Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Summary

Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.

Abstract

De analyse van de wereldwijde gen expressie veranderingen is een waardevol instrument voor de identificatie van nieuwe trajecten die ten grondslag liggen aan de waargenomen fenotypen. De zebravis is een uitstekend model voor snelle beoordeling van hele transcriptome van hele dieren of individuele cel populaties te wijten aan het gemak van isolatie van RNA van grote aantallen dieren. Hier wordt een protocol voor globale gen expressie analyse in zebrafish embryo's met behulp van RNA sequencing (RNASeq) gepresenteerd. We beschrijven de voorbereiding van RNA van hele embryo's of van cel populaties verkregen met behulp van de cel sorteren in transgene dieren. Ook beschrijven we een aanpak voor de analyse van de RNASeq gegevens om verrijkt trajecten en Ontology van het gen (ga) bedingen in global gen expressie datasets te identificeren. Tot slot bieden we een protocol voor validatie van gen expressie veranderingen met behulp van kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen voor vergelijkende analyse van controle en experimentele sets van zebrafish kunnen worden gebruikt om nieuwe gen expressie veranderingen te identificeren, en moleculaire inzicht geven in de fenotypen van belang.

Introduction

Vergelijkende analyse van de wereldwijde genexpressie is een waardevol instrument om nieuwe genen die bijdragen tot het waargenomen fenotypen te identificeren. Dergelijke analyses meestal rekenen op kwantitatieve beoordeling van transcript overvloed vergeleken tussen experimentele en controle van monsters. Gerichte aanpak, zoals qRT-PCR zijn relatief snel en nauwkeurig onderzoek van enkel gen expressie veranderingen. RNA sequencing (RNASeq) biedt een brede, hypothese-vrije benadering ter identificatie van belangrijke wijzigingen in genexpressie tussen monsters, waardoor het nu de standaard voor dergelijke onderzoeken over experimentele systemen.

Protocol

alle dierlijke protocollen hieronder zijn in overeenstemming met en goedgekeurd door de Universiteit van Maryland institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC).

1. embryo voorbereiding

1. genereren embryo's via natuurlijke paring
   1. cultuur embryo's tot 3 maanden van leeftijd, reproductieve volwassenheid ^{5 , 8} .
   2. Scheiden van de volwassen mannelijke en vrouwelijke vissen van de gewenste stam in verdeelde paring tanks aan de vooravond van de embryo's worden verzameld, en 2 mannetjes en 3 vrouwtjes toevoegen aan elke tank.
      Opme....

Results

Sorteren van Differentially uitgedrukte genen:

Om te identificeren differentially uitgedrukte genen in het larvale stadium van zebravis modellen van Alström-syndroom en syndroom van Bardet-Biedl (BBS), we gericht ofwel alms1 of afschriften van de bbs1 door het injecteren van eerder gevalideerd splice-blokkerende Mnd in wild-type zebrafish embryo's^16,17. 5 .......

Discussion

De in dit protocol beschreven aanpak biedt een relatief snelle en kostenefficiënte strategie voor de analyse van de transcriptome-niveau van de hele dieren of bepaalde gesorteerde cel populaties. De zebravis biedt een voordelige model voor dit soort studie vanwege het gemak en de snelheid bij het genereren van grote hoeveelheden van het starten van materiaal, het gemak van uitvoering van genetische of milieu experimentele omstandigheden, en de beschikbaarheid van een groot spectrum van transgene verslaggever lijnen waard.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial Reagents
TriZol	Thermo Scientific	15596026	lysis reagent
TrypLE	Gibco	12604013	dissociation buffer 1
FACSMax	Genlantis	T200100	dissociation buffer 2
DEPC-treated water	Sigma	95284
FirstStrand cDNA conversion	Thermo Scientific	K1621	cDNA conversion kit
2X SYBR Green Master Mix	Roche	4707516001	qRT-PCR Master Mix
FACS buffer	Fisher Scientific	50-105-9042
chloroform	Sigma Aldrich	288306
sodium acetate	Sigma Aldrich	S2889
Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Strains
Tuebingen	ZIRC	ZL57
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
40 micron cell strainer	Sigma	CLS431750
FACS tube	BD Falcon	352063
hemocytometer	Sigma	Z359629
Dissecting Microscope	Zeiss
Inverted Microscope	Zeiss
Nanodrop	Thermo Scientific
Illumina HiSeq	Illumina
LightCycler 480	Roche
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
FACS tube 5 mL polypropylene tube	BD Falcon	352063
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Excel	Microsoft
Consensus Path DB	http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO Enrichment Analysis	http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis