van het bloed. Een vlinder naald aan de buizen van een miniflow met variabele snelheid pomp met behulp van een apart reservoir voor PBS en 10% formaline koppelen. Steek de naald in het linkerventrikel van het hart en perfuse met 5 mL PBS, gevolgd door 25 mL 10% formaline.
  3. Het hoofd en dan de ogen verwijderen. Proces ogen en netvlies zoals eerder beschreven 20. Dwars door de oogkassen, invoegen van schaar op de neus en de schedel anterior to posterior gesneden aan weerskanten.
    1. Verwijderen van de schedel, de optische zenuwen bloot, snijd de optic opticum en plaats in een cassette tussen 2 schuim pads.
    2. Immerse in 10% formaline (24u), en vervolgens 50% ethanol (24u) en vervolgens transfer naar 70% ethanol.
  4. Verwijderen van hersenen en wervelkolom en plaatsen in 10% formaline. Serieel sectie hersenen in de coronale vlak; sectie spinal koorden in Sagittaal (ongeveer de helft) en seriële coronale vliegtuigen (ongeveer 20 dwarsdoorsneden per muis).
  5. Proces CNS monsters routinematig voor het insluiten van paraffine. Vlekken van 8 µm dik secties met haematoxyline en eosine (optische zenuwen) of Luxol snel blauw-haematoxyline en eosine (hersenen en ruggenmerg).
  6. Evalueren optische zenuwen voor de aanwezigheid van ontsteking in de zenuwen en de omliggende hersenvliezen (neuritis optica) of voornamelijk in de omliggende hersenvliezen (optische perineuritis).
  7. Meningeal en parenchymal inflammatoire foci tellen (> 10 geclusterde mononucleaire cellen) in de hersenen en het ruggenmerg monsters voor elke muis.

9. In Vivo Netvlies Imaging door optische coherentie tomografie (OCT)

Opmerking: spectrale domein OCT retinale beeldvorming van muizen wordt uitgevoerd met behulp van commerciële apparatuur (bijvoorbeeld Spectralis met TruTrack eye tracker) om consistent oculair Oriëntatie en verminderen motion artefacten.

  1. Vijf min vóór imaging, verwijden van leerlingen met 1% tropicamide (1 druppel per oog) en plaats van de muis om het image worden gemaakt in de anesthesie inductie zaal, verstrekken van een gestage stroom van 2 liter per min (1,5% Isofluraan). Inschakelen van warmte mat en voorbereiden van de kooi na verdoving herstel.
  2. Plaatst u de muisaanwijzer op de imaging cilinder en de verdoving stroom dienovereenkomstig te leiden. Bescherm de ogen met 0,3% hydroxypropyl methylcellulose het oog om vochtig te houden en om de continuïteit van de breking. Plaats van een aangepaste contactlens op het oog om te worden onderzocht.
  3. Tochten door het beeld van de infra-rood fundus, direct de laser in het oog, ervoor te zorgen de lichtbundel is gecentreerd op de kop van de oogzenuw. Verticale en horizontale OCT scans moeten bevestigen dat het netvlies loodrecht aan de laser legt.
  4. Uitvoeren 25 B-scans in hoge resolutie modus en rasteren 30 € gemiddeld A-Scans.
  5. Na imaging beide ogen, verwijderen van contactlenzen en toepassen van oogheelkundige gel. Laat de muis in de kooi warme herstel.

10. Verwerking en analyse van LGO

  1. gebruiken de modular denkbaar software voor geautomatiseerde segmentatie.
    1. Handmatig juiste segmenten die overeenkomt met de binnenste membraan (ILM) en Meervormige binnenlaag (IPL) te beperken, die de grenzen van de innerlijke retinal lagen (IRL) 21.
    2. Verifiëren dat de retinale zenuw vezel laag (RNFL) en de ganglion cellaag (GCL) binnen de grenzen van de IRL wonen en elkaar niet overlappen.
  2. Berekenen IRL diktes met het vroege behandeling diabetische retinopathie studie (ETDRS) 2 raster met een diameter van 1, 2 en 3 mm gecentreerd op de optische schijf, en de uitvoer in een spreadsheet-bestand. De software berekent de dikte van elk netvlies laag gemiddelde van elke sector van het raster. Dus het midden segment, overeenkomt met het hoofd van de oogzenuw, is uitgesloten.
  3. Analyseren statistische verschillen tussen de groepen op elk tijdstip. Analyseren van beide ogen voor elke muis, met behulp van generalized schatten van vergelijkingen met een verwisselbare correlatiematrix en aanpassingen voor intra onderworpen Inter oog correlaties 21.

