Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56212

⸱

22 augustus 2017

 ,  , 
1Department of Biology, University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een methode voor het meten van direct transfer-RNA opladen niveaus van gezuiverde Escherichia coli RNA als een manier om te vergelijken van de relatieve niveaus van transfer-RNA, of elke andere korte RNA, over verschillende steekproeven gebaseerd op de toevoeging van spike-in cellen die een referentie-gen uitdrukt.

Samenvatting

Transfer-RNA (tRNA) is een essentieel onderdeel van de vertalende machine in een organisme. tRNAs binden en overbrengen van aminozuren naar het ribosoom vertalen. Het relatieve niveau van verschillende tRNAs, en de verhouding van aminoacylated tRNA aan totale tRNA, bekend als het opladen niveau, zijn belangrijke factoren bij het bepalen van de nauwkeurigheid en snelheid van de vertaling. Dus, de overvloed en opladen niveaus van tRNAs zijn belangrijke variabelen te meten bij de studie van de eiwitsynthese, bijvoorbeeld onder verschillende omstandigheden van stress. Hier beschrijven we een methode voor het verzamelen van tRNA en direct meten van zowel de relatieve overvloed en het absolute opladen niveau specifieke tRNA soorten in Escherichia coli. Het tRNA wordt geoogst op een zodanige wijze dat de labiele band tussen het tRNA en haar aminozuur behouden blijft. RNA is vervolgens onderworpen aan de Elektroforese van het gel en de noordelijke bevlekken, wat resulteert in de scheiding van de geladen en ongeladen tRNAs. De niveaus van specifieke tRNAs in verschillende monsters kunnen worden vergeleken als gevolg van de toevoeging van spike-cellen voor normalisatie. Voorafgaand aan de zuivering van het RNA voegen we 5% van de cellen van E. coli die hen van de zeldzame tRNAselC aan elk monster. Het bedrag van het tRNA-soorten van belang in een monster is dan op de hoeveelheid tRNAselC in hetzelfde monster genormaliseerd. Toevoeging van spike-cellen vóór RNA zuivering heeft het voordeel ten opzichte van de toevoeging van gezuiverde spike-in RNAs die het ook goed is voor eventuele verschillen in cellysis efficiëntie tussen de monsters.

Inleiding

In de volgende, presenteren we een methode voor het kwantificeren van de specifieke tRNAs en meten hun opladen niveaus door het noordelijke bevlekken. De methode is gebaseerd op een techniek die het eerst ontwikkeld door Varshney et al. 1. door het oogsten van cellen in Trichloorazijnzuur (TCA) en het houden van de monsters bij 0 ° C gedurende de RNA-zuivering, is de ester-binding tussen het tRNA en het aminozuur geconserveerde2,3,4. Aminoacylated tRNAs kunnen worden onderscheiden van hun nonacylated tegenhangers door elektroforese van het gel en het noordelijke bevlekken, zijner tijd voor een verminderde mobiliteit van de aminoacylated in de gel, veroorzaakt door de covalent gebonden aminozuur5tRNA. Daarnaast presenteren we een protocol voor het normaliseren van tRNA hoeveelheden door toevoeging van spike-cellen de zelden gebruikte tRNAselC 4overexpressing.

