Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Samenvatting

Hier presenteren we een methode voor het meten van direct transfer-RNA opladen niveaus van gezuiverde Escherichia coli RNA als een manier om te vergelijken van de relatieve niveaus van transfer-RNA, of elke andere korte RNA, over verschillende steekproeven gebaseerd op de toevoeging van spike-in cellen die een referentie-gen uitdrukt.

Samenvatting

Transfer-RNA (tRNA) is een essentieel onderdeel van de vertalende machine in een organisme. tRNAs binden en overbrengen van aminozuren naar het ribosoom vertalen. Het relatieve niveau van verschillende tRNAs, en de verhouding van aminoacylated tRNA aan totale tRNA, bekend als het opladen niveau, zijn belangrijke factoren bij het bepalen van de nauwkeurigheid en snelheid van de vertaling. Dus, de overvloed en opladen niveaus van tRNAs zijn belangrijke variabelen te meten bij de studie van de eiwitsynthese, bijvoorbeeld onder verschillende omstandigheden van stress. Hier beschrijven we een methode voor het verzamelen van tRNA en direct meten van zowel de relatieve overvloed en het absolute opladen niveau specifieke tRNA soorten in Escherichia coli. Het tRNA wordt geoogst op een zodanige wijze dat de labiele band tussen het tRNA en haar aminozuur behouden blijft. RNA is vervolgens onderworpen aan de Elektroforese van het gel en de noordelijke bevlekken, wat resulteert in de scheiding van de geladen en ongeladen tRNAs. De niveaus van specifieke tRNAs in verschillende monsters kunnen worden vergeleken als gevolg van de toevoeging van spike-cellen voor normalisatie. Voorafgaand aan de zuivering van het RNA voegen we 5% van de cellen van E. coli die hen van de zeldzame tRNA^selC aan elk monster. Het bedrag van het tRNA-soorten van belang in een monster is dan op de hoeveelheid tRNA^selC in hetzelfde monster genormaliseerd. Toevoeging van spike-cellen vóór RNA zuivering heeft het voordeel ten opzichte van de toevoeging van gezuiverde spike-in RNAs die het ook goed is voor eventuele verschillen in cellysis efficiëntie tussen de monsters.

Inleiding

In de volgende, presenteren we een methode voor het kwantificeren van de specifieke tRNAs en meten hun opladen niveaus door het noordelijke bevlekken. De methode is gebaseerd op een techniek die het eerst ontwikkeld door Varshney et al. ¹. door het oogsten van cellen in Trichloorazijnzuur (TCA) en het houden van de monsters bij 0 ° C gedurende de RNA-zuivering, is de ester-binding tussen het tRNA en het aminozuur geconserveerde^2,3,4. Aminoacylated tRNAs kunnen worden onderscheiden van hun nonacylated tegenhangers door elektroforese van het gel....

Protocol

1. voorbereiding van bacteriele.

1. Groeien alle culturen in conische kolven met een cultuur/kolf volumeverhouding van hooguit 1/6. In een typische experimentele opzet, groeien de culturen bij 37.0 ° C en schudden bij 160 t/min in morpholinepropanesulfonic zuur (MOPS) minimaal middellange ¹⁸ aangevuld met de gewenste koolstofbron, bijvoorbeeld 0,2% glucose, voor ten minste 10 opeenvolgende generaties vóór RNA oogst.
2. De dag vóór RNA oogst, Verdun een outgrown cultuur van de gewenste stam in MOPS minimaal medium op een zodanige wijze dat het de gewenste OD ₄₃₆ op het gewenste tijdstip de volgende dag bereiken zal. Be....

Resultaten

Met behulp van de procedure die hier worden beschreven, de overvloed en opladen niveaus van drie tRNAs werden gemeten in E. coli K-12 vóór en tijdens het aminozuur honger.

De arginine-auxotroph stam NF915⁴ (thr leu zijn argH thi mtl supE44) werd geteeld voor minstens tien generaties in minimaal medium MOPS aangevuld met 0,4% glycerol, 50 µg Mo/mL threonine, leucine, arginine en 5 µg Mn/m.......

Discussie

Dit protocol wordt beschreven hoe u tegelijkertijd het te meten opladen van specifieke E. coli tRNAs en het relatieve niveau van de tRNAs in verschillende steekproeven te vergelijken. De kritieke punten van het protocol zijn 1) om de monsters op zodanige wijze dat de cellulaire tRNA opladen niveaus worden bewaard, 2) om te normaliseren tRNA hoeveelheden op zodanige wijze dat relatieve tRNA niveaus in verschillende monsters op betrouwbare wijze kunnen worden vergeleken, en 3) om de sp ecificity van de geselecteer.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Urea	Merck	57-13-6	Purity >99%
Polyacrylamide	Serva	79-06-7
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide)	BIO-RAD	161-0201
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma	76-03-9
Phenol	Merck	108-95-2
IPTG
Glucose
Sodium Acetate
EDTA
Ethanol
Tris
Hydrochloric acid
Sodium Chloride
NaH2PO4
Sodium Citrate
SDS
Herring Sperm DNA	Sigma	100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidone
Ficoll
P32 γATP	Perkin Elmer
DNA oligos (probes)	TAG Copenhagen
Hybond N+ membrane	GE Healthcare	RPN203B
Crosslinker
Electroblotter	BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner	GE Healthcare	28955809
Spectrophotometer
Hydridization oven
Geiger-Müller tube
Phosphor imager screen	GE Healthcare
Hybridization tube
Culture Flasks
1.5 ml microcentrifuge tubes
20 ml centrifuge tubes
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ImageQuant	GE Healthcare
Excel	Microsoft