Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme

Samenvatting

Dit artikel geeft een gedetailleerde procedure voor de solide fase synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA gemodificeerd op de C2'- O- positie. UV-vis en cirkelvormige dichroïstische fotometrische analyses worden gebruikt om structurele aspecten te kwantificeren en karakteriseren, dwz enkelstrengen of dubbelstrengen.

Samenvatting

Solide fase synthese is gebruikt om kanonieke en gemodificeerde polymeren van nucleïnezuren, specifiek van DNA of RNA, te verkrijgen, waardoor het een populaire methodologie is voor toepassingen in verschillende velden en voor verschillende onderzoeksdoeleinden. De hierin beschreven procedure richt zich op de synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' die nul, een of twee modificaties bevinden op de C2'- O- positie bevatten. De probes zijn gebaseerd op 2-thiophenylmethylgroepen, opgenomen in RNA-nucleotiden via standaard organische synthese en geïntroduceerd in de overeenkomstige oligonucleotiden via hun respectievelijke fosforamidieten. Dit rapport maakt gebruik van fosforamidietchemie via de vier kanonieke nucleobasen (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), evenals 2-thiophenylmethylfunctionaliseerde nucleotiden gemodificeerd bij de 2'- O- positie; De methode is echter vatbaar voor een grote varZestig aanpassingen die door de jaren heen zijn ontwikkeld. De oligonucleotiden werden gesynthetiseerd op een steun met gecontroleerde poriënglas (CPG), gevolgd door splitsing uit de hars en deprotectie onder standaard omstandigheden, dat wil zeggen een mengsel van ammoniak en methylamine (AMA) gevolgd door waterstoffluoride / triethylamine / N-methylpyrrolidinon. De overeenkomstige oligonucleotiden werden gezuiverd via polyacrylamide-elektroforese (20% denaturerende) gevolgd door elutie, ontzouten en isolatie via omgekeerde fase chromatografie (Sep-pak, _C18-kolom). Kwantificering en structurele parameters werden beoordeeld via respectievelijk ultraviolet-zichtbare (UV-vis) en circulaire dichroïstische (CD) fotometrische analyse. Dit rapport streeft ernaar om als bron en begeleider te dienen voor beginners- en deskundige onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het starten van dit vakgebied. Er wordt verwacht dat deze werkzaamheden worden ingezet als nieuwe technologieën en methodologieën worden ontwikkeld. De beschrijving van de methodologieën en technieken binnen dezeS document komt overeen met een DNA / RNA synthesizer (opgeknapt en gekocht in 2013) die fosforamidietchemie gebruikt.

Inleiding

Solid-fase synthese om oligonucleotiden van DNA / RNA te verkrijgen is een krachtig hulpmiddel dat sinds de jaren 1970 ^{1 , 2 , 3} verscheidene toepassingen in verschillende velden heeft gediend door fosforamidiet bouwstenen ^{4 te gebruiken} . Voorbeelden van zijn brede invloed zijn: het effect ervan op etikettering ( via click chemistry reacties) ⁵ , structurele probing ⁶ en antisense technologieën ⁷ , evenals de toelichting van biologische mechanismen ⁸

Protocol

1. Vaste-fasesynthese van RNA-oligonucleotiden

1. Bereiding van oplossingen die elk fosforamidiet bevatten (tabel 1).
   1. Tel het aantal nucleotiden en pas in de n + 1 vergelijking (waar n = aantal nucleotiden) die overeenkomen met elke basis en vul de tabel in met de ontbrekende waarden. Volume = 0,15 ml per nucleotide bij een concentratie van 0,1 M, opgelost in watervrij acetonitril.
   2. Weeg elk fosforamidiet in ovengedroogde 10 ml amberflessen (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) en plaats onmiddellijk onder vacuüm met behulp van een droogmiddel die een droogmiddel bevat.
   3. Vul de droogmiddel met droog....

Resultaten

De synthese van RNA-dodecamers die nul-, een- of twee-2-thiophenylmethyl-modificaties bij de C2'- O- positie bevatten, wordt samen met zijn overeenkomstige zuivering en karakterisering beschreven. Verder is een gedetailleerde beschrijving van de structurele analyse die via CD is uitgevoerd, opgenomen.