tRNAs zijn enkele van de meest voorkomende moleculen in de bacteriële cel en een absoluut noodzakelijk onderdeel van de machine vertaling. tRNAs binden van aminozuren en deze overbrengen naar de vertalen ribosomen. De binding van aminozuren te tRNAs (aminoacylation of opladen) wordt vergemakkelijkt door het aminoacyl-tRNA-synthetases. De relatieve overvloed van verschillende geladen tRNAs is belangrijk om te zorgen voor de trouw van de eiwitsynthese, omdat ondervertegenwoordiging van de cognate betalen dat tRNA voor een bepaalde boodschapper-RNA (mRNA) codon verhoogt de waarschijnlijkheid dat een in de buurt van-cognate tRNA zal ten onrechte haar aminozuur aan de groeiende polypeptide-keten op het ribosoom6leveren. Het belang van geladen tRNA wordt weerspiegeld in de uitgebreide reactie van de E. coli cel tot een ernstige daling in de laden niveaus van een tRNA; de strenge reactie. Tijdens de strenge reactie is de synthese van tRNAs, ribosomaal RNAs en meeste mRNAs verlaagd ten gunste van de transcriptie van specifieke mRNAs aminozuur biosynthese en stress survival is gekoppeld en het groeitempo op jaarbasis van de cellen wordt drastisch verlaagd7 . Bovendien heeft recent werk van ons en anderen aangetoond dat E. coli actief de meerderheid van haar tRNA in reactie op benadrukt dat beperken vertaling4,8 degradeert, suggereren dat aanpassing van het tRNA niveaus mogelijk belangrijk voor het omgaan met dergelijke benadrukt. Betrouwbare metingen van tRNA abundanties en opladen niveaus zullen dus een belangrijk instrument voor het volledig begrijpen van bacteriële stress reacties.

E.coli wordt vaak gebruikt om uit te drukken van recombinante eiwitten en vanwege de verschillen tussen soorten in het codon gebruik, suboptimaal expressie is een probleem dat vaak geconfronteerd9. Dit kan worden omzeild door expressie van extra tRNAs nodig om te vertalen van de recombinante mRNA10. Metingen van tRNA opladen niveaus in dergelijke spanningen kunnen begeleiden probleemoplossing inspanningen en optimaliseren van eiwit expressie.

Deze methode maakt het ook mogelijk de detectie van "mischarging"; een tRNA molecuul aminoacylated met een niet-cognate aminozuur. Aminoacylation door verschillende aminozuren kan veroorzaken een tRNA migreren met lichtjes verschillende snelheden t/m polyacrylamide gels1,11. In sommige gevallen kan de methode ook worden gebruikt om te onderscheiden van andere wijziging patronen op identieke tRNAs3.

Andere vastgesteld biochemische procedure voor het onderzoek van tRNA opladen niveaus oxidatie is Perjodaat. De methode is gebaseerd op de observatie dat aminoacylated tRNA is beschermd tegen Perjodaat oxidatie en ongeladen tRNA niet. Na Perjodaat oxidatie behandeling het opladen van het tRNA wordt gebruikt voor het schatten van het opladen niveaus van de geoogste RNA. Echter, het opladen van verschillende tRNAs is aangetoond te worden beïnvloed door de behandeling waardoor sommige onnauwkeurigheid12. De methode gepresenteerde maatregelen opladen rechtstreeks uit gezuiverde RNA, dus exclusief eventuele vooroordelen van chemische of enzymatische reacties. Een beperking van deze methode is dat slechts één soort tRNA wordt ontdekt tegelijkertijd, zodat hoewel het dezelfde Noord vlek kan worden gestript en reprobed voor meerdere tRNAs, is het tijdrovend en enigszins moeizaam gegevens te verzamelen over de vele tRNAs.

Een betrouwbare manier van normaliseren monsters aan elkaar is van vitaal belang in studies waar het doel is om het relatieve niveau van een molecule van verschillende monsters met elkaar vergelijken. Hier introduceren we een normalisatie-procedure voor RNA waar een kleine hoeveelheid van E. coli cellen overexpressing de zeldzame tRNAselC wordt toegevoegd als een piek aan alle experimentele monsters vóór RNA zuivering. Deze methode is nuttig niet alleen bij de behandeling van tRNAs, maar voor relatieve kwantificering van elke soort van RNA wanneer de experimentele opzet is zodanig dat geen endogene RNA kan worden vertrouwd te presenteren in de dezelfde cellulaire concentraties in alle monsters. Bijvoorbeeld, wordt het niveau van een "schoonmaak" RNA-achtige ribosomaal RNA vaak gebruikt als een endogene verwijzing naar het vergelijken van de relatieve hoeveelheden van een andere RNA tussen verschillende monsters13. Maar dit is van weinig nut als de cellulaire concentratie van de referentie-RNA tussen de monsters varieert, zoals het geval voor ribosomaal RNA zijn kan als de bemonstering plaatsvindt tijdens een stress reactie15,16,17 of inwerkingtreding van de stationaire fase17. De toevoeging van spike-cellen aan de experimentele monsters vóór RNA zuivering biedt een solide en nauwkeurige manier van normalisatie onafhankelijk is van de bemonstering setup. Een andere manier van normalisatie is de toevoeging van een of meer spike-in RNAs aan de experimentele monsters na zuivering van RNA. Echter, houdt deze methode geen rekening met eventuele verschillen in RNA herstel tussen de monsters.

