Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56201

⸱

26 oktober 2017

 ,  , 
1Cellular Plasticity & Disease Modelling, Department of Developmental & Stem Cell Biology, CNRS UMR 3738, Institut Pasteur

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol bij het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren op letsel tijdens het inducerende in vivo herprogrammering. Deze methode is geschikt voor de evaluatie van de rol van cellulaire senescentie tijdens Weefselregeneratie en herprogrammering in vivo.

Samenvatting

Cellulaire senescentie is een stress-respons die wordt gekenmerkt door de arrestatie van een stabiele cellulaire groei, die belangrijk is voor veel fysiologische en pathologische processen, zoals kanker en veroudering. Senescentie heeft onlangs ook betrokken bij weefselherstel en regeneratie. Dus, het is geworden steeds kritischer te identificeren verouderend cellen in vivo. Senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) assay is de meest gebruikte bepaling te detecteren verouderend cellen zowel in cultuur en in vivo. Deze test is gebaseerd op de verhoogde lysosomale inhoud in de verouderend cellen, waardoor de histochemische detectie van lysosomale β-galactosidase-activiteit bij een suboptimale pH (6 of 5.5). In vergelijking met andere testen, zoals de stroom cytometry, hierdoor is de identificatie van verouderend cellen in hun verblijfplaats omgeving, die waardevolle informatie zoals de locatie met betrekking tot de architectuur van weefsel, de morfologie, biedt en de mogelijkheid tot koppeling met andere markeringen via immunohistochemistry (IHC). De grote beperking van de bepaling van de SA-β-Gal is de vereiste van vers of bevroren monsters.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om te begrijpen hoe cellulaire senescentie bevordert cellulaire plasticiteit en weefsels regeneratie in vivo. We SA-β-Gal gebruiken voor het detecteren van verouderend cellen in de skeletspieren van verwonding, dat een gevestigde systeem is te bestuderen van weefselregeneratie. Bovendien gebruiken we IHC voor het detecteren van Nanog, een marker van pluripotente stamcellen, in een transgeen muismodel. Dit protocol laat ons toe om te onderzoeken en kwantificeren van cellulaire senescentie in het kader van geïnduceerde cellulaire plasticiteit en in vivo herprogrammering.

Inleiding

Cellulaire senescentie is een vorm van stressrespons gekenmerkt door een stabiel celcyclus arrestatie. In het laatste decennium, heeft onderzoek verankerd dat senescentie geassocieerd met verschillende biologische en pathologische processen wordt, met inbegrip van de embryonale ontwikkeling, fibrose en organisme vergrijzing van1,2. Cellulaire senescentie werd voor het eerst geïdentificeerd in menselijke fibroblasten aan het einde van hun Dr. levensduur getriggerd door telomere verkorting van3. Naast Dr. stress zijn er vele andere stimuli die senescentie induceren kunnen, met inbegrip van DNA schade, oxidatieve stress oncogene signalen en genomische/epigenomic wijzigingen, die kan uiteindelijk het p53/p21 en/of pRB emissieroutes naar de activeren vaststellen en versterken van de permanente groei arrestatie1. Een van de belangrijke kenmerken van verouderend cellen is dat ze metabolisch actief blijven en krachtig express een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP): afscheiding van vele inflammatoire cytokines, groeifactoren en extracellulaire matrix factoren4. SASP factoren een belangrijke rol in het bemiddelen en versterken het senescentie effect, als gevolg van hun krachtige effecten op het aantrekken van immuuncellen en wijzigen van lokale en systemische weefsel milieus1voorgesteld. Interessant, heeft senescentie onlangs voorgesteld als belangrijk weefsel reparatie en regeneratie5,6. Gegevens uit verschillende labs, met inbegrip van ons, heeft bovendien voorgesteld dat weefsel schade-geïnduceerde senescentie cellulaire plasticiteit, via SASPs, ter bevordering van de regeneratie7-9zou kunnen verbeteren. Daarom, alle opkomende gegevens benadruk het belang van het bestuderen van senescentie in vivo.

In de post geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) tijdperk is cellulaire plasticiteit de capaciteit van een cel om een nieuwe identiteit te verwerven en te nemen een alternatieve lot wanneer blootgesteld aan verschillende stimuli, beide in cultuur en in vivo10. Het is bekend dat volledige herprogrammering bereikt in vivo11,12 worden kan, waar de uitdrukking van de de cassette met vier Yamanaka factoren: Oct4, Sox2, Klf4en c-Myc (OSKM) kunnen geïnduceerde in vivo ter bevordering van de vorming van de teratomas in meerdere organen. Daarom kan een Herprogrammeerbare muismodel (i4F) worden gebruikt als een krachtig systeem om kritische toezichthouders en trajecten die belangrijk voor cellulaire plasticiteit11 zijnte identificeren.

