Methodenartikel

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

15.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56186

⸱

29 augustus 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC), University of Cologne, 2Cologne Center for Genomics (CCG), University of Cologne, 3Cologne Excellence Cluster for Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), Research Center and Systems Biology of Ageing Cologne, University of Cologne

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Samenvatting

Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een veel gebruikte techniek voor het toewijzen van de lokalisatie van post-translationally gemodificeerde histonen, histone varianten, transcriptiefactoren of enzymen chromatine-aanpassen aan een bepaald locus of op een genoom-brede schaal. De combinatie van ChIP tests met volgende-generatie sequencing (dat wil zeggen, ChIP-Seq) is een krachtige aanpak van gene regulerende netwerken wereldwijd te ontdekken en ter verbetering van de functionele annotatie van genomen, met name van niet-coderende regulerende sequenties. ChIP protocollen kunnen doorgaans alleen grote hoeveelheden van celmateriaal, dus de uitschakeling van de toepasselijkheid van deze methode op het onderzoek naar zeldzame celtypes of kleine weefsel biopsieën. Om de ChIP bepaling verenigbaar is met de hoeveelheid biologisch materiaal dat doorgaans worden in vivo tijdens de vroege gewervelde embryogenese verkregen kan, beschrijven wij hier een vereenvoudigde ChIP protocol waarin het aantal stappen wilt uitvoeren, moet de assay werden gereduceerd monster verlies te minimaliseren. Dit protocol ChIP is met succes gebruikt om het onderzoeken van verschillende histone modificaties in verschillende embryonale kip en volwassen muis weefsels met behulp van lage aan middelgrote cel nummers (5 x 104 - 5 x 105 cellen). Nog belangrijker is, dit protocol is compatibel met ChIP-seq-technologie met behulp van de standaard bibliotheek bereidingswijzen, waardoor wereldwijde epigenomic kaarten in zeer relevant embryonale weefsels.

Inleiding

Histon posttranslationele modificaties zijn rechtstreeks betrokken bij diverse chromatine-afhankelijke processen, met inbegrip van transcriptie, replicatie en DNA repair1,2,3. Bovendien verschillende histone modificaties positieve Toon (b.v., H3K4me3 en H3K27ac) of negatief (bijvoorbeeld H3K9me3 en H3K27me3) correlaties met genexpressie en in grote lijnen gedefinieerd kunnen worden als activerende of repressieve Histon markeert, respectievelijk2,3. Bijgevolg, global Histon wijziging kaarten, ook wel aangeduid als epigenomic kaarten, opgedoken als krachtige en universele instrumenten functioneel aantekeningen gewervelde genoom4,5. Bijvoorbeeld, distale regulerende sequenties, zoals versterkers kunnen worden geïdentificeerd op basis van de aanwezigheid van specifieke chromatine handtekeningen (bijvoorbeeld actieve smaakversterkers: H3K4me1 en H3K27ac), die hen onderscheiden van proximale promotor regio's (b.v., actieve promotoren: H3K4me3)6,7,8. Aan de andere kant, worden genen met grote cel identiteit regelgevende taken meestal gevonden met brede chromatine domeinen gemarkeerd met H3K4me3 of H3K27me3, afhankelijk van de transcriptionally actieve of inactieve status van de onderliggende genen, respectievelijk9 ,10. Ook lijkt de expressie van genen die grote cel identiteit te worden regelmatig gecontroleerd door meerdere en ruimtelijk geclusterd versterkers (dat wil zeggen, de Super-versterkers), die kunnen worden geïdentificeerd als brede H3K27ac-gemarkeerd domeinen11.

Momenteel, worden histone wijziging kaarten gegenereerd met behulp van de ChIP-seq-technologie, die in vergelijking met de vorige benaderingen zoals ChIP-chip (ChIP gekoppeld aan microarrays) hogere resolutie, minder artefacten, minder lawaai, meer dekking en lagere biedt kost12. Niettemin, de generatie van epigenomic kaarten met behulp van de ChIP-seq technologie heeft haar inherente beperkingen, meestal gekoppeld aan het vermogen om met succes uitvoeren ChIP in de monsters van belang. Traditionele ChIP protocollen vereist meestal miljoenen cellen, welk grensbedrag de toepasselijkheid van deze methode naar de cel in vitro lijnen of cellen die gemakkelijk geïsoleerd in vivo (bijvoorbeeld bloedcellen worden kan). In de afgelopen jaren zijn een aantal gemodificeerde ChIP protocollen compatibel met lage cel nummers beschreven13,14,15,16. Echter, deze protocollen zijn speciaal ontworpen om te worden gekoppeld met de volgende-generatie sequencing (dat wil zeggen, ChIP-seq), en zij gebruiken meestal ad hoc bibliotheek voorbereiding methoden13,14, 15 , 16.