Cuvetten van E. coli die overexpress de verwijzing RNA als spike-cellen (Zie Figuur 1) in een experiment met E. coli heeft het nadeel dat het resultaten bovendien van een kleine hoeveelheid exogene E. coli total RNA aan de monsters. We corrigeren voor deze toevoeging door het analyseren van een steekproef met alleen spike-in cellen parallel met de experimentele monsters (Zie de noordelijke vlek in Figuur 2, lane met het label "selC"). Het protocol gepresenteerd is ontwikkeld voor E. coli K-12 maar dreigt te worden die van toepassing zijn voor de meeste bacteriesoorten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding van bacteriele.

  1. Groeien alle culturen in conische kolven met een cultuur/kolf volumeverhouding van hooguit 1/6. In een typische experimentele opzet, groeien de culturen bij 37.0 ° C en schudden bij 160 t/min in morpholinepropanesulfonic zuur (MOPS) minimaal middellange 18 aangevuld met de gewenste koolstofbron, bijvoorbeeld 0,2% glucose, voor ten minste 10 opeenvolgende generaties vóór RNA oogst.
  2. De dag vóór RNA oogst, Verdun een outgrown cultuur van de gewenste stam in MOPS minimaal medium op een zodanige wijze dat het de gewenste OD 436 op het gewenste tijdstip de volgende dag bereiken zal. Berekenen van het volume van cultuur ontgroeid te gebruiken voor inoculatie door de formule:
    figure-protocol-1
    Opmerking: hier, OD nieuwe duidt de gewenste OD 436 Na incubatie V nieuwe duidt het volume van de verdunde cultuur, OD oude duidt de OD 436 van de outgrown cultuur van verdund, G geeft het aantal generaties de cultuur groeien zal, van de tijd van verdunning (t-1) aan de tijd dat het nodig is de dag na (t 2) en kan worden berekend als: tijdsverschil (in minuten) tussen t 1 en t 2 gedeeld door de generatietijd (in minuten). Om ervoor te zorgen de steady-state groei op het tijdstip van bemonstering, G moet ≥ 10; V oude duidt het volume van de uitgaande volwassen cultuur die worden aan het verse medium overgedragen moet. Deze vergelijking is een benadering die houdt geen rekening met elke fase lag; een fenomeen dat vaak waargenomen na verdunning van een uitgaande volwassen cultuur in nieuwe media.
    1. Groei omstandigheden zal variëren afhankelijk van het doel van het experiment, maar als u wilt beperken cel-naar-cel variatie in tRNA niveaus en om de reproduceerbaarheid van de resultaten, (aanbevolen) groeien de culturen om stabiele staat Golden vóór de bemonstering 19.

2. Voorbereiding met spike-cellen

Opmerking: de E. coli-stam MAS1074, die spreekt van het gen van de selC codering tRNA selC onder de controle van een isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- afleidbare promotor wordt gebruikt als de Prikker-in stam.

  1. Dilute een outgrown cultuur van MAS1074 naar een OD-436 van 0,05 in MOPS minimaal medium aangevuld met 100 µg/mL ampicilline en 0,2% glucose. Groeien van de cultuur bij 37 ° C schudden bij 160 rpm.
    Opmerking: Zie de discussie voor het gebruik van een alternatieve referentiestam.
    2. IPTG toevoegen
  2. bij OD 436 ~ 0,1, om een eindconcentratie van 1 mM voor het opwekken van de expressie van tRNA selC. De cultuur uitgroeien tot OD 436 ~0.5 (~ 3-4 h van de groei) en de cultuur kolf naar een ijsbad. Houden van de spike-in celkweek op ijs totdat alle monsters voor RNA zuivering zijn geoogst.

