Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Binnen het ingeboren immune systeem spelen effector lymfocyten bekend als de natural killer (NK) cellen een essentiële rol in de verdediging van de gastheer tegen afwijkende cellen, specifiek elimineren tumoraal en viraal geïnfecteerde cellen. Ongeveer 30 bekende monogeen gebreken, samen met een gastheer van andere pathologische condities, veroorzaken functionele of klassieke NK-cel-deficiëntie, manifesteren verminderd of afwezig cytotoxische activiteit. Historisch, is cytotoxiciteit onderzocht met radioactieve methoden, die omslachtig, duur en mogelijk gevaarlijk zijn. Dit artikel beschrijft een gestroomlijnde, klinisch toepasselijke stroom cytometry gebaseerde methode om te kwantificeren NK cel cytotoxische activiteit. In deze test zijn perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) of gezuiverde NK cel preparaten mede bebroede op verschillende verhoudingen met een doel tumor cellijn bekend te zijn gevoelig voor NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit (NKCC). De doelcellen zijn vooraf gelabelde met een fluorescente kleurstof toe hun discriminatie uit de effector cellen (NK-cellen). Na de incubatieperiode, worden gedood doelcellen aangeduid met een vlek van nucleic zuur, die specifiek dode cellen doordringt. Deze methode is vatbaar voor zowel diagnose en onderzoek toepassingen en dankzij de mogelijkheden van de Multi-parameter van stroom cytometry, heeft het toegevoegde voordeel potentieel in staat te stellen een diepere analyse van NK-cel fenotype en functie.
Inleiding
Natural killer (NK) cellen zijn een verfijnde subset van menselijke aangeboren lymfocyten kritisch die betrokken zijn bij de eliminatie van viraal geïnfecteerde cellen, getransformeerde cellen, en andere pathogene bedreigingen 1,2. NK-cel lytische korrels huis cytotoxische eiwitten, zoals Perforine en granzymes. Na activatie, NK-cellen vormen een complexe interactie met hun doelen bekend als immunologische synapse, waarbij deze cytolytische moleculen lokaal vrijgegeven zijn, wat resulteert in de lysis van de cel van de directe doel en apoptosis, samen met cytokine en chemokine release en uiteindelijk in de inductie van een inflammatoire staat 1,3,4.
NK-cel-activatie gaat om een complexe reeks van activeren en remmende interacties tussen NK cel receptoren en liganden uitgedrukt op het oppervlak van doelcellen, vormen een strak gereguleerde systeem. Een van de meest bestudeerde mechanismen van NK cel activatie is het "ontbrekende zelf". Inderdaad, gebrek aan opsporing van klasse die ik major histocompatibility complex (MHC) of human leukocyte antigeen (HLA) moleculen, op geïnfecteerd of cellen triggers NK cel cytotoxiciteit worden omgezet. Tumor en virus-geïnfecteerde cellen in het algemeen downregulate deze antigenen te ontsnappen van T-cel-gemedieerde immuniteit, zo wordend primaire NK cel doelstellingen 1,3,4.
Beoordeling van NK-cel functie is hoofdzakelijk onderverdeeld in degranulatie of cytotoxiciteit testen. Degranulatie testen, zoals stroom cytometrische detectie van de degranulatie-geassocieerde markering CD107a, zijn echter slechts indicatief van NK-cel activatie en niet van hun uiteindelijke functie, de directe moord op target cellen 5,6,7,8. Vandaar heeft deze beperking getrokken onderzoekers cytotoxiciteit testen als een meer vertellen en meer directe alternatief.
De lange tijd "gouden standaard" voor de beoordeling van cel-gemedieerde cytotoxische activiteit van zowel T en NK-cellen is de chroom release assay (CRA). CRA omvat het radioactief labelen van doelcellen met 51Cr en broeden ze samen met effector cellen. Deze test is doordrenkt van het beginsel dat lysis van de cel resulteert in het vrijkomen van eiwit-gebonden 51Cr in de bovendrijvende substantie, die kan worden gemeten door het tellen van de gamma. Deze assay, terwijl effectief, is problematisch voor een verscheidenheid van redenen: hoge materiaalkosten, behandeling en verwijdering van radioactieve 51Cr, spontane release van 51Cr en moeilijk standaardisering - waardoor het totaal onpraktisch 9,10.