Resultaten

In dit protocol gebruikten we donor T cellen uit C57BL/6 AQP4- / - muizen. Subcutane immunisatie van deze muizen met AQP4 p135-153 of p201-220, die pathogene T-cel epitopen bevatten, ontlokte sterke proliferatieve T cel reacties in zuig lymfklieren (Figuur 1), overwegende dat deze twee peptiden veel zwakkere T-cel veroorzaakte proliferatie in WT muizen. In vergelijking, immunisatie met AQP4 p91-110, met een niet-pathogene AQP4 T cel determinant13, of MOG p35-55, een myeline-peptide dat activeert T-cellen waardoor experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE)22,23 ,24, geïnduceerde vergelijkbare omvang van T-celproliferatie in AQP4- /- en WT muizen. Analyse van TCR-gebruik door stroom cytometry kleuring voor individuele Vβ van of Vβ gezinnen, aangetoond dat p135-153 - en p201-220-specifieke T-cellen van AQP4- / - muizen gebruikt unieke TCR-repertoires. Selectieve hyper-proliferatie van AQP4 p135-153 en p201-220 in AQP4- / - muizen, evenals het unieke TCR gebruik (Figuur 2), aangegeven dat pathogene T cel reacties op deze determinanten gewoonlijk wordt gereguleerd door serie negatief selectie, onderstrepen het belang voor het gebruik van AQP4- / - donor T cellen in dit protocol.

Vóór adoptief overdracht voor inductie van ATCA, werden lymfeklier cellen van AQP4 peptide-primer muizen gekweekt in vitro in Th17 - of Th1-polariserende voorwaarden voor drie dagen. De mate van polarisatie van donor CD4+ T cellen werd bevestigd door intracellulaire cytokine kleuring (ICS) en gemeten door stroom cytometry (Figuur 3). Naïef ontvangende muizen werden intraveneus ingespoten met 2 x 107 donor AQP4 peptide-specifieke T-cellen. Na ongeveer zes dagen ontwikkelde bijna 100% van de ontvangende muizen klinische symptomen van CNS auto-immune ziekte, met inbegrip van slappe staart en hind-limb verlamming (Figuur 4). AQP4-specifieke T-cellen Th17-gepolariseerde geïnduceerde meer ernstige klinische ziekte dan Th1-gepolariseerde AQP4-specifieke T-cellen. Een representatieve muis die ontvangen Th17 AQP4-peptide-specifieke en volledige hind-limb verlamming (dwarslaesie) ontwikkeld wordt weergegeven in de Video 1. In tegenstelling tot de muizen die ontwikkeld EAE na toediening van de MOG-specifieke Th17 cellen, ontvangende muizen van klinische ziekte geïnduceerd door AQP4-specifieke Th17 cellen hersteld. Wat betreft de EAE geïnduceerd door MOG p35-55-specifieke Th17 cellen, klinische ziekte veroorzaakt door AQP4 p135-153-specifieke of p201-220-specifieke Th17 cellen werd geassocieerd met de infiltratie van mononucleaire cellen in het CNS parenchym en hersenvliezen (Figuur 5). Laesies waren meer overvloedig in de hersenvliezen dan in het parenchym voor CNS autoimmuniteit geïnduceerd door AQP4-specifieke Th17 cellen.

Optic nerve betrokkenheid werd aangetoond door histologische evaluatie en door seriële OCT. AQP4-specifieke en MOG-specifieke Th17 cellen beide geïnduceerde oogzenuw ontsteking, die werd gekenmerkt door de aanwezigheid van mononucleaire cellen. Overwegende dat de AQP4-specifieke Th17 cellen veroorzaakt optische perineuritis, veroorzaakte MOG-specifieke Th17 cellen ernstige neuritis optica (Figuur 5). Met behulp van seriële OCT, oogzenuw ontsteking bleek door zwelling en verhoogde innerlijke netvlies (IRL) laagdikte voor klinische ziekte veroorzaakt door AQP4-specifieke of MOG-specifieke Th17 cellen (Figuur 6). Voor CNS AQP4 Th17-geïnduceerde auto-immuniteit, IRL dikte keerde terug naar basislijn als muizen van klinische ziekte hersteld. In tegenstelling, persistentie van EAE geïnduceerd door MOG-specifieke Th17 correspondeerde met IRL dunner en, zoals we eerder17 blijkt, werd geassocieerd met verlies van retinale peesknoopcellen.