3. Oogst van experimentele monsters.

  1. Pre warm (37 ° C) een afgetopte 100 mL conische kolf (of soortgelijke) met 4 mL 10% (m/v) Trichloorazijnzuur (TCA) voor elk monster door deze te plaatsen in een verwarmd waterbad.
    Opmerking: Let op, TCA ontleedt bij verwarming, produceren giftige en corrosieve dampen, met inbegrip van waterstofchloride en chloroform. De oplossing in water is een sterk zuur; het is bijtend voor de vele metalen en reageert heftig met honken. Juiste voorzorgsmaatregelen moet worden genomen bij het gebruik van deze vloeistof.
  2. Onmiddellijk voorafgaand aan de oogst van de cel, meten en registreren van de OD-436 van de cultuur.
  3. Breng om te oogsten van de cellen, 4 mL van cultuur een voorverwarmde kolf met TCA.
  4. Meng het monster door de wervelende de kolf met de hand voor 5 s. mengen met TCA onmiddellijk uitgeschakeld alle enzymatische activiteiten en aldus het opladen niveaus van de tRNAs behoudt.
    Opmerking: Als meerdere monsters worden verzameld, houd geoogste monsters in TCA op ijs totdat alle monsters verzameld.

4. Toevoeging van spike-cellen

Opmerking: voorbereiding met spike-cellen wordt beschreven in stap 2.

  1. Als alle monsters voor RNA voorbereiding zijn verzameld, 5% piek-in cellen (gebaseerd op de OD) toevoegen aan elk monster.
    Opmerking: Het volume van celkweek van een spike-in nodig wordt berekend door de formule:
    figure-protocol-2
    waar V piek het volume van celkweek van een spike-in nodig duidt, V exp duidt het volume van de geoogste experimentele celkweek (zonder TCA), OD exp duidt de OD 436 van de experimentele celcultuur ten tijde van de oogst in TCA. OD piek duidt de OD 436 van de spike-in celkweek. Als meerdere monsters worden geoogst op verschillende ODs, het volume spike-in cellen toegevoegd moet worden aangepast volgens de bovenstaande formule voor elk monster.
  2. Te kwantificeren van de bijdrage van de spike-cellen aan het RNA-soorten van belang, bereiden een monster met alleen spike-in cellen door het mengen van 4 mL spike-cellen met 4 mL TCA. Bereiden van RNA van dit voorbeeld op dezelfde manier als de andere monsters.
  3. Desgewenst nemen een andere kolf met alleen het experimentele monster, zonder spike-cellen, en opnemen om te kwantificeren van de bijdrage van de experimentele monster, tot het tRNA selC niveaus; de endogene niveaus van tRNA selC in E. coli K-12 zijn verwaarloosbaar laag.

5. Voorbereiding van RNA

Opmerking: The RNA voorbereiding protocol hier beschreven is in wezen die beschreven door Varshney et al. 1; Om te voorkomen dat deacylation van de aminoacylated tRNAs tijdens het zuiveringsproces ongehinderd is het belangrijk om te houden van de monsters bij zure pH en bij 0 ° C in de loop van zuivering. Gebruik schone steriele buizen/kolven te houden van de monsters en oplossingen, en stelt alle oplossingen met ultrazuiver (18.2 MΩ·cm soortelijke weerstand) water.

