Hier presenteren we een gedetailleerd protocol bij het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren op letsel tijdens het inducerende in vivo herprogrammering. Deze methode is geschikt voor de evaluatie van de rol van cellulaire senescentie tijdens Weefselregeneratie en herprogrammering in vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cellulaire senescentie is een stress-respons die wordt gekenmerkt door de arrestatie van een stabiele cellulaire groei, die belangrijk is voor veel fysiologische en pathologische processen, zoals kanker en veroudering. Senescentie heeft onlangs ook betrokken bij weefselherstel en regeneratie. Dus, het is geworden steeds kritischer te identificeren verouderend cellen in vivo. Senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) assay is de meest gebruikte bepaling te detecteren verouderend cellen zowel in cultuur en in vivo. Deze test is gebaseerd op de verhoogde lysosomale inhoud in de verouderend cellen, waardoor de histochemische detectie van lysosomale β-galactosidase-activiteit bij een suboptimale pH (6 of 5.5). In vergelijking met andere testen, zoals de stroom cytometry, hierdoor is de identificatie van verouderend cellen in hun verblijfplaats omgeving, die waardevolle informatie zoals de locatie met betrekking tot de architectuur van weefsel, de morfologie, biedt en de mogelijkheid tot koppeling met andere markeringen via immunohistochemistry (IHC). De grote beperking van de bepaling van de SA-β-Gal is de vereiste van vers of bevroren monsters.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om te begrijpen hoe cellulaire senescentie bevordert cellulaire plasticiteit en weefsels regeneratie in vivo. We SA-β-Gal gebruiken voor het detecteren van verouderend cellen in de skeletspieren van verwonding, dat een gevestigde systeem is te bestuderen van weefselregeneratie. Bovendien gebruiken we IHC voor het detecteren van Nanog, een marker van pluripotente stamcellen, in een transgeen muismodel. Dit protocol laat ons toe om te onderzoeken en kwantificeren van cellulaire senescentie in het kader van geïnduceerde cellulaire plasticiteit en in vivo herprogrammering.
Inleiding
Cellulaire senescentie is een vorm van stressrespons gekenmerkt door een stabiel celcyclus arrestatie. In het laatste decennium, heeft onderzoek verankerd dat senescentie geassocieerd met verschillende biologische en pathologische processen wordt, met inbegrip van de embryonale ontwikkeling, fibrose en organisme vergrijzing van1,2. Cellulaire senescentie werd voor het eerst geïdentificeerd in menselijke fibroblasten aan het einde van hun Dr. levensduur getriggerd door telomere verkorting van3. Naast Dr. stress zijn er vele andere stimuli die senescentie induceren kunnen, met inbegrip va....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
dieren werden behandeld volgens de richtsnoeren van de Europese Gemeenschap en de ethische commissie van het Institut Pasteur (CETEA) goedgekeurde protocollen.
1. voorbereiding van de voorraad-oplossingen
- bereiden de materialen voor fixatie van de steekproef van de spier. Los 0,5 g Tragacanthgom met 20 mL water op RT om het bevriezing-insluiting medium voor spier fixatie.
- Bereiden van de oplossingen voor de SA-β-Gal kleuring.
- Bereiden de voorraadoplossingen van K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M) door het oplossen va....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Opsporen van spier letsel-geïnduceerde cellulaire senescentie
Het heeft onlangs aangetoond dat spier letsel voorbijgaande cellulaire senescentie14 induceert. Op 10 dagen na letsel (DPI), de meerderheid van de beschadigde myofibers ondergaan regeneratie met de centraal gelegen kernen, een kenmerk van het regenereren van de myofibers, en de architectuur van de spier is hersteld. De infiltrating ontstekingscell.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier presenteren we een methode voor het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren van Herprogrammeerbare muizen. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen en kwantificeren van beide senescentie induceren cellulaire plasticiteit in vivoen onderzoeken van de rol van senescentie in weefselherstel en regeneratie.
In het huidige protocol, wordt de bepaling senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) gebruikt voor het detecteren van
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij zijn Clemire Cimper dank verschuldigd voor haar uitstekende technische ondersteuning. Werk in het laboratorium van H.L. werd gefinancierd door het Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche wetenschappelijke, en het Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), de Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) en Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. en A.C. worden gefinancierd door de Ph.D. en postdoctorale beurzen van het Consortium doen herleven.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | Voor SA-β Gal kleuringsoplossing |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | Voor SA-β Gal kleuringsoplossing |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | Voor SA-β Gal kleuringsoplossing |
| X-Gal | Sigma | B4252 | Voor SA-β Gal kleuringsoplossing |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | Voor het induceren van in vivo herprogrammering |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, Frankrijk | L8102 | Voor spierbeschadiging |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | Voor fixatieoplossing |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | Voor fixatieoplossing |
| NaCitrate : Natriumcitraat monobasisch bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | Voor permeabilisatieoplossing |
| Triton | Sigma | 93443 | Voor permeabilisatieoplossing |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Wasoplossing |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Konijnen monoklonaal antilichaam |
| EnVision+ Kits (HRP. Konijn. DAB+) | Dako | K4010 | Voor Nanog-revelatie |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Contrakleuring |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Contrakleuring |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Monteringsoplossing |
| Snelhardende montagemedium voor microscopie: Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Monteringsoplossing |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectieven | Olympus | CKX41 | Microscoop voor Nanog-kwantificering |
| Muis: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Herprogrammeerbaar muismodel |
| Skelettalspier, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | Schermen van dia's |
Referenties
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