figure-results-1
Figuur 1 : AQP4 p135-153 en p201-220 ontlokken robuuste T-celproliferatie in AQP4- / - muizen, maar niet WT muizen. Muizen werden geïmmuniseerd s.c. met de aangegeven peptiden in CFA. Elf dagen later, waren lymfklieren verwijderd, en vervolgens gekweekt met ofwel geen antigeen of met de peptide gebruikt voor immunisatie. Proliferatie werd gemeten door 3H-thymidine opneming (gemiddelde ± SEM, vertegenwoordiger van 5 experimenten). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2 : AQP4-specifieke T-cellen van AQP4- / - muizen gebruiken unieke TCR-repertoires. AQP4- /- en WT muizen werden geïmmuniseerd met de aangegeven peptiden. Elf dagen later, waren de lymfklieren verwijderd en gekweekt met peptide gebruikt voor immunisatie. Cellen zijn geoogst. TCR Vβ gebruik werd geanalyseerd door stroom cytometry (bedoel ± SEM, n = 5). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3 : Proinflammatoire polarisatie van donor AQP4-specifieke T-cellen. Elf dagen na immunisatie met AQP4 p135-153 of p201-220, werden lymfeklier cellen geoogst en gekweekt met de peptide gebruikt voor immunisatie in niet-polariserende voorwaarden, Th1 - of Th17-polariserende. Th17 of Th1 polarisatie werd onderzocht door ICS en stroom cytometry voor IL-17 of IFN-γ, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4 : Th17-gepolariseerde AQP4-specifieke T-cellen veroorzaken verlamming in WT ontvangende muizen. WT ontvangende muizen ontvangen 2 x 107 donor Th17-gepolariseerde AQP4 p135-153 of p201-220-specifieke T-cellen AQP4- / - muizen. MOG-specifieke T-cellen Th17-gepolariseerde diende als positieve controle. Resultaten representatief zijn voor 8 experimenten (n = 5/groep). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-5
Figuur 5 : AQP4-specifieke Th17 cellen induceren opticospinal ontsteking in WT muizen. Ontvangende muizen ontvangen 2 x 107 Th17 AQP4 donor p135-153 - of p201-220-primer Th17 cellen van AQP4- / - muizen of Th17 MOG p35-55-specifieke cellen en 10 dagen later werden geofferd. Ruggenmerg en oogzenuw weefsels waren voorbereid en gekleurd met H & E/LFB te evalueren voor bewijs van ontsteking en demyelinisatie, respectievelijk. Resultaten zijn representatief voor 5 muizen/groep. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-6
Figuur 6 : Ontsteking van de oogzenuw geïnduceerd door AQP4-specifieke Th17 cellen kan worden gecontroleerd door de longitudinale retinale oktober WT ontvangende muizen ontvangen 2 x 107 donor Th17-gepolariseerde AQP4 p201-220-specifieke of MOG p35-55-specifieke T-cellen op dag 0. Ze werden onderzocht door LGO op dag 0 (vóór administratie van T-cellen) en klik vervolgens op dagen 4, 7, 8, 9-10, 11 14 en 21. IRL dikte was gemeten (gemiddelde ± SEM). Statistieken tonen aan dat een vergelijking met naïef controle. Resultaten zijn representatief voor 3 experimenten (5 muizen/group). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

