Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Summary

Hier is een eenvoudige methode voor het maken van een bibliotheek van high-density transposon invoeging in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw. Dit protocol kan de oprichting van een verzameling van honderden duizenden van unieke mutanten in bacteriën door de willekeurige genomic invoeging van een transposon.

Abstract

Transposon mutagenese is een methode waarmee de verstoring van het gen via de willekeurige genomic invoeging van een stukje DNA een transposon genoemd. Het onderstaande protocol beschrijft een methode voor hoogrenderende overdracht tussen bacteriestammen van een plasmide herbergen een transposon met een marker kanamycine weerstand. Het plasmide-gedragen transposase is gecodeerd door een variant tnp -gen dat de transposon ingevoegd in het genoom van de ontvangende stam met zeer lage dat bias. Met deze methode kan dus het creëren van grote mutant bibliotheken waarin transposons in unieke genomic posities in een ontvangende spanning van of Escherichia coli of Shigella flexneri bacteriën zijn ingevoegd. Met behulp van bacteriële conjugatie, in tegenstelling tot andere methoden zoals electroporation of chemisch te worden verwerkt, kunnen grote bibliotheken met honderden duizenden unieke klonen worden gemaakt. Dit levert high-density invoeging Bibliotheken, met invoegingen die zich voordoen zo vaak als elke 4-6-basenparen in niet-essentiële genen. Deze methode is superieur aan andere methoden, omdat het zorgt voor een goedkope, makkelijk te gebruiken en hoge efficiëntie-methode voor de oprichting van een dichte transposon invoeging bibliotheek. De transposon bibliotheek kan worden gebruikt in downstream toepassingen zoals transposon sequencing (Tn-Seq), afleiden van genetische interactienetwerken, of meer gewoon, in vogelgriepvirus (voorwaarts genetische) schermen.

Introduction

De oprichting van transposon mutagenese bibliotheken bij bacteriën is handig voor een breed scala aan toepassingen, variërend van ontdekkingen van virulentiegenen in bacteriële pathogenen^1,2, naar studies van essentiële genen^{3, 4 , 5 , 6}: de identificatie van genetische interactie netwerken^7,8,9. Cruciaal belang voor deze studies is de mogelijkheid om het maken van een grote bibliotheek van mutanten. Het gebruik van transposons (korte fragmenten van DNA die willekeurig in een genoom invoegt) is een eenvoudig middel voor het verstoren van de genfunctie, zoals het inbrengen van een transposon binnen de open leesraam of regelgevende regio van een gen vaak de functie of expressie verstoren zal van het gen.

Hier geschetst is een methode voor het creëren van een transposon bibliotheek in E. coli of S. flexneri door bacteriële conjugatie met behulp van de plasmide pJA1¹⁰. Er zijn twee belangrijke voordelen aan het gebruik van deze plasmide. Het eerste voordeel is dat de variant van de transposase van de Tn10 van het pJA1-plasmide uitgedrukt afleidbare en laag invoegen bias^{11,12 heeft}, wat betekent dat het transposon willekeurig in het genoom integreren zal wanneer Isopropyl Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) wordt toegevoegd aan de media. De transposon bevat een kanamycine weerstand marker, waardoor voor de selectie van mutanten met de transposon inzetstukken in het chromosoom van de ontvangende stam. Het tweede voordeel van het pJA1-plasmide is dat hierin een mutant oorsprong van R6K van replicatie. De R6K mutant oorsprong van replicatie vereist de lambda pir gen in orde voor het onderhoud van de plasmide-¹³. Zoals de plasmide niet in pir - stammen repliceren, zal het verloren gaan in de ontvangende stam (Figuur 1). Dit zorgt ervoor dat Tn10 transposase van de cel wordt verwijderd en niet langer actief is, mutaties na de omzetting van de eerste gebeurtenis verder te verminderen.

Het gebruik van bacteriële vervoeging om het plasmide pJA1 uit de stam van de donor naar de ontvanger stam is het voordelig om verschillende redenen. Vervoeging is eenvoudig en goedkoop uit te voeren en heeft geen behoefte aan speciale apparatuur, zoals een electroporator. Bovendien, de hoge efficiëntie van bacteriële Woordherkomst en-opbouw zorgt voor een zeer grote bibliotheek (> 2 x 10⁵ unieke ingevoegde) moet worden bereikt met slechts een paar milliliter (mL) van overnachting bacteriecultuur⁶. Het proces duurt rond twee uren van hands-on tijd samen met tijd voor incubatie en groei van de bacteriën. Langridge et al. ¹⁴ gemeld uitvoeren van 130 electroporations maken een transposon mutagenese bibliotheek van een grootte vergelijkbaar is met de hier beschreven⁸, die wordt bereikt met een enkele Woordherkomst en-opbouw. Het vereist het gebruik van 130 electroporations arbeid intensieve en tijdrovende voorbereiding van electrocompetent cellen en het gebruik van veel dure materialen (bijv., electroporation cuvettes), tegen een kostprijs van meer dan $1.000 USD in verbruiksartikelen alleen. Andere studies¹⁰ gebruik hebben gemaakt van soortgelijke methoden, maar met verschillende bacteriestammen, en bereikt veel bibliotheek kleinere (5 x 10,⁴ kolonie vormende eenheden) dan gemeld hier.