De vier strengen van RNA (inclusief een streng met een complementaire sequentie) werden verkregen door middel van .......

Discussie

Het doel van dit manuscript is om als gids te dienen voor onderzoekers op het gebied, beginner of deskundige, om succesvol het bereiken of verbeteren van de synthese van oligonucleotiden van DNA of RNA. De beschreven methodologie richt zich op het gebruik van vaste-fase synthese door gebruik te maken van een geautomatiseerde DNA / RNA synthesizer via standaard fosforamidiet chemie. Het rapport beschrijft een stap-voor-stap afbeelding van de synthese, zuivering en karakterisering van RNA dodecamers. Daarnaast wordt het g.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AbsolveTM	PerkinElmer	6NE9711
Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade	Fisher Scientific	75-05-8
Acetonitrile 99.9%, anhydrous voor DNA-sequencing	Fisher BioReagents	75-05-8
Acrylamide, 99+%	ACROS Organics	164850025
Ammoniumchloride 98+%	Alfa Aesar	12125-02-9
Ammoniumcitraat, dibasisch 98%	Sigma Aldrich	3012-65-5
Ammoniumfluoride  98.0%, ACS-kwaliteit	Alfa Aesar	12125-01-8
Ammoniumhydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus	Fisher Chemical	1336-21-6
Ammoniumpersulfaat	ACROS Organics	1444
Argon-ultra hoge zuiverheid	Airgas	7440-37-1
Bis-acrylamide Ultra zuiver	VWR-Amresco	172
Boorzuur	Fisher Scientific	A73-1
Diethylpyrocarbonaat, 97%	ACROS Organics	A0368487
Ethanol, anhydrous, histologisch kwaliteit	Fisher Chemical	64-17-5
Ethyleendiaminetetraazijnzuur, dinatriumzout dihydraat 100.2%	Fisher Chemical	6381-92-6
Formamide	Thermo Scientific	75-12-7
Zoutzuur, 36.5 - 38.0%, Gecertificeerd ACS Plus	Fisher Chemical	7647-01-0
Magnesiumchloride hexahydraat, 99%	Fisher Scientific	7786-30-3
Methanol, 99.9%,  HPLC Grade	Fisher Chemical	67-56-1
Methylamine 40% in water	Sigma Aldrich	74-89-5
1-Methyl-2-pyrrolidinon, anhydrous, 99.5%	Aldrich	872-50-4
Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)	MDS SCIEX	1020157
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11
Natriumacetaat, anhydrous 99.2%, Gecertificeerd ACS	Fisher Chemical	127-09-3
Natriumchloride, 100.5%, Gecertificeerd ACS	Fisher Chemical	7647-14-5
Natriumfosfaat monobasisch dihydraat 99.0%	Sigma	13472-35-0
2’,4’ Triethylamine, 99+%	Alfa Aesar	121-44-8
TEMED	Amresco	761
Triethylamine trihydrofluoride, 98%	Aldrich	73602-61-6
Trifluorazijnzuur, 99%	Alfa Aesar	76-05-1
6’-Trihydroxyacetofenon monohydraat 98%	Sigma Aldrich	480-66-0
Tris Base	Fisher Scientific	BP154-3
Urea	Fisher Scientific	U15-3
Reagentia voor de RNA-synthese:
Deblocking mix, 3% trichloroazijnzuur in dichloormethaan	Glen Research	40-4140-57
Cap Mix A, THF/Pyridine/Azetzuuranhydride	Glen Research	40-4110-52
Cap Mix B, 10% 1-methylimidazool in THF	Glen Research	40-4120-52
Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazool in anhydrous acetonitrile	Glen Research	30-3140-52
Oxidatieoplossing, 0.02 M jodium in THF/Pyridine/Water	Glen Research	40-4330-52
U-RNA-CPG	Glen Research	20-3330-xx
Ac-G-RNA-CPG	Glen Research	20-3324-xx
Ac-G-CE Phosphoramidiet	Glen Research	10-3025-xx
U-CE Phosphoramidiet	Glen Research	10-3030-xx
Ac-C-CE Phosphoramidiet	Glen Research	10-3015-xx
Bz-A-CE Phosphoramidiet	Glen Research	10-3003-xx