  1. Pour 8 mL van elk monster in een centrifugebuis met ijs gekoeld. Centrifugeer steekproeven voor 10 min bij 9.500 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen supernatant en resuspendeer in 0.3 mL koude 0,3 M Natriumacetaat, pH 4,5 en 10 mM EDTA.
  2. Elk monster overbrengen in een koude 1,5 mL microcentrifuge buis en toevoegen van 0.3 mL fenol geëquilibreerd met de dezelfde buffer.
    Opmerking: Let op, fenol giftige dampen produceert en is zeer corrosief voor de huid.
  3. Vortex elk monster 10 x voor 15 s met ten minste 1 min. tussen elke vortex. Tussen de vortexing houden de monsters bij 0 ° C. de frequente pauzes gebruiken om ervoor te zorgen dat de monsters koud blijven.
  4. Centrifuge monsters gedurende 15 minuten staan bij 20.000 x g bij 4 ° C. Transfer de waterfase (bovenste fase) naar nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen. Toevoegen van 0.3 mL koude fenol en vortex 4 x 15 s als voorheen.
  5. Centrifuge voor 10 min bij 20.000 x g bij 4 ° C. Transfer de waterfase aan nieuwe, koude 1,5 mL microcentrifuge buizen met 2,5 maal het volume van 96% ethanol (~ 750 µL). Neerslaan van het RNA door het broeden van de buizen gedurende 1 uur bij-20 ° C of 's nachts -80 ° C.
  6. Centrifuge monsters gedurende 30 minuten bij 20.000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en voeg voorzichtig 1 mL koude 70% ethanol zonder verstoring van de RNA-pellet. Voorzichtig omkeren eens te wassen van de binnenkant van de buizen met ethanol.
    Opmerking: De pellet kan worden moeilijk te zien bij deze stap.
  7. Centrifuge voor 10 min bij 20.000 x g bij 4 ° C. volledig Verwijder het supernatant en drogen van de pellet totdat geen ethanol niet. Resuspendeer de pellet door krachtig vortexing in 20 µL koude 10 mM natrium acetaat pH 4.5 en 1 mM EDTA.
    Opmerking: Doen niet overdreven drogen de pellet naarmate het zal moeilijk te resuspendeer.
  8. Optioneel, het beoordelen van de concentratie van RNA door het meten van de absorptie bij 260 nm.
  9. Optioneel, het beoordelen van de kwaliteit van het gezuiverde RNA door agarose gel elektroforese 20.
  10. Winkel monsters op -80 ° C.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
< p klasse"jove_title" = > 6. Voorbereiding van chemisch deacylated controlemonster

Opmerking: om te onderscheiden van de band van aminoacylated tRNA roepen vanaf de bijbehorende deacylated op de noordelijke vlek, een chemisch deacylated aliquoot wordt bereid door alkalische behandeling. Voor de meeste doeleinden, volstaat één sample deacylate voor elke noordelijke vlek.

  1. Dooi het RNA monster op ijs. Een aliquot 4 µL van het RNA-monster overbrengen in een nieuwe buis. 46 µL Tris-HCl pH 9.0 toevoegen. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
  2. 15 µL van 0,3 M Natriumacetaat toevoegen met een pH van 4.5 en voeg vervolgens 125 µL van 96% ethanol. Neerslag van RNA bij-20 ° C gedurende 1 h.
  3. Centrifuge gedurende 30 minuten bij 20.000 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen van supernatant en resuspendeer in 4 µL koude 10 mM natrium acetaat pH 4,5 en 1 mM EDTA.
    Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier, als het monster wordt opgeslagen bij -80 ° C.

7. Gel elektroforese en het noordelijke bevlekken

  1. Mix 4 µL monster (onbehandeld of chemisch deacylated) met 6 µL laden buffer (0,1 M Natriumacetaat (pH 5.0), 8 M ureum, 0.05% bromophenol blauw en 0,05% xyleen cyanol).
    Nota: Herinner me om op te nemen van het monster met alleen spike-in cellen, het chemisch deacylated monster (en het monster zonder spike-in cellen, als men was bereid).
  2. Laden de monsters op een 0,4 mm dikke 6,5% polyacrylamidegel (19:1-acrylam - ide:bisacrylamide) met 8 M ureum in 0,1 M natrium acetaat buffer (pH 5.0). 60 cm lange gels gebruiken voor correcte scheiding van tRNA soort(en).
  3. Aparte het RNA door elektroforese in 10 V/cm gel bij 4 ° C, tot de blauwe bromophenol bereikt de onderkant van de gel (~ 20 h).
  4. Het gebied van de xyleen cyanol kleurstof en 20 cm naar beneden naar de bromophenol-blauwe kleurstof wordt gebruikt voor het bevlekken (de afstand tussen de twee kleurstoffen moeten 25-30 cm). Zorgvuldig scheiden de twee glazen platen, zodat de gel op een van hen blijft. Een klein stukje filtreerpapier is op de maat van het gewenste Bevlekkende gebied gesneden en geplaatst op de top van het deel van de gel die wordt gebruikt voor het bevlekken. De onderdelen van de gel die niet onder het filtreerpapier vallen worden afgesneden en weggegooid. het koffiefilter kunt Trek voorzichtig de gel stuk uit de buurt van de glasplaat.
    Opmerking: De grote gel is erg kwetsbaar dus voorzichtig behandelen.
  5. Een positief geladen nylon membraan (bijvoorbeeld Hybond N + membraan) is geplaatst op de top van de gel en het is electroblotted bij 20 V voor 90 min 40 mM Tris-acetaat (pH 8.1), 2 mM EDTA gebruiken als overdracht buffer.
  6. Dwarslijn RNA aan het membraan met behulp van UV-licht (0,12 J/cm 2).
    Opmerking: Het membraan kan nu worden opgeslagen op kamertemperatuur en het protocol kan hier worden gepauzeerd.