Hier, we een ChIP protocol dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van Histon wijziging profielen met behulp van lage tot tussentijdse cel nummers (5 x 104 - 5 x 10,5 cellen) beschreven op beide geselecteerde loci (dat wil zeggen, ChIP-qPCR) of wereldwijd (dat wil zeggen, ChIP-seq) (Figuur 1). Wanneer gekoppeld aan ChIP-seq technologie, kan onze ChIP-protocol worden gebruikt samen met de standaard bibliotheek bereidingswijzen, waardoor het voor veel laboratoria10breed toegankelijk. Dit protocol is gebruikt voor het onderzoeken van verschillende Histon merken (bijvoorbeeld, H3K4me3, H3K27me3 en H3K27ac) in verschillende kip embryonale weefsels (bijvoorbeeld spinale neuraalbuis (SNT) uitsteeksels van de frontonasal en epiblast). Wij verwachten echter dat het breed toepasbare naar andere organismen in die biologisch en/of klinisch relevante monsters kunnen slechts worden verkregen in lage bedragen moet zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

volgens de richtlijnen van de Duitse dierenverzorgers, geen goedkeuring dier zorginstellingen en gebruik Comité (IACUC) moest de kip embryo experimenten uit te voeren. Volgens de lokale richtsnoeren, heeft alleen de experimenten met kip HH44 (18-daagse) embryo's en oudere IACUC goedkeuring vereist. De embryo's gebruikt in deze studie waren echter al in eerdere stadia van embryonale ontwikkeling (dat wil zeggen, HH19 (72 h)).

Opmerking: het doel van dit protocol is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van de ChIP test zodat effectief kan worden gecombineerd met de qPCR of de volgorde van de volgende-generatie (dat wil zeggen, ChIP-seq) te onderzoeken histone modificaties lage-overvloed embryonale monsters (variërend van 5 x 10-4-5 x 10 5 cellen voor elke ChIP reactie) en verschillende weefseltypes (HLA) ( Figuur 1). Het protocol dient te gelden tot het onderzoeken van de profielen van de bindende transcriptiefactoren en co activators (bijvoorbeeld p300). Nochtans, wegens de lagere overvloed van deze regelgevende proteïnen, grotere cel nummers dreigen te worden vereist (5 x 10 5 - 5 x 10 6 cellen voor elke ChIP-reactie).

1. voorbereiding van de eieren en Microdissection van de SNT kip

Opmerking: de procedure voor het microdissections technisch verschilt van weefsel tot weefsel en van diermodel aan dierlijk model. Deze sectie beschrijft in detail de dissectie-protocol gebruikt voor het verkrijgen brachialis SNT secties fase-HH19 kip embryo's als voorbeeld.