Een geschikt en gevoelige in vivo systeem is essentieel om te begrijpen hoe cellulaire senescentie regelt cellulaire plasticiteit in het kader van weefselregeneratie. Wij presenteren hier een robuust systeem en een gedetailleerd protocol bij het evalueren van het verband tussen senescentie en cellulaire plasticiteit in het kader van weefselregeneratie. De combinatie van cardiotoxin (CTX) geïnduceerde spier schade in de Tibialis Anterior (TA) spiergroep, een gevestigde systeem te bestuderen Weefselregeneratie en de muismodel van i4F, kan de detectie van cellulaire senescentie zowel in vivo herprogrammering tijdens regeneratie van de spier.

Om te beoordelen van het verband tussen cellulaire plasticiteit en senescentie, zijn i4F muizen gewonden met CTX voor het opwekken van acute spier schade en behandeld met doxycycline (0,2 mg/mL) meer dan 7 dagen voor het opwekken van in vivo herprogrammering. Terwijl een CTX acute spier schade geïnduceerde en regeneratie protocol heeft onlangs gepubliceerde13, om ethische redenen, zal deze procedure in het huidige protocol worden weggelaten. TA spier monsters zal worden genomen op 10 dagen post letsel13, wanneer het hoogtepunt van verouderend cellen zijn eerder waargenomen14. Dit gedetailleerde protocol beschrijft hier, alle vereiste stappen voor het evalueren van het niveau van senescentie (via SA-β-Gal) en herprogrammering (via IHC kleuring voor Nanog).

Senescentie-geassocieerde beta-galactosidase (SA-β-Gal) assay is de meest gebruikte test voor de opsporing van beide verouderend cellen in cultuur en in vivo15. Vergeleken met andere testen, maakt de SA-β-Gal-bepaling de identificatie van de verouderend cellen in hun eigen omgeving met intact weefsel architectuur, die vooral belangrijk voor in vivo onderzoek is. Bovendien is het mogelijk om alleen de SA-β-Gal-assay met andere markeringen met behulp van IHC. Echter, de SA-β-Gal assay hoeft vers of bevroren monsters, die nog steeds een belangrijke beperking. Wanneer vers of bevroren weefsels routinematig beschikbaar, zoals bevroren TA spier monsters zijn, is SA-β-Gal uiteraard de meest geschikte test te detecteren verouderend cellen. NANOG is de markering gebruikt om te ontdekken van reprogramed cellen om twee redenen: 1) het is een fundamentele marker voor pluripotent; 2) nog belangrijker, de expressie wordt niet gedreven door doxycycline (dox), dus het detecteert geïnduceerde pluripotent in plaats van de gedwongen expressie van de Yamanaka cassette.

Het is belangrijk op te merken, de kleuring protocollen gepresenteerd in deze studie kunnen afzonderlijk worden uitgevoerd om de kwantificering procedure te vereenvoudigen, maar kunnen ook worden gedaan in een mede kleuring procedure te visualiseren beide verouderend en pluripotente stamcellen op dezelfde sectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

dieren werden behandeld volgens de richtsnoeren van de Europese Gemeenschap en de ethische commissie van het Institut Pasteur (CETEA) goedgekeurde protocollen.

1. voorbereiding van de voorraad-oplossingen

  1. bereiden de materialen voor fixatie van de steekproef van de spier. Los 0,5 g Tragacanthgom met 20 mL water op RT om het bevriezing-insluiting medium voor spier fixatie.
  2. Bereiden van de oplossingen voor de SA-β-Gal kleuring.
    1. Bereiden de voorraadoplossingen van K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M) door het oplossen van de respectieve poeders in gedestilleerd water.
    2. De stockoplossing van 0,2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (eosine) door het verdunnen in water bereiden.
    3. Bereiden de stockoplossing van C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) door de ontbinding van het poeder van de X-gal in C 3 H 7 geen (dimethylformamide, DMF).
    4. Winkel K 3 Fe(CN) 6 en K 4 Fe(CN) 6 oplossingen bij 4 ° C, en MgCl 2 op RT.
      Opmerking: X-gal kan worden opgeslagen in aliquot deel bij-20 ° C, maximaal 6 maanden. Eosine oplossing kan worden bewaard bij RT en hergebruikt na filtering indien nodig. K 3 Fe(CN) 6 en K 4 Fe(CN) 6 oplossingen zijn protectedfromthe licht. X-gal oplossing is niet stabiel in water en moet worden beschermd tegen licht.
  3. Voorbereiding van de oplossingen voor Nanog kleuring: de permeabilization oplossing bevat 0,1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (Trinatriumcitraat citraat), 0,1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) in gedestilleerd water, die moeten worden bewaard bij 4 ° C. bereid de blokkerende oplossing met 5% foetale runderserum (FBS) in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), die moet worden opgeslagen op de RT.