8. Ontwerp en verificatie van sondes

Opmerking: zorgvuldige ontwerp en de verificatie van de noordelijke vlek sondes is cruciaal voor betrouwbare resultaten te verkrijgen en te voorkomen dat ongewenste Kruis-kruising met andere soorten RNA.

  1. Gebruik korte synthetische oligonucleotides als sondes. Ontwerpen van de volgorde van de sonde op een manier dat het is een aanvulling op het meest unieke deel van de reeks van het tRNA van belang - dit vaak de lus anticodon is.
    Opmerking: Een lijst met voorspelde tRNA-sequenties van verschillende organismen kan worden gevonden in de genomische tRNA Database (GtRNAdb) 21.
  2. Aanpassen van de lengte van de reeks te verkrijgen een voorspelde smelttemperatuur van 55-65 ° C.
  3. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) de gekozen volgorde tegen het genoom van de bacteriële stam gebruikt in het experiment, om te verifiëren dat de volgorde uniek voor de geselecteerde tRNA, is zoals beschreven in 22.
    Opmerking: Tabel 1 lijsten met voorgestelde sonde sequenties voor verscheidene verschillende tRNAs van E. coli K12. Als de sonde specifiek voor het tRNA van belang is, slechts twee bands zijn zichtbaar op de noordelijke vlek (geladen en ongeladen tRNA) en slechts één band is zichtbaar in de baan met het deacylated monster (ongeladen tRNA). Als meer dan twee bands aanwezig zijn of desgewenst verdere validatie van de specificiteit van de sonde is, zie bespreking.

9. Kruising van de noordelijke vlek

Opmerking: In de volgende stappen, het membraan is sequentieel gekruist met sondes ter aanvulling van de gewenste specifieke tRNAs, met inbegrip van een specifieke sonde voor de verwijzing tRNA selC.