  1. Vruchtbare witte Livorno kippeneieren, een lokale kweker, in horizontale richting bij 37 ° C en 80% vochtigheid voor 3 dagen om fase-HH19 kip embryo's verkregen Incubeer.
  2. Bepalen de stadia volgens de Hamburger en Hamilton kip embryonale developmental tijdelijke systeem 17.
  3. Alle microdissections onder koude omstandigheden uit te voeren; anders chromatine integriteit zou kunnen worden aangetast.
  4. Isoleren van de embryo's van HH19.
    1. Toegankelijk wilt maken de embryo's, uittreksel albumine met een 10 mL injectiespuit met een naald (0.90 x 40 mm) te verlagen van de blastoderm 3 mL.
    2. Maken van een kleine opening in het ei met behulp van fijn schaar en voeg 1 mL Locke oplossing (Zie de Aanvullende materialen voor het recept) ter vergemakkelijking van de afschaffing van de extra-embryonale vliezen.
    3. 10% Indiase zwarte inkt/Locke oplossing injecteren met behulp van een injectiespuit 1 mL met een naald (0,55 x 25 mm 2) onder de blastoderm om de visualisatie van de embryo's gemakkelijker.
    4. Afgesneden van de extra embryonale membraan dat omringt het embryo met behulp van medische chirurgische fijne schaar en pincet.
    5. Een geperforeerde lepel gebruiken voor het overbrengen van het embryo tot een 4,5 cm petrischaal met 20 mL voor 1 x PBS oplossing.
  5. Ontleden weg het amnion en de resterende delen van extra embryonale membraan met behulp van fijn schaar en pincet onder een stereomicroscoop.
  6. Knippen van de dwarse SNT-segment op de brachialis niveau van het embryo, caudally uit te breiden in de thoracale regio te isoleren van de SNT ( Figuur 2).
  7. Weefsels die lateraal/ventrally de SNT (bijvoorbeeld laterale plaat mesoderm ectoderm, chorda en aorta omringen) verwijderen met pincet ( Figuur 2).
  8. Onderdompelen van elk segment van de SNT ontleed kip in een 3,5 cm petrischaal met 5 mL warm (37 ° C) trypsine (trypsine/EDTA oplossing 1:250).
  9. Stoppen de trypsine behandeling wanneer versoepeling van de niet-zenuwweefsel rond de SNT wordt aangetroffen onder een stereomicroscoop.
    Opmerking: De tijd van de trypsinebehandeling moet worden streng gecontroleerd om te voorkomen dat de overmatige spijsvertering en verspreiding van zenuwweefsel en te handhaven van de structurele integriteit van de SNT.
  10. Na de behandeling van de trypsine, verwijderen de resterende mesenchymale en ectodermal weefsels handmatig om te bereiden op het reine gedeelte van de SNT.
  11. De SNT sectie overbrengen in een tube van 1,5 mL en flash-freeze het in vloeibare stikstof. Zodra voldoende SNT secties zijn opgebouwde (zwembad de SNT van ~ 30 kip embryo's voor één ChIP reactie afdelingen), bewaren bij -80 ° C.
    Opmerking: Als voldoende embryonaal weefsel (dat wil zeggen, 5 x 10 5-5 x 10 6 cellen) kan worden ontleed van één of een paar kip embryo's, en vervolgens invriezen is niet nodig en is het mogelijk om door te gaan rechtstreeks naar de volgende stappen. Raadpleeg de gids voor probleemoplossing in tabel 1.
    Opmerking: Let op! Vloeibare stikstof heeft een extreem lage temperatuur, adequate bescherming dragen.

2. Crosslinking eiwitten aan DNA: dag 1

Opmerking: uitvoeren van alle stappen op het ijs, tenzij anders vermeld.

  1. Toevoegen 500 µL van DMEM met 10% FBS en 10 µL van 1 M nb-butyraat rechtstreeks naar het bevroren weefsel of, subsidiair, onmiddellijk aan het vers ontleed weefsel. Meng de cellen door schorsing opnieuw zachtjes met een pipet 1 mL.
    Opmerking: De toevoeging van de nb-butyraat is optioneel maar aanbevolen als Histon acetylation onderzoeken. In plaats van DMEM - 10% FBS, kunnen monsters worden resuspended in 1 x PBS met 0,1% BSA. De toevoeging van FBS of BSA is optioneel, maar het vergemakkelijkt de monsters in de daarop volgende centrifugeren stappen pillering.
  2. Toevoegen van 13,5 µL van 37% formaldehyde (1% formaldehyde def.) en plaats deze op een rotator gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Let op! Formaldehyde is toxisch.
  3. Toevoegen van 25 µL van 2,5 M glycine aan de buis en plaats deze op een rotator gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te quench de formaldehyde.
  4. Draai de buis bij 850 x g gedurende 5 min bij 4 ° C in een centrifuge tafelblad. Verwijder het supernatant.
  5. Wassen van de pellet eenmaal met 500 µL van koude versbereide wassen buffer (Zie de Aanvullende materialen voor het recept), centrifuge op 850 x g- en 4 ° C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.

3. Lysis en ultrasoonapparaat

  1. voorbereiden volledige lysis buffer (LB) (Zie de Aanvullende materialen voor het recept) en chill op ijs. Gebruik voor 1 mL, 950 µL van LB, 40 µL van protease inhibitor concentraat (25 x) en 10 µL van 100% PMSF.
  2. Resuspendeer de pellet in 300 µL van volledige LB door pipetteren en plaats deze op een rockende platform voor 10 min bij 4 ° C.
  3. Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters met de volgende instellingen: Temp = 4 ° C, Total time = 7 minuten, “ op ” interval = 30 s, “ uit ” interval = 30 s, amplitude = 25%
    Opmerking: Ultrasoonapparaat voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor elk weefsel en zal variëren afhankelijk van de ultrasoonapparaat gebruikt. Het is aanbevolen om de laagste ultrasoonapparaat instellingen gebruikt die resulteren in sheared DNA variërend van 200 tot 600 bp in grootte. Schuintrekken varieert afhankelijk van weefseltype, quantiTy, ultrasoonapparaat volume crosslinking voorwaarden en apparatuur. Raadpleeg de gids voor probleemoplossing in tabel 1.
  4. Spin het sonicated monster bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het cellulaire puin pellet.
  5. Het lysate (supernatant) overbrengen in een verse tube 1.5-mL.
    Opmerking: Als de grondstof wordt geacht voldoende voor twee ChIP experimenten, dan 300 µL van volledige LB kunnen worden toegevoegd aan de sonicated chromatine (dat wil zeggen, eindvolume: 600 µL).
  6. Toevoegen 30 µL van 10% octylfenol ethoxylaat voor elke 300 µL van sonicated lysate (uiteindelijke concentratie: 1%) en meng door pipetteren.
    Opmerking: Let op! Octylfenol ethoxylaat is acuut toxisch (orale, dermale, inhalatie).