AQP4 werd aangeduid als de primaire doelgroep in de NMO-IgG in 20053. Vervolgens werd erkend dat het belangrijk is om een AQP4-gerichte diermodel van CNS autoimmuniteit zou zijn. Een dergelijk model zou nuttig zijn te onderzoeken hoe AQP4-specifieke T en B cellen deelnemen aan de ontwikkeling van CNS autoimmuniteit en kandidaat-therapeutics testen op NMO. Hoewel identificatie van AQP4-specifieke T cel epitopen in wild-type muizen werd voor het eerst gemeld in 201013, T-cellen die reageren op deze epitopen niet door ziekte klinische en histologische14,17 veroorzaakt. Het onvermogen om het genereren van een model van CNS autoimmuniteit gebaseerd op Immuunreactiviteit te AQP4 een raadsel bleef tot 2015 wanneer Jones, et al.. 25 ontdekt dat de donor AQP4 p135-153-primer T cellen van AQP4- / - muizen waren waardoor klinische en histologische tekenen van CNS autoimmunity in WT muizen. Van belang, is AQP4 p135-153 voorspeld MHC II (ik-A-b) bindt met hoge affiniteit17. Slechts één andere AQP4 aminozuur opeenvolging, 201-220, is voorspeld dat ik-A-b met vergelijkbare hoge affiniteit binden. Inderdaad, we hebben vastgesteld dat AQP4 p135-153 en p201-220 beide ontlokken robuuste proliferatie in AQP4- / -, maar niet WT, muizen. Hier hebben wij aangetoond hoe een kunt isoleren en encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - en p201-220-reactieve T cellen van AQP4- / - muizen uit te breiden. Wanneer overgebracht in WT ontvangende muizen, geïnduceerde donor AQP4-reactieve Th17 cellen verlamming, die werd vergezeld door mononucleaire cellen infiltreert in het ruggemerg en de oogzenuw. Afferent visuele systeem schade is bekend bij patiënten met AQP4-seropositieve NMOSD26. Hier, vastgesteld we hebben dat ontsteking van de oogzenuw geïnduceerd door AQP4-reactieve en MOG-reactieve Th17 cellen werd onderscheiden. Overwegende dat de AQP4-specifieke Th17 cellen geïnduceerde optische perineuritis, veroorzaakte MOG-specifieke Th17 cellen ernstige neuritis optica. Wij hebben ook de technieken gebruikt voor het bewaken van de oogzenuw ontsteking geïnduceerd door AQP4-specifieke en MOG-specifieke T-cellen door seriële LGO beschreven. Andere onderzoekers moeten nu zitten kundig voor toepassing van de protocollen die hier beschreven om verder te gaan van hun eigen studies gericht op pathogene mechanismen van ATCA.

Men kan gemakkelijk vermijden drie potentiële valkuilen in ons protocol. Eerste, adoptief overdracht van ATCA vereist gebruik van AQP4-specifieke T-cellen van AQP4- / - muizen van de donor. Specifiek, veroorzaakt donor WT AQP4 p135-153-specifieke T-cellen niet door ATCA in ontvangende WT muizen. Ten tweede, is het belangrijk om uit te voeren van een 'water-test' met een daling van de peptide/CFA-emulsie voor immunisatie van AQP4- / - muizen (Protocol stap 1.5). De emulsie moet niet verspreiden in water, wanneer het is geschikt voor s.c. injectie. Als de emulsie verspreidt, moet een mix van de emulsie nogmaals, chill opnieuw en herhaal de water-test. Tot slot, geactiveerde donor CNS antigeen-specifieke T-cellen veroorzaken CNS autoimmuniteit efficiënter dan rusten T-cellen. Men moet visueel inspecteren die culturen onder de lichte Microscoop vóór de oogst van de donor T cellen voor adoptief overdracht. Snel delen cellen kan vormen clusters, die gemakkelijk worden geïdentificeerd. Ook, wanneer culturen veel geactiveerde T-cellen bevatten, de media kan de overgang van roze tot oranje of zelfs tot geel, als gevolg van de afname van de pH. Een kan ook activering van donor AQP4-primer lymfeklier T cellen voor proliferatie beoordelen door 3H-thymidine opneming, zoals beschreven in stap 3 van Protocol.

Onze ontdekking dat de twee pathogene AQP4 T-cel epitopen zijn (1) voorspeld MHC II met hoge affiniteit binden en (2) ontlokken potente proliferatieve reacties in AQP4- / -, maar niet WT, muizen suggereren dat T-cellen gericht op die determinanten normaal zijn gecontroleerd door serie negatieve selectie17. De TCR-repertoires gebruikt voor erkenning van AQP4 p135-153 en p201-220 in AQP4- / - muizen zijn unieke (figuur 2), die is ook in overeenstemming met klonen schrapping gemedieerd door serie Wallenberg epitheliale cellen. Andere tolerogenic mechanismen kunnen normaal immuun reacties op AQP4 beperken. Na onze eerste verslag17, een andere groep ook aangetoond dat AQP4 p201-220 een encephalitogenic T-cel determinant27 bevat. Wanneer α/β (TCRα- / -) T-cel-deficiënte muizen werden gereconstitueerd met AQP4- / - CD4+ T cellen, was het mogelijk om het uitlokken van een reactie van encephalitogenic AQP4-specifieke T cel, maar niet een AQP4-specifieke Humorale respons, wat inhoudt dat in WT muizen AQP4-specifieke B-cel reacties, vergelijkbaar met AQP4-specifieke T cel reacties, zijn onderworpen aan negatieve selectie. Inderdaad, kan verlies van ruggenmerg axonen en RGCs, die niet was waargenomen in WT muizen met ATCA geïnduceerd door AQP4-specifieke T-cellen alleen, deelname van pathogene AQP4-specifieke antilichamen vereisen. Het is duidelijk dat Muismodellen voor AQP4-gerichte CNS autoimmuniteit evolueren blijven zal als we meer informatie met betrekking tot de mechanismen van de tolerogenic normaal gesproken controle AQP4-specifieke T cel- en B-cel-immuniteit.

