Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Binnen het ingeboren immune systeem spelen effector lymfocyten bekend als de natural killer (NK) cellen een essentiële rol in de verdediging van de gastheer tegen afwijkende cellen, specifiek elimineren tumoraal en viraal geïnfecteerde cellen. Ongeveer 30 bekende monogeen gebreken, samen met een gastheer van andere pathologische condities, veroorzaken functionele of klassieke NK-cel-deficiëntie, manifesteren verminderd of afwezig cytotoxische activiteit. Historisch, is cytotoxiciteit onderzocht met radioactieve methoden, die omslachtig, duur en mogelijk gevaarlijk zijn. Dit artikel beschrijft een gestroomlijnde, klinisch toepasselijke stroom cytometry gebaseerde methode om te kwantificeren NK cel cytotoxische activiteit. In deze test zijn perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) of gezuiverde NK cel preparaten mede bebroede op verschillende verhoudingen met een doel tumor cellijn bekend te zijn gevoelig voor NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit (NKCC). De doelcellen zijn vooraf gelabelde met een fluorescente kleurstof toe hun discriminatie uit de effector cellen (NK-cellen). Na de incubatieperiode, worden gedood doelcellen aangeduid met een vlek van nucleic zuur, die specifiek dode cellen doordringt. Deze methode is vatbaar voor zowel diagnose en onderzoek toepassingen en dankzij de mogelijkheden van de Multi-parameter van stroom cytometry, heeft het toegevoegde voordeel potentieel in staat te stellen een diepere analyse van NK-cel fenotype en functie.
Inleiding
Natural killer (NK) cellen zijn een verfijnde subset van menselijke aangeboren lymfocyten kritisch die betrokken zijn bij de eliminatie van viraal geïnfecteerde cellen, getransformeerde cellen, en andere pathogene bedreigingen 1,2. NK-cel lytische korrels huis cytotoxische eiwitten, zoals Perforine en granzymes. Na activatie, NK-cellen vormen een complexe interactie met hun doelen bekend als immunologische synapse, waarbij deze cytolytische moleculen lokaal vrijgegeven zijn, wat resulteert in de lysis van de cel van de directe doel en apoptosis, samen met cytokine en chemokine release en uiteindelijk in de ind....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De monsters werden verzameld volgens de ethische richtlijnen vastgesteld door het UCLA Human Research Protection Program en IRB goedgekeurd.
1. Bereiding van reagentia
OPMERKING: Tenzij anders aangegeven, dienen alle reagentia voor gebruik gedurende een bepaalde tijd bij kamertemperatuur te worden gebracht. Alle reagentia moeten steriel blijven.
- Bereid een 2x werkoplossing van Tween-20 (d.w.z. 0,2%) door 10 µL van Tween-20 oplossing toe te voegen aan 5 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium met een p20 pipette.
- Gezien de hoge viscositeit van Tween-20, neem de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voordat u de test, is het sterk aanbevolen dat de inhoud van de cel van de NK worden beoordeeld bij de effector populatie van keuze. Figuur 1 toont een typische CD56 kleuring vóór (lichtblauw) en na (rood) NK cel verrijking. NK cellen bestaan uit maximaal 15% van PBMCs en moeten ten minste 80% zuiver na verrijking.
Flow analyse van de cytometrische in deze bepaling impliceert detectie van twee param.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methode biedt een eenvoudige en rendabele alternatief voor de traditionele 51Cr release assay te beoordelen van de NK-cel cytotoxische activiteit. Deze methode is de gevoelig, reproduceerbaar zijn, en minder tijd in beslag dan de vorige standaard methoden, zoals CRA, en kan worden gebruikt voor zowel klinische en onderzoek toepassingen.
Terwijl de test met zowel totale PBMCs en verrijkte NK-cellen werkt, is de optie PBMCs gebruiken zonder de noodzaak voor het zuiv.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen conflicten van belangen.
Dankbetuigingen
Wij wil Jill Narciso, UCLA Immunogenetica Center, bedanken voor haar hulp bij de voorbereiding van de manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Fosfaat-gebufferde Saline (1x, zonder Ca2+ en Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Voorraad oplossing bij 10.000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Gelyofiliseerd uit een 0,2 μm gefilterde oplossing in Acetonitrile en TFA met BSA als dragereiwit. Reconstrueer met 500 ul bij 100 μg/mL in steriele 100 mM azijnzuur bevattend ten minste 0,1% bovien serumalbumine (2,1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cellen | ATCC | CCL-243 | Kankercel lijn |
| T-75 celcultuur kolven | Corning | 431464 | |
| CFSE celproliferatie kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitueer 1 vial met 18 ul DMSO om een 5mM voorraadoplossing te bereiden. Niet invriezen/ontdooien. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Voorraadoplossing wordt geleverd bij 5 μM in 1 mL DMSO. De DMSO-oplossing kan worden onderworpen aan meerdere vries-ontdooicycli zonder reagentendegradatie. |
| Natrium/lithium heparine bloedopnamebuisjes | BD | 02-687-95 | |
| U-bodem 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serologische pipetten | BD Falcon | ||
| Polystyreen ronde bodembuizen (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropyleen conische buis | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropyleen conische buis | BD Falcon | 352097 | |
| Reagens reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cel verrijking cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
Referenties
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