4. Antilichaam-incubatie

  1. Aliquot de 330 µL van sonicated lysate in twee 1.5-mL buizen: 300 µL voor ChIP en 30 µL als de invoercontrole (10% van de grondstoffen). Winkel de " 30 µL invoercontrole monster " bij -20 ° C.
    Opmerking: Als twee ChIP reacties van hetzelfde monster, uitgevoerd dan de 660 µL van sonicated lysate kunnen worden verdeeld in drie 1,5 mL buizen (300 µL voor ChIP #1, 300 µL voor ChIP #2 en 60 µL als besturingselement voor tekstinvoer (20% van de grondstof van elke ChIP) ).
  2. 3-5 µg van antilichaam aan de 300 µL van sonicated chromatine aliquoot en omkeren te mengen toevoegen.
    Opmerking: In deze studie, elke ChIP reactie werd uitgevoerd met een antilichaam specifiek voor Histone H3 tri gemethyleerd op K4 (H3K4me3), Histone H3 di gemethyleerd op K4 (H3K4me2), Histone H3 tri gemethyleerd op K27 (H3K27me3), en Histone H3 tri acetylation op K27 (H3K27me3). Het succes van dit protocol is volledig afhankelijk van de kwaliteit van het antilichaam gebruikt. Het antilichaam moet specifieke en efficiënt op de immunoprecipitation van een specifieke proteïne. Het is belangrijk om te bepalen van het bedrag van antilichaam die kan worden gebruikt om immunoprecipitate de kruisverwijzende eiwit-DNA complex. De specificiteit van het antilichaam kan ook worden gecontroleerd door westelijke vlek om ervoor te zorgen dat het juiste eiwit wordt gedetecteerd. Een antilichaam dat meerdere niet-specifieke banden detecteert wordt niet aanbevolen voor ChIP.
  3. Plaats de buis op een rockende platform bij 4 ° C's nachts (12-16 h) te binden het antilichaam aan de chromatine.
    Opmerking: Raadpleeg de gids voor probleemoplossing in tabel 1.

5. Voorbereiding van magnetische kralen: dag 2

  1. aliquoot 50 - 100 µL van eiwit G/magnetische kraal drijfmest voor elke reactie ChIP in een 1,5 mL microfuge buis op ice.
  2. Wassen de magnetische kralen driemaal met een koud blok oplossing (Zie de Aanvullende materialen voor het recept) (4 ° C). Voeg 500 µL van het koude blok oplossing en meng door omkeren of flicking. De buis gestoken met een Magneethouder en wacht op de kralen te vestigen aan de kant van de buis. Giet af de heldere vloeistof en herhaal. Na de laatste wash, verwijder alle vloeistof met een gel-laden tip.

6. Immunoprecipitation van de chromatine

  1. de 300 µL van de antilichaam-afhankelijke chromatine toevoegen aan de gewassen kralen en omkeren als u wilt mengen.
  2. Roteren verticaal op een buis rotator bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur het antilichaam binding met de kralen.