Andere modellen van AQP4-gerichte CNS autoimmuniteit worden ook ontwikkelde6,16,28,29,30. Ieder kan bieden voordelen voor de studie van bepaalde aspecten die relevant voor NMO pathogenese zijn. AQP4-specifieke T-cellen zijn geïdentificeerd in WT ratten6,16,29. Die AQP4-specifieke T-cellen veroorzaakt histologische wijzigingen van CNS autoimmuniteit, maar vergelijkbaar met opmerkingen in muizen, WT rat AQP4-specifieke T-cellen niet leiden tot significante tekenen van klinische ziekte. Daarom zijn de mechanismen van tolerantie beperken van T-cel- en B-cel AQP4-specifieke immuunresponsen bij WT muizen ook operationele bij ratten. Hoe dan ook, een niet te onderschatten de kracht bij het gebruik van Muismodellen voor de studie van de mechanismen die betrokken zijn bij de pathogenese van de ziekte. De rijkdom van de knock-out, transgene en verslaggever muizen kan nuttig zijn. Het moet ook worden erkend dat verscheidene fundamentele ontdekkingen in autoimmuniteit werden gemaakt met behulp van de muis EAE modellen. Bijvoorbeeld, demonstratie dat T-cell klonen specifiek voor een zelf-antigeen kan bemiddelen auto-immuunziekte31,32, identificatie van de rol van T-cel costimulatie in autoimmuniteit33 en de ontdekking van de ontwikkelings traject voor Th17 differentiatie34 werden eerst beschreven met behulp van de muis EAE modellen. Met behulp van de muismodel van ATCA die we hebben ontwikkeld, heeft een nu de middelen om ontwikkeling en regulering van de pathogene AQP4-specifieke immuunresponsen in vivo studie die belangrijke inzichten aan NMO pathogenese gerelateerde moet zorgen.

Openbaarmakingen

S.A. Sagan, A. Cruz-Herranz C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, A.J. Green en R.A. Sobel verslag geen informatieverschaffing. S.S. Zamvil is adjunct hoofdredacteur van neurologie, Neuroimmunology en Neuroinflammation en is een lid van de adviesraad voor de internationale maatschappij van Neuroimmunology. Hij is heeft betekend aan de Editorial Board van de Journal of Clinical Investigation, The Journal of Immunology and The Journal van neurologische Sciences, en een Handvest lid van het Comité van het overzicht subsidie voor de nationale instituten Tumoren van de hersenen (CNBT) of Health (NIH) klinische Neuroimmunology door sectie en de National Multiple Sclerosis Society (NMSS) te bestuderen. Hij heeft gediend als consultant en honoraria van Biogen Idec, EMD-Serono Genzyme, Novartis, Roche/Genentech en Teva Pharmaceuticals, Inc., ontvangen en heeft gediend of zetelt in gegevens veiligheid Monitoring raden voor Lilly, BioMS, Teva en Opexa Therapeutics. Op dit moment ontvangt Dr. Zamvil onderzoek financiële steun uit de NIH, NMSS, The Maisin Foundation, Biogen en Celgene.