Een aantal niet-radioactieve testen, met fluorescerende labeling, enzym release en zelfs bioluminescentie, zijn sindsdien ontwikkeld als alternatief voor CRA 11,12,13,14. Hier beschrijven we een stroom cytometry gebaseerde methode voor meting van de NK-cel cytotoxische activiteit op K562 doelcellen thats eenvoudig, gevoelige en reproduceerbaar. K562 cellen zijn een menselijke erythroleukemic cel lijn met verminderde expressie van HLA-klasse I en verhoogde expressie van liganden voor activatory NK receptoren, waardoor ze bijzonder vatbaar voor NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit 15. In deze test, K562 cellen worden vooraf aangeduid met carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl ester (CFSE) en mede gekweekt in verschillende verhoudingen met beide perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) of gezuiverd van NK cellen 1. CFSE is een stabiele, binding aan eiwitten fluorescerende kleurstof waarmee discriminatie van doelcellen van effector NK cellen 16,17. Na de co incubatie, wordt een nucleïnezuur vlek, specifiek doordringt het membraan van dode cellen, gebruikt voor het identificeren van gedode doelcellen (zie tabel van materialen). De monsters worden vervolgens verworven op een cytometer van de stroom om te bepalen van het percentage van doden (dat wil zeggen, vlek +) CFSE + doelcellen.
Deze test kan worden gebruikt als een routinematige diagnostische screening voor monogeen gebreken op het gebied van het NK cel compartiment, waarvan er ongeveer 30 bekende gebreken veroorzaakt functionele of klassieke NK-cel-deficiëntie, aanwezig zijn en voor primaire of secundaire hemophagocytic lymphohistiocytosis. Het is ook nuttig NK cel activiteiten bij patiënten met terugkerende, ernstige herpes virale infecties, te evalueren immuunsysteem reconstitutie na transplantatie van hematopoïetische cel of post immunomodulerende therapie 18,19,20, en voor een heleboel applicaties van fundamenteel onderzoek te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De monsters werden verzameld volgens de ethische richtlijnen vastgesteld door het UCLA Human Research Protection Program en IRB goedgekeurd.
1. Bereiding van reagentia
OPMERKING: Tenzij anders aangegeven, dienen alle reagentia voor gebruik gedurende een bepaalde tijd bij kamertemperatuur te worden gebracht. Alle reagentia moeten steriel blijven.
- Bereid een 2x werkoplossing van Tween-20 (d.w.z. 0,2%) door 10 µL van Tween-20 oplossing toe te voegen aan 5 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium met een p20 pipette.
- Gezien de hoge viscositeit van Tween-20, neem de volgende stappen om de nauwkeurigheid te waarborgen: verzamel langzaam om belvorming te voorkomen, dompel de hele punt niet onder om carry-over te voorkomen en pipet omhoog en omlaag meerdere keren in PBS om alle Tween-20 van de punt te wassen.
- Voeg 2 µL van IL-2 stockoplossing (2,1E6 IU/mL) toe aan 198 µL van compleet medium (d.w.z. 1:100 verdunning), dit is RPMI met 1% penicilline-streptomycine en 10% foetaal bovien serum (FBS), ga dan verder met een extra 1:100 verdunning door 2 µL van IL-2 tussenoplossing toe te voegen aan 198 µL van compleet medium om een 7x werkoplossing te bereiden (210 IU/mL).
- Voeg 2 µL van CFSE stockoplossing (5 mM) toe aan 500 µL van plain medium (RPMI). Vortex, centrifugeren om druppels van de dop te verwijderen, ga dan verder met een extra 1:20 verdunning door 50 µL van de CFSE tussenoplossing toe te voegen aan 950 µL van plain RPMI om een 2x werkoplossing van 1 µM te verkrijgen. Vortex goed en beschermd tegen licht bewaren.
2. Isolatie van PBMC's als effectorcellen
OPMERKING: Deze test is gevalideerd voor effectief gebruik met totale PBMC's van gezonde controles. Het wordt echter aanbevolen dat het NK-cellinh alte wordt geverifieerd met elke PBMC-voorbereiding (Figuur 1). Ook is het volume van het gehele bloed voor verzameling gebaseerd op de frequentie van NK-cellen in het perifere bloed en dit kan van persoon tot persoon variëren, vooral tussen gezonde donoren en patiënten.
- Verzamel een minimum van 4 mL menselijk heelbloed in natrium of lithium heparine gecoate bloedverzamelbuisjes. Bewaar bloedmonsters bij kamertemperatuur na verzameling en gebruik binnen 30 uur na verzameling.
- Verdun heelbloed met 4 mL van PBS (d.w.z. gelijk volume van PBS tot heelbloed).
- Voeg 4 mL van dichtheidsgradiëntoplossing (zie tabel van materialen) toe aan een 15-mL conische buis. Leg verdund heelbloed voorzichtig over de dichtheidsgradiëntoplossing door de buis te kantelen.
- Centrifugeer bij 650 x g gedurende 24 min met de rem uit.
- Verzamel voorzichtig de laag van mononucleaire cellen, wat de dunne witte laag onder de bovenste laag plasma en bloedplaatjes is, in een nieuwe 15-mL conische buis. Breng het volume naar 15 mL met PBS.