7. Wassen, Elueer en Reverse de Crosslinks

  1. Wash de Buffer RIPA Chill (Zie de Aanvullende materialen voor het recept) op ijs, zet het waterbad tot 65 ° C, en precool de centrifuge tot en met 4 ° C.
  2. Wassen van de chromatine-gebonden kralen viermaal in 1 mL koud wassen de Buffer RIPA en houd op ijs. Om dit te doen, voeg toe 1 mL koude RIPA was Buffer en meng door omkeren of flicking. Plaats de buis in de magnetische houder en wachten op de kralen te vestigen aan de kant van de buis. Giet af de heldere vloeistof en herhaal.
    Opmerking: Het aantal wasbeurten met de Buffer RIPA Wash mogelijk moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van het type monster, monster overvloed en antilichaam wordt gebruikt. Een toenemend aantal wasbeurten zal verminderen de achtergrond maar zal ook daling van de totale hoeveelheid herstelde DNA, waardoor downstream analyse per qPCR of ChIP-seq. in gevaar kan komen
  3. Voeg 1 mL TE/50 mM NaCl aan de buis en de parels van de chromatine-gebonden in TE/50 mM NaCl overbrengen in een verse 1.5-mL microfuge buis voor het verwijderen van de vloeistof met behulp van de magnetische houder, zoals hierboven beschreven.
  4. Spin de kralen bij 900 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, de buis terug in de magnetische houder plaatsen en verwijderen van alle resterende TE met een gel-laden tip.
  5. Toevoegen 210 µL van elutie buffer (Zie de Aanvullende materialen voor het recept) bij kamertemperatuur en resuspendeer door flicking.
  6. Elute gedurende 15 minuten bij 65 ° C in een blok van de warmte terwijl schudden.
  7. Draaien de kralen bij 16.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en plaats de buis in de Magneethouder.
  8. Het supernatant (~ 200 µL) overbrengen met een verse microfuge buis, zodra de kralen hebben geregeld.
  9. Ontdooien de invoercontrole monsters (30 µL) van-20 ° C tot kamertemperatuur (bevroren in stap 4.1), voeg 3 delen elutie buffer (90 µL), en meng door kort vortexing.
  10. Broeden de chip en controle monsters bij 65 ° C's nachts (12-16 h) om te keren de crosslinks.

8. Digest cellulaire eiwitten en RNA: dag 3

  1. 8.1At kamertemperatuur, 1 deel TE buffer per buis (te verdunnen de SDS) toevoegen en omkeren als u wilt mengen: Voeg 120 µL van TE 120 µL van controlemonster en 200 µL voor TE tot 200 µL van het monster ChIP.
  2. Toevoegen RNase A aan een definitieve concentratie van 0,2 mg/mL en omkeren te mengen: Voeg 2.4 µL van 20 mg/mL RNase A 240 µL van controlemonster en 4 µL van 20 mg/mL, RNase A 400 µL van het monster ChIP.
  3. Broeden de buizen bij 37 ° C in een waterbad voor 2 h te verteren het RNA.
  4. Toevoegen proteïnase K tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mg/mL en omkeren te mengen: 2.4 µL van 20 mg/mL proteïnase K toevoegen aan 240 µL van controlemonster en 4 µL van 20 mg/mL proteïnase K tot 400 µL van het monster ChIP.
  5. Incubate bij 55 ° C in een waterbad gedurende 2 uur om het eiwit te verteren en te zuiveren van de DNA.

9. ChIP-qPCR

Opmerking: DNA-extractie en zuivering, uit te voeren zoals beschreven in de Aanvullende materialen.

Opmerking: Controleer of ultrasoonapparaat efficiëntie zoals beschreven in de Aanvullende materialen, om te bevestigen dat 200 - tot 500-bp DNA-fragmenten worden verkregen ( Figuur 3).

Opmerking: een kritieke stap is om te bepalen als de ChIP feitelijk heeft gewerkt. Als er zijn bekende genomic bandplaatsen voor de proteïne van belang, kunnen inleidingen worden ontworpen voor kwantitatieve PCR (qPCR) om te bepalen als de bekende sites specifiek zijn verrijkt met het DNA van de ChIP, in vergelijking met negatieve-control regio's niet verwacht te worden gebonden door de candidatum eiwitten. Als voorbeeld, dit werk toont de resultaten van de ChIP-qPCR verkregen met ChIPs voor H3K4me3 uitgevoerd (actieve promotor Histon mark) en H3K27me3 (inactieve promotor Histon mark) in SNT secties van HH14 chick embryo's geïsoleerd ( figuur 4A ).

  1. Mix van elk paar primer (forward en reverse) in de dezelfde buis en bereiden een voorraad concentratie op 20 µM elk totaalveld dH 2 O (tabel 2).
    Opmerking: de efficiëntie van elk paar primer moet worden geëvalueerd vóór de analyse van de ChIP-qPCR.
  2. Gebruiken de ChIP en 20% invoercontrole DNA verkregen in stap 8.5 voor de optimalisering van de qPCR.
    Opmerking: De ingang DNA doorgaans is verdund 20 x (tot 1% van de grondstoffen gebruikt in de ChIP reacties) p.a. qPCR.
  3. Voor elke 10 µL van het PCR, het mengen van de volgende componenten in een PCR-buis: voor DNA mastermix, voeg 2 µL van dH2O, 2.5 µL van SYBR groen mix en 1 µL van DNA (van ChIP of 1% input); voor mastermix met inleidingen , voeg 2.375 µL van dH2O, 2.5 µL van SYBR groen mix en 0,125 µL voor voorwaartse en omgekeerde primer mix.
  4. De monsters van vortexing voor 2 s en kort centrifuge bij 900 x g gedurende 1 min. mix
  5. Uitvoeren van PCR in real time (een voorbeeld van primers en fietsen voorwaarden gebruikt hier kan worden gevonden in tabel 2 en tabel 3, respectievelijk).
    Opmerking: ChIP-qPCR data-analyse: ChIP signalen worden berekend als het percentage van de input. Kort, eenmaal Ct waarden voor elke qPCR reactie, een verdunningsfactor van 100 of 6.644 cycli worden verkregen (log2 van 100) wordt toegepast op de Ct-waarden voor de input DNA reacties verkregen. Vervolgens, voor een bepaald gebied van belang (dat wil zeggen, primer paar), de ChIP-signalen worden als volgt berekend:
    aangepast van input = Ct (Input) - 6.644
    ChIP signaal = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10. chIP-seq bibliotheek voorbereiding; Einde reparatie: Dag 4

