Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De analyse van de wereldwijde gen expressie veranderingen is een waardevol instrument voor de identificatie van nieuwe trajecten die ten grondslag liggen aan de waargenomen fenotypen. De zebravis is een uitstekend model voor snelle beoordeling van hele transcriptome van hele dieren of individuele cel populaties te wijten aan het gemak van isolatie van RNA van grote aantallen dieren. Hier wordt een protocol voor globale gen expressie analyse in zebrafish embryo's met behulp van RNA sequencing (RNASeq) gepresenteerd. We beschrijven de voorbereiding van RNA van hele embryo's of van cel populaties verkregen met behulp van de cel sorteren in transgene dieren. Ook beschrijven we een aanpak voor de analyse van de RNASeq gegevens om verrijkt trajecten en Ontology van het gen (ga) bedingen in global gen expressie datasets te identificeren. Tot slot bieden we een protocol voor validatie van gen expressie veranderingen met behulp van kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen voor vergelijkende analyse van controle en experimentele sets van zebrafish kunnen worden gebruikt om nieuwe gen expressie veranderingen te identificeren, en moleculaire inzicht geven in de fenotypen van belang.
Inleiding
Vergelijkende analyse van de wereldwijde genexpressie is een waardevol instrument om nieuwe genen die bijdragen tot het waargenomen fenotypen te identificeren. Dergelijke analyses meestal rekenen op kwantitatieve beoordeling van transcript overvloed vergeleken tussen experimentele en controle van monsters. Gerichte aanpak, zoals qRT-PCR zijn relatief snel en nauwkeurig onderzoek van enkel gen expressie veranderingen. RNA sequencing (RNASeq) biedt een brede, hypothese-vrije benadering ter identificatie van belangrijke wijzigingen in genexpressie tussen monsters, waardoor het nu de standaard voor dergelijke onderzoeken over experimentele systemen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
alle dierlijke protocollen hieronder zijn in overeenstemming met en goedgekeurd door de Universiteit van Maryland institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC).
1. embryo voorbereiding
- genereren embryo's via natuurlijke paring
- cultuur embryo's tot 3 maanden van leeftijd, reproductieve volwassenheid 5 , 8 .
- Scheiden van de volwassen mannelijke en vrouwelijke vissen van de gewenste stam in verdeelde paring tanks aan de vooravond van de embryo's worden verzameld, en 2 mannetjes en 3 vrouwtjes toevoegen aan elke tank.
Opme....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Sorteren van Differentially uitgedrukte genen:
Om te identificeren differentially uitgedrukte genen in het larvale stadium van zebravis modellen van Alström-syndroom en syndroom van Bardet-Biedl (BBS), we gericht ofwel alms1 of afschriften van de bbs1 door het injecteren van eerder gevalideerd splice-blokkerende Mnd in wild-type zebrafish embryo's16,17. 5 .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De in dit protocol beschreven aanpak biedt een relatief snelle en kostenefficiënte strategie voor de analyse van de transcriptome-niveau van de hele dieren of bepaalde gesorteerde cel populaties. De zebravis biedt een voordelige model voor dit soort studie vanwege het gemak en de snelheid bij het genereren van grote hoeveelheden van het starten van materiaal, het gemak van uitvoering van genetische of milieu experimentele omstandigheden, en de beschikbaarheid van een groot spectrum van transgene verslaggever lijnen waard.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) en T32DK098107 (T.L.H. en J.E.N.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Commerciële Reagentia | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lyse reagens |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociatie buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociatie buffer 2 |
| DEPC-behandeld water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA omzetting | Thermo Scientific | K1621 | cDNA omzettingskit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| natriumacetaat | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Zebravis Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Apparatuur | |||
| 40 micron celzeef | Sigma | CLS431750 | |
| FACS buis | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometers | Sigma | Z359629 | |
| Dissectiemicroscoop | Zeiss | ||
| Inverteer Microscoop | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Paringstanks 1,0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS buis 5 mL polypropyleen buis | BD Falcon | 352063 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Verrijkingsanalyse | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
Referenties
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