2. SA-β-Gal Staining op bevroren TA spier sectie

  1. bereiden de fixatie materiaal voor de TA-spier door het plaatsen van een kleine hoeveelheid van de tragacanth tandvlees op een schijfje van cork.
  2. Injured muizen van beide geslachten (2 maanden oud, C57/B6) raakten gewond 10 dagen vóór de met cardiotoxin (CDX) zoals eerder beschreven 13. Gebruik niet-gewond (PBS injectie) TA van de dezelfde muis als de negatieve controle. Desgewenst in vivo herprogrammering is behandelen elke muis met Dox (1 mg/mL) in het drinkwater op dezelfde dag (beschermd tegen het licht), direct na CTX letsel.
    Opmerking: De Dox oplossing dient te worden gewijzigd om de 3 dagen een totale behandeling gedurende 7 dagen.
    1. Isoleren zowel TA spieren (gewond en controle) van muizen zoals eerder is beschreven ( figuur 1A) 13. Te waarborgen de dwarse secties, de distale pees van de spier TA invoegen de Tragacanthgom en laat ongeveer ¾ deel van de spier buiten ( figuur 1B) bevriezen in vloeibare stikstof rechtstreeks gekoeld tolueen voor < 1 min.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de TA spier in een loodrechte positie en in het midden van de kurk. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C, of direct cryosectioned in secties van 10 µm.
  3. De TA spieren verwerken zoals beschreven in de figuur 1B.
    1. Verdelen de 1 st -10 th secties in de juiste volgorde in tien verschillende dia's op de linksboven positie van elke dia. Plaats de 11 th sectie grenzend aan de 1 st-sectie op de eerste dia; de 12 th sectie zal volgen dezelfde volgorde rechts naast de 2 nd-sectie op de tweede dia worden geplaatst. Herhaal dit proces tot 10 secties/dia worden verkregen voor tien dia's (100 afdelingen in totaal) om ervoor te zorgen van minimaal 1 mm afstand tussen de eerste en de laatste sectie.
  4. Fix de secties voor 4 min in PBS met 1% paraformaldehyde en 0,2% Glutaaraldehyde. Wassen met PBS, 2 x 10 min. Volgende, Incubeer de secties in PBS (pH = 5.5) voor 30 min. het uitvoeren van alle stappen op RT.
    Opmerking: De fixatie moet worden mild te handhaven enzymatische activiteit. Voer deze stap onder de motorkap. De pH van de PBS is kritisch en de X-gal oplossing moet worden beschermd tegen licht.
  5. Incubate secties in de X-gal oplossing, bevattende: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 en 400 µg/mL X-Gal in PBS, pH = 5.5. Incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende ten minste 24 h. Wash de dia's met PBS, 3 x 10 min., op RT.
    Opmerking: De incubatie vereist een minimum van 24 uur en 48 uur om te maximaliseren van het signaal van de SA-β-Gal kan duren. De oplossing dient te worden gewijzigd na 24 uur incubatie. De dia's moeten worden beschermd tegen licht. Als alleen SA-β-Gal kleuring wordt gewenst, ga verder met stap 2.5. Als mede met Nanog kleuring wordt gewenst, gelieve vooruit naar stap 3.1.
  6. Fix dia's in 1% paraformaldehyde in PBS voor 30 min. Wash dia's met PBS, 3 x 10 min. Counterstain met 0,2% eosine. Onderdompelen van de dia's in de oplossing van eosine voor 1 minuut en spoel ze kort met gedestilleerd water. Tot slot, monteren de dia's met waterige niet-fluorescerende montage medium (Zie Tabel of Materials).
    Opmerking: Het is essentieel voor het uitvoeren van de na fixatie. Voer deze stap onder de motorkap. Alle stappen worden uitgevoerd op RT.