  1. tot 100 verdund ng van ChIP-DNA in 60 µL van elutie buffer (Zie de materialen tabel).
  2. Toevoegen 40 μL van einde herstellen mix en zachtjes 10 keer Pipetteer.
  3. Incubate bij 30 ° C gedurende 30 minuten op een thermische cycler.
  4. Vortex de magnetische kralen en 160 μL toe te voegen aan de buis met de eind reparatie mix. Meng door pipetteren 10 keer. 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  5. Plaats de buis in de magnetische houder en wacht tot de kralen te vestigen aan de kant van de buis...
  6. Giet af de heldere vloeistof.
  7. Toevoegen terwijl de buis op de Paperclip Magneethouder, 200 μL van vers bereide 80% EtOH.
  8. Incubate bij kamertemperatuur voor 30 s en negeren de bovendrijvende substantie. Herhaal keer..
  9. Houd de buis gedurende 15 minuten op de Paperclip Magneethouder bij kamertemperatuur. Zodra de pellet droog is, verwijder de buis uit de Magneethouder.
  10. Resuspendeer de pellet in 20 μL van resuspensie buffer. Zachtjes Pipetteer 10 keer naar meng.
  11. Gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur Incubate.
  12. De buis in de magnetische houder plaatsen en wacht op de kralen te vestigen aan de kant van de buis. 17.5 μL van de bovendrijvende substantie overbrengen in een nieuwe buis.

11. ChIP-seq bibliotheek voorbereiding; Adenylaat 3 ' eindigt

  1. toevoegen 12,5 μL van A-tailing mix aan de nieuwe buis en meng grondig door zachtjes op en neer 10 keer pipetteren. Plaats de buis op een thermische cycler en incubeer volgens het volgende programma: 37 ° C gedurende 30 minuten, 70 ° C gedurende 5 minuten en houd bij 4 ° C

12. ChIP-seq bibliotheek voorbereiding; Afbinden Adapters

  1. 2.5 toevoegen μL van resuspensie buffer, 2.5 μL van afbinding mix en 2.5 μL van de passende RNA adapter index. Meng grondig door zachtjes op en neer 10 keer pipetteren.
  2. Op een thermische cycler gedurende 10 minuten staan bij 30 ° Incubate.
  3. Toevoegen 5 μL van stop afbinding buffer en meng grondig door 10 keer pipetteren.
  4. Vortex de magnetische kralen en 42.5 μL Voeg aan het monster. Meng door pipetteren 10 keer. 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  5. Plaats de buis in de magnetische houder en wacht tot de kralen te regelen aan de kant van de buis en giet af de heldere vloeistof
  6. Toevoegen terwijl de buis op de Paperclip Magneethouder, 200 μL van vers bereide 80% EtOH.
  7. Incubate bij kamertemperatuur voor 30 s en negeren de bovendrijvende substantie. Eenmaal herhaald.
  8. Houd de buis op de magnetische houder en, laat het monster drogen voor 15 min..
  9. Verwijderen van de buis van de magnetische houder en resuspendeer de pellet in 52.5 μL van resuspensie buffer. Meng door pipetteren 10 keer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, plaatst u de buis in de magnetische houder en wacht tot de kralen te vestigen aan de kant van de buis. 50 μl van het supernatans dat duidelijk overbrengen in een nieuwe buis.
  10. Vortex de magnetische kralen en 50 μl Voeg aan het monster. Meng door pipetteren 10 keer. 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  11. De buis in de magnetische houder plaatsen en wacht tot de kralen te regelen aan de kant van de buis en giet af de heldere vloeistof.
  12. Toevoegen terwijl de buis op de Paperclip Magneethouder, 200 μL van vers bereide 80% EtOH.
  13. Incubate bij kamertemperatuur voor 30 s en negeren de bovendrijvende substantie. Eenmaal herhaald.
  14. De buis op de Paperclip Magneethouder bij te houden en laat de monster lucht drogen gedurende 15 minuten
  15. Verwijderen van de buis van de magnetische houder en resuspendeer de pellet in 27.5 μL van resuspensie buffer. Meng grondig door 10 keer pipetteren.
  16. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, plaatst u de buis in de magnetische houder en wacht op de kralen te vestigen aan de kant van de buis. 25 μL van het supernatans dat duidelijk overbrengen in een nieuwe buis.