Notities op de donor-spanning: de spanning van de donor die hier gebruikt is de stam E. coli BW20767¹⁵ met de pJA1 transposon plasmide¹⁶. Stam BW20767 kunt conjugaat met andere soorten, waardoor de overdracht van de plasmide pJA1 zeer efficiënt. Ook, bovenal BW20767 lambda is pir +. Zoals eerder vermeld, kan de plasmide-pJA1 alleen worden gehandhaafd in stammen met het lambda pir gen. Deze soort is kanamycine en ampicilline resistent. De pJA1-plasmide bevat de ampicilline-resistentie-markering en een kanamycine weerstand marker deel uitmaakt van het transposon. Deze soort groeit met selectie op de plasmide met behulp van ampicilline bij 100 µg/mL. Het is ook vermeldenswaard dat andere stammen herbergen constitutively uitgedrukt transposase genen zitten bekend voor zitten unstable, en terwijl de transposase gebruikt hier onder afleidbare controle, blijft er een laag risico van lekkende expressie. Om deze reden, wordt voorgesteld dat de passage van deze spanning moet worden geminimaliseerd en een frisse streep moet worden genomen uit een bevroren cultuur voor elke nieuwe bibliotheek-preparaat. De stam van de donor die hier gebruikt is verkrijgbaar bij onze lab op aanvraag.

Toelichting op de stam van de ontvanger: de ontvanger stam kan zijn een stam van keuze, zoals K12 afkomstige lab stammen van E. coli of stammen van S.flexneri (Zie ook, discussie). De ontvangende stam moet een extra antibioticaresistentie marker thats niet kanamycine weerstand, zodat de spanning van de donor kan worden geselecteerd tegen. Voor de ontvangende stam, wordt een stam van de MG1655 E. coli hier gebruikt met een mutatie geïntroduceerde spontane nalidixic zuur. De spontane nalidixic zuur mutant werd geselecteerd door beplating uit 2 mL van de cultuur van de overnachting in 200 µL aliquots op borden met nalidixic zuur bij 30 µg/mL. Een enkele kloon van MG1655 werd geselecteerd die resistent tegen nalidixic zuur tot de ontvangende stam was. Bovendien moet de ontvangende stam de lambda pir negatieve, zoals hierboven beschreven.

Overzicht: Zodra bacteriële vervoeging heeft plaatsgevonden en het pJA1 plasmide is verhuisd van de stam van de donor in het ontvangende stam, de toevoeging van IPTG aan de media zal veroorzaken de uitdrukking van het gen tnp , die onder controle van de IPTG-afleidbare lacIq/Ptac promotor (Figuur 1). De tnp -gen op pJA1 is een mutant transposase die een lagere frequentie van plaatsingskosten bij hotspots^{6,10,11 heeft}. Na toevoeging en inductie met IPTG, is de transposon geactiveerd en willekeurig ingevoegd in het genoom. Het plasmide kan niet worden gehandhaafd in de lambda pir-ontvanger stam en verloren.

Protocol

Let op: als S. flexneri als een geadresseerde stam gebruikt, houd er rekening mee dat S. flexneri is een menselijke pathogenen die leiden gastro-intestinale aandoeningen tot kan. Experimenten met S. flexneri moeten worden uitgevoerd met passende bioveiligheid voorzorgsmaatregelen (aangewezen BSL-2 in Europa en de VS of PC2 in Nieuw-Zeeland). Alle experimenten in de video die is gekoppeld aan dit protocol werden gedaan met behulp van de goed gekarakteriseerd ontvangende stam van niet-pathogene E. coli MG1655 in een instelling PC1. Werk met Shigella flexneri eerder werd uitgevoerd in een lab BSL-2 op de Biozentrum in Basel, zoals beschreven in ⁶.