Dankbetuigingen

Steun werd verleend aan S.S.Z. door het National Institute of Health (RO1 AI073737 en RO1 NS092835-01), National Multiple Sclerosis Society (RG 4768, RG 5179 en RG 5180), Maisin Foundation en Guthy Jackson Charitable Foundation.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
M. tuberculosis H37RaBD Difco231141Gedroogde, gedode M. tuberculosis
Incomplete Freund's AdjuvantBD Difco263910
AQP4 peptide p135-153GenemedCustom SynthesisPeptidesequentie: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220GenemedCustom SynthesisPeptidesequentie: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55Genemed / AuspepCustom SynthesisPeptidesequentie: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way StopcockKimble420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Gekarakteriseerd)GE Healthcare Life SciencesSH30071
Recombinant Muis IL-23R&D Systems (BioTechne)1887-ML
Recombinant Muis IL-6R&D Systems (BioTechne)406-ML
Recombinant Muis IL-12R&D Systems (BioTechne)419-ML
Thymidine [Methyl-3H]PerkinElmerNET027
Glass Fiber FiltermatsPerkinElmer1450-421
Anti-muis antilichameneBioscience (Affymetrix)[various]
Anti-muis TCR Vβ Screening PanelBD Biosciences557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell StainThermoFisher Scientific[various]
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
Fixatie/Permeabilisatie Oplossing Kit met GolgiPlugBD Biosciences555028
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)Sigma-AldrichP8139
Iomomycin (calciumzout)Sigma-AldrichI0634
Pertussis Toxine van B. pertussisList Biological Laboratories181
10% FormalineVWR89370-094
Variabele-Flow Peristaltische PompFisher Scientific13-876-2
Foam Biopsy Pads, RechthoekigFisher Scientific22-038-221
Isothesia (isofluraan, USP)Henry Schein Animal Health050033NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmisch Oplossing, USP (1%)AkornNDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostisch Beeldvorming PlatformHeidelberg Engineering

Referenties

  1. Hardy, T. A., et al. Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS. Lancet Neurol. 15 (9), 967-981 (2016).
  2. Lennon, V. A., et al. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet. 364 (9451), 2106-2112 (2004).
  3. Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel. J Exp Med. 202 (4), 473-477 (2005).
  4. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), 62(2015).
  5. Bennett, J. L., et al. Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica. Ann Neurol. 66 (5), 617-629 (2009).
  6. Bradl, M., et al. Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo. Ann Neurol. 66 (5), 630-643 (2009).
  7. Nurieva, R. I., Chung, Y. Understanding the development and function of T follicular helper cells. Cell Mol Immunol. 7 (3), 190-197 (2010).
  8. Lucchinetti, C. F., et al. The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica. Brain Pathol. 24 (1), 83-97 (2014).
  9. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (4), 110(2015).
  10. Brum, D. G., et al. HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis. Mult Scler. 16 (1), 21-29 (2010).
  11. Varrin-Doyer, M., et al. Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter. Ann Neurol. 72 (1), 53-64 (2012).
  12. Vaknin-Dembinsky, A., et al. T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO). Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).
  13. Nelson, P. A., et al. Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica. PLoS One. 5 (11), 15050(2010).
  14. Kalluri, S. R., et al. Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica. PLoS One. 6 (1), 16083(2011).
  15. Pohl, M., et al. Pathogenic T cell responses against aquaporin 4. Acta Neuropathol. 122 (1), 21-34 (2011).
  16. Zeka, B., et al. Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS. Acta Neuropathol. 130 (6), 783-798 (2015).
  17. Sagan, S. A., et al. Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (51), 14781-14786 (2016).
  18. Vita, R., et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 43, Database issue 405-412 (2015).
  19. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  20. Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry. J Vis Exp. (82), e51018(2013).
  21. Cruz-Herranz, A., et al. The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies. Neurology. 86 (24), 2303-2309 (2016).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur J Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).
  23. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).
  24. Molnarfi, N., et al. MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med. 210 (13), 2921-2937 (2013).
  25. Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica. Acta Neuropathol Commun. 3, 28(2015).
  26. Oertel, F. C., et al. Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD. Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72(2017).
  27. Vogel, A. L., et al. Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice. Eur J Immunol. , (2017).
  28. Zhang, H., Verkman, A. S. Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59. J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).
  29. Zeka, B., et al. Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 82(2016).
  30. Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G. J Neuroinflammation. 13 (1), 275(2016).
  31. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
  32. Zamvil, S. S., et al. Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition. J Exp Med. 162 (6), 2107-2124 (1985).
  33. Kuchroo, V. K., et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy. Cell. 80 (5), 707-718 (1995).
  34. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Aquaporine 4 T cellenneuromyelitis optica modelTh17 polarisatieadoptieve T celoverdrachtoptische coherentietomografieflowcytometrieanalyseAQP4 knockoutmuizenisolatie van lymfeklierenpeptide immunisatieB pertussistoxine

Gerelateerde artikelen