  1. Plaats van het membraan in een kruising buis en voeg 6 mL hybridisatie oplossing (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7.7), 5 mM EDTA, 0,5% (w/v) SDS, 100 mg/mL van geschoren en gedenatureerd haring sperma DNA en 5 x Denhardt ' s oplossing (100 x Denhardt ' s oplossing = 2% bovien serumalbumine, 2% Polyvinylpyrrolidon 40 en 2% densiteitgradiënt)).
  2. Kruisen vooraf het membraan in de buffer voor 1 h roteren op 42 ° C. toevoegen 30 pmol radioactieve oligo-DNA sonde 5 ' - end - label met 32 P (voorbereid zoals beschreven door Sambrook et al. 23)
    Opmerking: Let op, de hoog-energetische bèta emissiesvan 32 P kunnen een aanzienlijke huid en oog dosis gevaar presenteren. Juiste voorzorgsmaatregelen moet worden genomen wanneer met behulp van 32 P. radioactief afval moet worden verwijderd volgens de passende institutionele veiligheid protocollen.
  3. Broeden de sonde met de membraan overnachting ronddraaiende 42 ° C. verwijderen de sonde die met behulp van een precisiepipet wegwerp 10 mL.
    Opmerking: Als in een vriezer opgeslagen de sonde kan worden hergebruikt.
  4. In de kruising buis, wassen het membraan binnenkort in 50 mL 0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitraat, 0,1% (g/v) SDS bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Deze eerste wassing bevat veel niet-afhankelijke sonde en moeten worden behandeld als hoogradioactief.
  5. Herhaal stap 9.4 eenmaal, dan de membraan verplaatsen naar een plat plastic container of de lade met inbegrip van een deksel. Betrekking hebben op het membraan met de wassen oplossing (0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitraat, 0,1% (g/v) SDS) en laat het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
  6. Wijzigen van de oplossing van het wassen en het wassen blijven totdat een bevredigende signaal / ruisverhouding is verkregen (vaak 3-4 veranderingen oplossing te wassen). Gebruikt een Geiger-Müller buis om te ontdekken hoe de ruis/signaal verhouding verandert door het meten van de straling van een leeg gebied van het membraan en het vergelijken met het gebied waar de sonde heeft gekruist wil tRNA.
  7. Om de sonde van het membraan strip na blootstelling, te kunnen zorgen dat (belangrijk) het membraan droogt niet uit voordat de stripping procedure. Plaats het membraan in een dunne plastic zak of wrap strak met plastic wrap en zegel te luchtdichte door tape of lassen. Plaatsen van het verzegelde membraan op een phosphorimaging scherm.
    Opmerking: De vereiste blootstellingstijd op het scherm van de phosphorimaging wordt bepaald door de specifieke activiteit van de sonde, het bedrag van RNA gesondeerd for, en de efficiëntie van de kruising van de sonde, en kan variëren sterk; een paar minuten tot meerdere dagen. Met ervaring geeft de intensiteit van de straling aangetroffen op het membraan met de Geiger-Müller buis een goede indicatie van de vereiste blootstellingstijd. Voor betrouwbare kwantificatie, is het belangrijk dat het scherm niet is overbelicht.
  8. De phosphorimaging-scherm met behulp van een laserscanner scannen en sla het bestand in " .gel " formaat.
    Opmerking: Een hoog signaal / ruisverhouding is nodig voor betrouwbare kwantificering. Indringende voor een tRNA zou moeten resulteren in twee bands; één met aminoacylated tRNA (langzamer migratie) en één met deacylated tRNA (sneller migratie). Zie Figuur 2.

10. Strippen van het membraan

Opmerking: voordat het membraan kan worden bestudeerd voor een ander tRNA, de vorige sonde eerst moet worden verwijderd door het strippen van de membraan.

  1. Warmte genoeg strippen buffer (15 mM NaCl, 1.5 mM Natriumcitraat, 0,1% (g/v) SDS) te dekken van het membraan en giet het over het membraan. Laat het 15 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
  2. Herhaal stap 10.1 tot geen straling kan worden opgespoord met een Geiger-Müller buis; het membraan kunnen nu opnieuw gehybridiseerde de procedure die wordt beschreven in sectie 9.