3. Immunohistochemistry met behulp van Anti-Nanog antilichaam

  1. herstellen van de dia's met PBS met 4% paraformaldehyde voor 10 min. wassen met PBS, 2 x 10 min. toevoegen 200 µL van de permeabilization oplossing direct op de dia's en incubeer gedurende 5 min.
    1. -Wash glijbanen met PBS, 2 x 5 min en in de laatste wasbeurt, gebruik 200 µL PBS met 0,25% BSA rechtstreeks op de dia's. Uitvoeren van al deze stappen op RT.
      Let op: Voer de fixatie stap onder de motorkap.
  2. Incubate dia's met de primaire anti-Nanog antilichaam (eindconcentratie: 1,25 mg/mL) overnachting bij 4 ° C in PBS met 5% FBS. Dia's met PBS, 2 x 10 min wassen en in de laatste wasbeurt, gebruik 200 µL PBS met 0,25% BSA voor 5 min. uitvoeren alle het wassen stappen bij RT.
    Opmerking: Dia's in een doos met natte papieren handdoek om te voorkomen dat verdamping Incubeer.
  3. Incubate dia's met 100 µL van rAb-HRP secundair antilichaam uit een gebruiksklare kit (Zie Tabel of Materials) voor 45 min. Wash om dia's met PBS, 3 x 5 min, verwijderen van secundair antilichaam. Uitvoeren van alle stappen op RT met bescherming tegen licht.
  4. Visualisatie
    1. eerste, Verdun de 3,3 '-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), schar) in de buffer van het substraat geboden door de gebruiksklare kit (20 µL van DAB voor 1 mL van de bufferoplossing substraat). Voeg 100 µL van DAB oplossing direct op elke dia en incubeer gedurende maximaal 10 min op RT.
      Opmerking: De verdunde oplossing DAB moet vers worden bereid en kan worden opgeslagen voor tot een week bij 4 ° C. De incubatietijd kan worden aangepast om te minimaliseren van het signaal van de achtergrond, maar moet hetzelfde zijn voor alle dia's.
    2. Verwijderen de DAB-oplossing door te spoelen met water. Counterstain de dia's met snel rode oplossing (klaar om te gebruiken, raadpleegt u de Tabel of Materials) voor 20 min. Wash de dia's met water nogmaals kort.
    3. Uitdrogen hen met 95% ethanol voor 5 min gevolgd door 100% ethanol, 2 x 5 min. Tot slot, monteren de dia's met een snel uithardend montage medium (Zie Tabel of Materials).
    4. Observeren de dia's onder de Microscoop in helder veld 20 X te vermijden achtergrond.
      Opmerking: Snel rode oplossing kan worden bewaard bij RT en hergebruikt na filtering.

4. Analyse en kwantificering

  1. SA-β-Gal kwantificering
    1. scannen van dia's en kies de beste gedeelten op elke dia op basis van de verworven beelden. Gebruik minstens 2 secties/TA voor de kwantificering. Beoordelen van de sectie ' s kwaliteit op basis van weefsel integriteit, kwaliteit van de kleuring en counterstaining. Kies voor de kwantificering, de twee hoogste kwaliteit secties met de maximaal mogelijke afstand tussen monsters, waarmee een betere vertegenwoordiging van SA-β-Gal kwantificering gedurende de hele TA spier.
    2. Kwantificering van SA-β-Gal positieve cellen ( Figuur 2).
      1. Bepalen de rang van de pixelgrootte door handmatig de kleinste en de grootste positieve SA-β-Gal cellen te selecteren.
        1. Open de digitale afbeelding van de gescande dia ImageJ softwarematig.
        2. In de interface, klikt u op ' analyseren ' > ' Tools ' > ' ROI Manager ' > ' analyseren ' > ' meting instellen ' > ' Selecteer gebied '. Gebruik het gereedschap selecteren en omringen de kleinste en grootste positieve SA-β-Gal cel en toevoegen aan de ROI-manager door te klikken op ' toevoegen '. Meet de maten met behulp van de ' maatregel ' knop en de waarden voor later gebruik opslaan.
      2. Aanpassen van de parameter van de drempel om ervoor te zorgen dat alle zichtbare positieve cellen zijn geselecteerd.
        1. Zet de afbeelding om grijstinten door te klikken op ' Image ' > ' type ' > ' 8-bits ' ( figuur 2A). Ga vervolgens naar ' Image ' > ' aanpassen ' > ' drempel ', de tweede cursor totdat alle positieve SA-β-Gal cellen zijn bedekt met rood ( figuur 2B), en klik vervolgens ' toepassen '.
        2. Analyseren deeltjes door te klikken op ' analyseren ' > ' analyseren deeltjes ' > ' grootte (pixel ^ 2) ', en de waarde die is gedefinieerd in stap 4.1.2.1 toepassen, voert u ' cirkelvormigheid ': ' 0.00-1.00 ', klik op ' ok '; een samenvatting van alles wat de getelde deeltjes wordt weergegeven in de ROI-manager ( figuur 2D).
      3. Transfer van alle geselecteerde deeltjes naar de oorspronkelijke afbeelding. Pas de selectie handmatig om ervoor te zorgen nauwkeurige kwantificering. Toevoegen van positieve cellen (groene pijl, 2E figuur) en/of verwijderen van valse positieve cellen (rode pijl, 2E figuur). Ten slotte meten het gebied waarin de sectie ( figuur 2D) met behulp van de ' gereedschap selecteren '. Klik op ' ROI manager ' > ' toevoegen ' > ' maat '.
      4. Nog belangrijker is, het aantal positieve cellen door het gebied van de sectie normaliseren.
  2. Nanog kwantificering
    1. Nanog positieve cellen onder de Microscoop in het heldere veld handmatig 20 X vergroting tellen.
      Opmerking: Het snel rode counterstaining maakt het mogelijk goede evaluatie van de morfologie van de TA spier. De kleuring is echter zeer licht en ontbreekt een duidelijke schets van de sectie. De scanner vaak niet identificeren van de grens van de secties en niet goed kan concentreren. Het is mogelijk om te gebruiken markering aan de randen van de secties cirkel voordat u gaat scannen of gebruiken van een gevoeliger scanner voor het detecteren van de sectie. Voor het huidige protocol, is het meest efficiënt om de Nanog positieve cellen handmatig tellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Opsporen van spier letsel-geïnduceerde cellulaire senescentie