13. ChIP-seq bibliotheek voorbereiding; Versterking van DNA-fragmenten

  1. plaats 12,5 µL van de sjabloon in een 0,2 mL PCR buis. Voeg 2.5 μL van PCR Inleiding cocktail, 10 μL van verbeterde PCR mix. Mix grondig door pipetteren op en neer 10 keer. Plaats de buis op een thermische cycler en gebruiken de voorwaarden beschreven in tabel 4.
  2. Vortex de magnetische kralen en 25 μL Voeg aan het monster. Meng door pipetteren 10 keer. 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  3. De buis in de magnetische houder plaatsen, wachten op de kralen te regelen aan de kant van de buis en giet af de heldere vloeistof.
  4. Toevoegen terwijl de buis op de Paperclip Magneethouder, 200 μL van vers bereide 80% EtOH. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s en negeren de bovendrijvende substantie. Eenmaal herhaald.
  5. Houd de buis op het magnetische houder en, laat de monster lucht drogen voor 15 min. verwijderen van de buis van de magnetische houder en resuspendeer de pellet in 32.5 μL van resuspensie buffer. Meng grondig door 10 keer pipetteren.
  6. Broeden de PCR buis/plaat gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Plaats van de PCR buis/plaat op de magnetische stand op kamertemperatuur, wachten op de kralen te regelen aan de kant van de buis en 30 μL van de bovendrijvende substantie overbrengen in een nieuwe buis.

14. ChIP-seq bibliotheek voorbereiding; Bibliotheek validatie

Opmerking: de validatie van de bibliotheek wordt uitgevoerd met behulp van een DNA en RNA-kwaliteitssysteem. Voorbereiding van de ladder: aliquoot 1 µL van genomic DNA-Ladder in de eerste buis/goed en voeg 3 µL van monster buffer.