11. Kwantificeren van tRNA en opladen niveaus

  1. lading het bestand .gel in de beeldvorming software (Zie de Tabel van de materialen). Tekenen van een verticale lijn langs elk van de steekproef rijstroken op zodanige wijze dat het omvat allermeest naar de breedte van de rijstrook, maar omvat niet de randen van de bands waar het signaal kunnen ongelijke, zoals weergegeven in figuur 3A.
  2. Visualiseren telt van elke rijstrook door te klikken op " analyse "-> " grafiek maken ". Handmatig het definiëren van de twee bergtoppen die vertegenwoordigen de geladen en de ongeladen tRNA van elke lane, zoals weergegeven in figuur 3B.
  3. Elke piek graven verkrijgen door te klikken op " analyse "-> " gebied verslag ", en het opnemen van het gebied onder elk van de twee bergtoppen.
  4. Wanneer de vlek voor tRNA selC en ten minste één tRNA van belang, heeft zijn gesondeerd normaliseren de niveaus van het tRNA voor tRNA selC van belang.
    1. Berekenen van het aandeel van tRNA die afkomstig zijn van de piek-cellen in elke rijstrook en aftrekken van het totale signaal in die baan met behulp van de vergelijking:
      figure-protocol-3
      Opmerking: hier, Proeven van tRNA = het signaal verkregen uit een enkele rijstrook van een membraan gesondeerd voor de gewenste tRNA; Monster selC = het signaal verkregen uit de zelfde baan van het dezelfde membraan gesondeerd voor tRNA selC; Ref tRNA = het signaal verkregen van de rijstrook met alleen spike-in cel RNA van het dezelfde membraan gesondeerd voor de gewenste tRNA; Ref selC = het signaal verkregen van de rijstrook met alleen spike-in cel RNA van het dezelfde membraan gesondeerd voor tRNA selC.
    2. Te normaliseren, verdelen de gecorrigeerde waarde van het tRNA van iedere baan van het tRNA selC signaal van de dezelfde baan.
      Opmerking: De bijdrage aan het tRNA selC signaal uit de bemonsterde cellen is te verwaarlozen (Zie Figuur 2, lane label "-selC ").
  5. Berekenen van het niveau voor elke rijstrook opladen door het verdelen van het signaal van de piek die geladen tRNA met de som van het signaal vertegenwoordigt van zowel pieken tRNA (geladen + ongeladen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van de procedure die hier worden beschreven, de overvloed en opladen niveaus van drie tRNAs werden gemeten in E. coli K-12 vóór en tijdens het aminozuur honger.

De arginine-auxotroph stam NF9154 (thr leu zijn argH thi mtl supE44) werd geteeld voor minstens tien generaties in minimaal medium MOPS aangevuld met 0,4% glycerol, 50 µg Mo/mL threonine, leucine, arginine en 5 µg Mn/m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol wordt beschreven hoe u tegelijkertijd het te meten opladen van specifieke E. coli tRNAs en het relatieve niveau van de tRNAs in verschillende steekproeven te vergelijken. De kritieke punten van het protocol zijn 1) om de monsters op zodanige wijze dat de cellulaire tRNA opladen niveaus worden bewaard, 2) om te normaliseren tRNA hoeveelheden op zodanige wijze dat relatieve tRNA niveaus in verschillende monsters op betrouwbare wijze kunnen worden vergeleken, en 3) om de sp ecificity van de geselecteer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Marit Warrer voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek | Natuurwetenschappen [1323-00343B] en de Deense nationale Research Foundation [DNRF120].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
UreaMerck57-13-6Purity >99%
PolyacrylamideServa79-06-7
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide)BIO-RAD161-0201
Trichloroacetic acid (TCA)Sigma76-03-9
PhenolMerck108-95-2
IPTG
Glucose
Sodium Acetate
EDTA
Ethanol
Tris
Hydrochloric acid
Sodium Chloride
NaH2PO4
Sodium Citrate
SDS
Herring Sperm DNASigma100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidone
Ficoll
P32 γATPPerkin Elmer
DNA oligos (probes)TAG Copenhagen
Hybond N+ membraneGE HealthcareRPN203B
Crosslinker
ElectroblotterBIO-RAD
Typhoon FLA 7000 ScannerGE Healthcare28955809
Spectrophotometer
Hydridization oven
Geiger-Müller tube
Phosphor imager screenGE Healthcare
Hybridization tube
Culture Flasks
1.5 ml microcentrifuge tubes
20 ml centrifuge tubes
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
ImageQuantGE Healthcare
ExcelMicrosoft

Referenties

  1. Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
  2. Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
  3. Krüger, M. K., Sørensen, M. A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo. J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).
  4. Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
  5. Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
  6. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
  7. Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
  8. Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302(2015).
  9. Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
  10. Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  11. Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
  12. Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
  13. Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
  14. Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).
  15. Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
  16. McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
  17. Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
  18. Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
  19. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  20. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  21. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  22. Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
  23. Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Transfer RNAtRNA chargingRNA purificatiegelelektroforeseNorthern blottingspike in cellenRNA kwantificatieaminoacyl tRNAtRNA abundantie
Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.