- Centrifugeer bij 450 x g gedurende 10 min met de rem aan. Aspeer de supernatant en suspendeer cellen in 0,5 mL van compleet medium.
- Gebruik een geautomatiseerde celteller of hemocytometer om de cellen te tellen, en pas de PBMC concentratie aan tot 5x106 cellen/mL met compleet medium.
- Controleer het NK-cellinh alte door middel van flowcytometrie (zie stap 4).
- Start de test binnen 30 min. Houd cellen maximaal 10 min op kamertemperatuur, of plaats in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 °C totdat ze klaar zijn voor gebruik.
3. Isolatie van NK-cellen als effectorcellen
OPMERKING: Dit deel van het protocol is een alternatief voor het gebruik van totale PBMC's als effectorcellen. De typische opbrengst uit 4 mL van het gehele bloed van een gezond individu is ongeveer 4x105 NK-cellen, of ongeveer 5-15% van PBMC's, hoewel deze frequentie varieert tussen donoren 21. Het wordt aanbevolen dat een zuiverheidscontrole wordt uitgevoerd na de isolatie.
- Verzamel een minimum van 4 mL menselijk heelbloed in natrium of lithium heparine gecoate bloedverzamelbuisjes. Neem 50 µL van heelbloed om als pre-verrijkingsmonster te kleuren.
- Voeg de verrijkingscocktail toe aan bloedmonsters bij 50 µL/mL (zie tabel van materialen). Meng goed en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Voeg een gelijk volume van PBS + 2% FBS toe om het monster te verdunnen en meng voorzichtig goed.
- Voeg 4 mL van dichtheidsgradiëntoplossing toe aan een 15-mL conische buis. Leg het verdunde monster voorzichtig op de top van het dichtheidsgradiënt medium.
- Centrifugeer bij 1.200 x g gedurende 10 min met de rem uit.
- Verzamel voorzichtig de laag van verrijkte cellen in een nieuwe 15-mL conische buis. Was de cellen door het volume op te brengen tot 50 mL met PBS + 2% FBS.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 min. Gooi de supernatant weg en herhaal de wassing.
- Aspeer de supernatant en suspendeer cellen in 0,5 mL van compleet medium.
- Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of hemocytometer en pas de concentratie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voordat u de test, is het sterk aanbevolen dat de inhoud van de cel van de NK worden beoordeeld bij de effector populatie van keuze. Figuur 1 toont een typische CD56 kleuring vóór (lichtblauw) en na (rood) NK cel verrijking. NK cellen bestaan uit maximaal 15% van PBMCs en moeten ten minste 80% zuiver na verrijking.
Flow analyse van de cytometrische in deze bepaling impliceert detectie van twee param...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methode biedt een eenvoudige en rendabele alternatief voor de traditionele 51Cr release assay te beoordelen van de NK-cel cytotoxische activiteit. Deze methode is de gevoelig, reproduceerbaar zijn, en minder tijd in beslag dan de vorige standaard methoden, zoals CRA, en kan worden gebruikt voor zowel klinische en onderzoek toepassingen.
Terwijl de test met zowel totale PBMCs en verrijkte NK-cellen werkt, is de optie PBMCs gebruiken zonder de noodzaak voor het zuiv...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen conflicten van belangen.
Dankbetuigingen
Wij wil Jill Narciso, UCLA Immunogenetica Center, bedanken voor haar hulp bij de voorbereiding van de manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Fosfaat-gebufferde Saline (1x, zonder Ca2+ en Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Voorraad oplossing bij 10.000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Gelyofiliseerd uit een 0,2 μm gefilterde oplossing in Acetonitrile en TFA met BSA als dragereiwit. Reconstrueer met 500 ul bij 100 μg/mL in steriele 100 mM azijnzuur bevattend ten minste 0,1% bovien serumalbumine (2,1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cellen | ATCC | CCL-243 | Kankercel lijn |
| T-75 celcultuur kolven | Corning | 431464 | |
| CFSE celproliferatie kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitueer 1 vial met 18 ul DMSO om een 5mM voorraadoplossing te bereiden. Niet invriezen/ontdooien. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Voorraadoplossing wordt geleverd bij 5 μM in 1 mL DMSO. De DMSO-oplossing kan worden onderworpen aan meerdere vries-ontdooicycli zonder reagentendegradatie. |
| Natrium/lithium heparine bloedopnamebuisjes | BD | 02-687-95 | |
| U-bodem 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serologische pipetten | BD Falcon | ||
| Polystyreen ronde bodembuizen (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropyleen conische buis | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropyleen conische buis | BD Falcon | 352097 | |
| Reagens reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cel verrijking cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
Referenties
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357(2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152(2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578(2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1(2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