  1. Bereiding van het monster: Meng 1 µL van het monster van de bibliotheek (10-100 ng/µL) met 3 µL van monster buffer in een buis. Spin naar beneden en vervolgens vortex op maximale snelheid voor 5 s. Spin down te plaatsen van het monster aan de onderkant van de buis.
  2. De monsters in het systeem voor kwaliteitscontrole geladen.
  3. Als de run is voltooid, de resultaten analyseren door het instellen van het contrast op de maximumwaarde om ervoor te zorgen geen inleidingsdimeer zijn aanwezig in het monster ( Figuur 5), inleidingsdimeer moeten overeenkomen met op een band rond 135 bp. Als zelfs een zwakke band aanwezig is, gaat u verder met een tweede-opschonen door elutie buffer toe te voegen (Zie de Tabel van de materialen) tot een volume van 50 µL en voeg 47.5 µL van de gemengde magnetische kralen. Als de concentratie van het monster te laag (< 2 nM), gaat u verder met het uitvoeren van de PCR (stap 13.1), met behulp van 18 cycli in plaats van 15, met het volume van de 12,5-µL van monster links van de stap 12.16.
  4. Kwantificeren de bibliotheken individueel door qPCR met behulp van commercieel beschikbare kits.
    Opmerking: Zwembaden van bibliotheken kunnen worden sequenced een sequencer met een enkel-lezen van 1 x 50 nt protocol gericht op 30 M leest/monster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ter illustratie van de prestaties van onze ChIP protocol, we uitgevoerd ChIP-seq experimenten met behulp van de gepaarde SNT secties van HH19 kip embryo's, maxillaire uitsteeksels van HH22 kip embryo's, en fase-HH3 kip embryo's te onderzoeken van de bindende profielen van verschillende histone modificaties (dat wil zeggen, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 en H3K27me3). Zodra de ANI van de ChIP werden verkregen, werd de ultrasoonapparaat efficiëntie beoordeeld door agarose de Elektrofore...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Epigenomic profilering van Histon wijziging met behulp van de ChIP-seq kan worden gebruikt ter verbetering van de functionele aantekening van gewervelde genomen in verschillende contexten van de cellulaire4,5,18. Deze epigenomic-profielen kunnen worden gebruikt, onder andere om enhancer elementen, te definiëren van de regelgevende staat van versterkers (dat wil zeggen, actieve, primer, of klaar), en te bepalen van grote...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen geen concurrerende financiële belangen te worden vermeld.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Jan Appel voor zijn uitstekende technische hulp tijdens de totstandbrenging van dit protocol. Werk in het laboratorium van de Rada-Iglesias wordt ondersteund door CMMC intramurale financiering, DFG onderzoekssubsidies (RA 2547/1-1 RA 2547/2-1 en TE 1007/3-1), de UoC geavanceerde onderzoeker groep Grant, en de toekenning van CECAD.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
BSA poederCarl Roth3737.3
Fosfaat Saline buffer (PBS)Sigma AldrichD8537
Tris-HCL pH 8.0Sigma AldrichT1503
NaClCarl Roth3957.2
EDTACarl Roth8043.2
EGTACarl Roth3054.2
Na-DeoxycholateSigma AldrichD6750-24
N-lauroylsarcosineSigma Aldrich61743-25G
HepesApplichemA3724,0250
LiClCarl Roth3739.2
NP-40Sigma AldrichI3021-100ml
SDSCarl Roth1833
Protein G/magnetische kralenInvitrogen1004D
37% FormaldehydeSigma Aldrich252549-1L
Glycine
RNasePeqlab12-RA-03
Proteinase KSigma Aldrich46.35 E
Na-butyrateSigma AldrichSLB2659V
Proteinase remmerRoche5892791001
SYBRgreen Mixbiozym617004
dH2OSigma AldrichW4502
1 Kb ladderThermofisherSM1333
Orange GSigma Alrich03756-25
AgaroseInvitrogen16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1x)Gibco25200-072
Octylfenol Ethoxylaat (Triton X 100)Roth3051.4
DMEM (Dulbecco´s Gemodificeerd Eagle Medium)Gibco31331-028
Gel loading tips MultiflexA.HartensteinGS21
qPCR PlatesSarstedt721,985,202
384 wellSarstedt721,985,202
1.5 mL buisjesSarstedt72,706
100 - 1,000 µL Filter tipsSarstedt70,762,211
2 - 20 µL Filter tipsSarstedt70,760,213
2 - 200 µL Filter tipsSarstedt70,760,211
0.5 - 10 µL Filter tipsSarstedt701,116,210
H3K27me3 antilichaamActive Motif39155
H3K27ac antilichaamActive Motif39133
H3K4me3 antilichaamActive Motif39159
H3K4me2 antilichaamActive Motif39141
End Repair MixIlluminaFC-121-4001
Paramagnetische kralenBeckman CoulterA63881
Resuspendeer bufferIlluminaFC-121-4001
A-Tailing MixIlluminaFC-121-4001
Ligation MixIlluminaFC-121-4001
RNA Adapter IndexesIlluminaRS-122-2101
Stop Ligation BufferIlluminaFC-121-4001
PCR Primer CocktailIlluminaFC-121-4001
Enhanced PCR MixIlluminaFC-121-4001
Genoom DNA ladderAgilent5067-5582
Elutie BufferAgilent19086
Sample BufferAgilent5067-5582
Library Quantification KitKapa BiosystemsKK4835 – 07960204001
Fertiel kippenei (wit)LSL Rhein MainKN: 15968
Naald (Neoject)A.Hartenstein10001
Spuit (Ecoject 10 mL)Dispomed witt oHG21010
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
CentrifugeHermleZ 216 MK
ThermoshakerITABISMKR13
SonicatorActive MotiveEpiShear sonicatie sonde
SonicatorDiagenodeBioruptor Plus
RotatorStuartSB3
Variabel volume (5 –1,000 μL) pipettenEppendorfN/A
TimerSigmaN/A
Magnetische houderThermo FisherDynaMag-2 12321D
Tabel spinnerHeathrow ScientificSprout
MixerLMSVTX 3000L
Real-Time PCR CyclerRocheLight Cycler; Serienummer 5662
PCR CyclerApplied BiosystemsGene Amp PCR System 9700
DNA en RNA kwaliteitscontrolesysteemAgilentAgilent 4200 TapeStation System
PincetDumont5-Inox-H
Geperforeerde lepelWorld precision instruments501997

Referenties

  1. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
  4. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  6. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  8. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  9. Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
  10. Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
  11. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  12. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
  13. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  14. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  15. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  16. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
  18. Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
  19. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  20. Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Monsters met lage abundantieembryonaal weefselhistonmodificatiessonicatie effici ntieantilichaambindingmagnetische kralenDNA zuiveringkwantitatieve PCR

Gerelateerde artikelen