Het doel van dit protocol is te wijzigen van de doordringendheid van dodelijke skelet mutant fenotypen in zebrafish door selectief fokken. Dodelijke mutanten naar volwassenheid kunnen niet worden gekweekt en zelf gefokt, dus dit protocol beschrijft een methode voor het bijhouden en selecteren doordringendheid door meerdere generaties nakomelingen testen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mutant fenotypes van zebravis zijn vaak onvolledig penetrant, alleen in sommige mutanten manifesteren. Interessante fenotypen die inconsistent worden weergegeven kunnen moeilijk zijn om te studeren, en kunnen leiden tot verwarrende resultaten. Het protocol beschreven hier is een eenvoudige fokken paradigma te verhogen of doordringendheid in dodelijke zebrafish skelet mutanten. Omdat dodelijke mutanten kunnen niet selectief rechtstreeks worden gefokt, is de strategie van de klassieke selectief fokken van nakomelingen testen werkzaam. Deze methode omvat ook protocollen voor Kompetitive Allele specifieke PCR (Kawasaki Advanced Safety) genotypering zebravis en kleuring larvale zebrafish kraakbeen en bot. Toepassing van de strategie van de veehouderij die hier worden beschreven kunt verhogen de doordringendheid van een interessante skelet fenotype waardoor meer reproduceerbare resultaten in downstream toepassingen. Bovendien kan verminderen de mutant doordringendheid via deze selectieve fokken strategie onthullen de ontwikkelings processen waarvoor de functie van het gemuteerde gen meest cruciaal. Terwijl het skelet speciaal hier wordt geacht, stellen wij voor dat deze methode nuttig voor alle zebrafish mutant lijnen zijn zal.
Inleiding
De zebravis is een krachtig modelsysteem voor het begrijpen van de ontwikkeling van het skelet. Met mutant zebrafish stammen, kunnen biologen ontcijferen genfunctie tijdens skeletogenesis. Skelet mutant fenotypes van zebravis kunnen echter presenteren met variabele doordringendheid1,2,3,4 die ontwikkelingsstoornissen en genetische analyses kan belemmeren. Het doel van deze methode is drievoudig. Eerst, krommen zebrafish mutant die consequent ernstige fenotypen produceren kunt downstream developmental studies zoals time-lapse opname
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
alle experimenten beschreven in dit protocol werden voltooid in overeenstemming en naleving van de Universiteit van Colorado en de Universiteit van Oregon institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUC).
1. voorbereiding van de niet-geselecteerde beginnen voorraad
- identificeren heterozygoot dragers van de mutant allel van belang door fin bijknippen 11 en genotypering een voorraad van full-broer/zus dieren door een methode van keuze, zoals Kawasaki Advanced Safety 12 , 13 , 14. Dit protocol werd uitge....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol is een lange termijn veehouderij techniek handig voor begrip zebrafish skelet mutanten (Figuur 1). Selectieve fokken door het testen van de nakomelingen moet opleveren een verschuiving in de algehele doordringendheid zowel neerwaartse en opwaartse in een paar generaties (Figuur 2). In onze eerdere werk reed twee rondes van het selectieve fokken naar beneden de gemiddelde doordringendheid van 17% tot 3%
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Selectieve fokken onthult de subtiliteit van de genfunctie
Verschuiven van de mutant fenotypen om meer of minder ernstig door selectief fokken is een eenvoudige manier om te krijgen van nieuwe inzichten in genfunctie. In vergelijking met standaardmethoden voor niet-geselecteerde fokken, kan het protocol hier gepresenteerd een veel vollediger begrip van mutant fenotypen opleveren. In het bijzonder door het genereren van spanningen die ernstig zijn, kan de volledige breedte van .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We zouden graag bedanken Chuck Kimmel voor begeleiding, John Dowd voor hulp bij de ontwikkeling van deze strategie fokken, Macie Walker voor haar werk in het perfectioneren van de skeletal vlek, en Charline Walker en Bonnie Ullmann voor nuttig zebrafish advies. Dit werk werd gesteund door K99/R00 DE024190 te JTN.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is een veiligere alternatief voor poedervormige PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Moet van Anatech zijn |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | voor DNA kwantificering |
Referenties
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