Het heeft onlangs aangetoond dat spier letsel voorbijgaande cellulaire senescentie14 induceert. Op 10 dagen na letsel (DPI), de meerderheid van de beschadigde myofibers ondergaan regeneratie met de centraal gelegen kernen, een kenmerk van het regenereren van de myofibers, en de architectuur van de spier is hersteld. De infiltrating ontstekingscell...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier presenteren we een methode voor het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren van Herprogrammeerbare muizen. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen en kwantificeren van beide senescentie induceren cellulaire plasticiteit in vivoen onderzoeken van de rol van senescentie in weefselherstel en regeneratie.

In het huidige protocol, wordt de bepaling senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) gebruikt voor het detecteren van

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij zijn Clemire Cimper dank verschuldigd voor haar uitstekende technische ondersteuning. Werk in het laboratorium van H.L. werd gefinancierd door het Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche wetenschappelijke, en het Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), de Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) en Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. en A.C. worden gefinancierd door de Ph.D. en postdoctorale beurzen van het Consortium doen herleven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
K3Fe(CN)6Sigma13746-66-2Voor SA-β Gal kleuringsoplossing
K4Fe(CN)6Sigma14459-95-1Voor SA-β Gal kleuringsoplossing
MgCl2Sigma7786-30-3Voor SA-β Gal kleuringsoplossing
X-GalSigmaB4252Voor SA-β Gal kleuringsoplossing
DoxycyclineSigmaD3447Voor het induceren van in vivo herprogrammering
CardiotoxinLotaxan Valence, FrankrijkL8102Voor spierbeschadiging
GlutaraldehydeSigma111-30-8Voor fixatieoplossing
ParaformaldehydeElectron microscopy science50-980-487Voor fixatieoplossing
NaCitrate :
Natriumcitraat monobasisch bioxtra, anhydre		Sigma18996-35-5Voor permeabilisatieoplossing
TritonSigma93443Voor permeabilisatieoplossing
Bovine Serum AlbuminSigmaA3608Wasoplossing
Antibody anti- NanogCell signalling8822SKonijnen monoklonaal antilichaam
EnVision+ Kits (HRP. Konijn. DAB+)DakoK4010Voor Nanog-revelatie
Eosin 1%Leica380159EOFContrakleuring
Fast redVector LaboratoriesH-3403Contrakleuring
Thermo Scientific Shandon Immu-MountFisher scientific9990402Monteringsoplossing
Snelhardende montagemedium voor microscopie: Eukitt®Sigma25608-33-7Monteringsoplossing
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectievenOlympusCKX41Microscoop voor Nanog-kwantificering
Muis: i4F-AAbad et al., 2013N/AHerprogrammeerbaar muismodel
Skelettalspier, Tibialis Anterior
Slide ScannerZeissAxio Scan Z1Schermen van dia's

Referenties

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528(2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

In vivo senescentieskeletspierletselSA beta gal assayimmunohistochemie Nanogcellulaire plasticiteitweefselregeneratiespierregeneratiedetectie van senescentietransgeen muismodel
Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.