Opmerking: het volgende experiment is effectief twee keer gedaan. Het eerste deel (stap 1.1 - stap 4.5) wordt uitgevoerd om te zoeken naar de beste verdunning voor beplating uit de bibliotheek, waar het doel is het vinden van een verdunning van de geconjugeerde waardoor vele afzonderlijke kolonies per plaat, maar niet zoveel dat een gazon vormen. Dit is het verminderen van de concurrentie tussen mutanten met aanzienlijk lagere fitness en degenen met meer robuuste fitness. Het tweede deel (stappen 5.1-7.4) is de oprichting van de definitieve bibliotheek, waar veel platen zijn verspreid van de aangewezen verdunning van de bibliotheek.

1. te bereiden één dag voorafgaand aan Experiment

1. Inoculate, uit een bevroren voorraad, de stam van de donor in 2 mL van de pond-Bouillon, Millers recept (NaCl bij 10 g/L) media met ampicilline bij 100 µg/mL. De hier gebruikte donor-stam is de stam E. coli BW20767 ¹⁵ herbergen de pJA1 plasmide ¹¹. Het gebruik van ampicilline onderhoudt selectie voor de plasmide pJA1.
2. Inoculate, van een enkele kolonie of bevroren voorraad, de ontvangende stam in 2 mL zuiver LB-media met een marker van de weerstand dan ampicilline of kanamycine. De hier gebruikte ontvangende stam is de E. coli " wild type " MG1655 ^{17 , 18} stam met een spontane weerstand mutant bij het nalidixic zuur. Het wordt geteeld in 30 µg/mL nalidixic acid.
3. Bereiden 20 Luria bouillon met 1,5% agar platen (in 90 mM petrischalen, ongeveer 12,5 mL). Agar platen ontbreekt antibioticum kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor enkele maanden tot gebruik.
4. Bereiden 20 Luria bouillon met 1,5% agar platen (in 90 mM petrischalen, ongeveer 12,5 mL) met zowel nalidixic zuur bij 30 µg/mL en kanamycine op 50 µg Mo/mL (LBA Nal30 Kan50). Agar platen met antibiotica kunnen worden opgeslagen in het donker bij 4 ° C voor enkele maanden tot gebruik.
5. Bereiden 200 mL steriele LB-media. LB-media kan worden achtergelaten bij kamertemperatuur maandenlang.
6. Bereiden 1 mL 100 mM steriele voorraad van IPTG, volgens de fabrikant ' s instructies.

2. Bacteriële paring of vervoeging

1. Centrifuge 1 mL overnachting cultuur van de stam van de donor voor 1 minuut bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Gooi groei media. Deze stap wordt gedaan om het verwijderen van alle groei media die bevatten antibiotica.
2. Resuspendeer de pellet cel in 110 µL van LB (niet met antibiotica), dus het concentreren van de cultuur.
3. Steriel pincet gebruiken, plaatst u een steriele nitrocellulose filter (u kunt ook een steriele stuk Vloeipapier kan worden gebruikt, zie materialen lijst) op het midden van een plaat van de LBA (niet met antibiotica). Label van de plaat " negatieve controle: Donor ".
4. 50 µL van de geconcentreerde donor-cultuur op het filter met behulp van een precisiepipet, drop.
5. Herhaal stap 2.1-4 voor de ontvangende stam, labelen van de plaat " negatieve controle: ontvanger. "
6. Voor de bibliotheek, drop 50 µL van de donor (uit stap 2.2) en 50 µL van de ontvangende stam (uit stap 2.5) op een enkel steriele filter op een plaat van de LBA (deze platen mogen geen antibiotica). Label deze plaat " Library. " paring doet zich voor omdat de donor en de ontvanger in nauwe fysieke contact op het filter.
7. Plaats de platen van de agar met de filters bij 37 ° C gedurende 6 h.

3. Activering van pJA1 Transposon door inductie van de IPTG van de Transposase

1. voorbereiden drie 15 mL conische flesjes met 2 mL LB met IPTG op een eindconcentratie van 1 mM (dat wil zeggen, 20 µL van 100 mM voorraad van IPTG). Elk label: Donor controle, controle van de ontvanger en bibliotheek.
2. Verwijdert de platen uit de incubator na 6 h van groei bij 37 ° C (uit stap 2.4). Sommige bacteriële groei moet zichtbaar zijn op het filter.
3. Werken met steriel pincet, verwijder het koffiefilter uit het donor-besturingselement en plaats deze in de conische flesje van 15 mL Donor besturingselement Label (uit stap 3.1). Doe hetzelfde voor de controle van de ontvanger en Library.
4. Tik op de buizen zorgen dat het volledig wordt ondergedompeld in pond te krijgen het koffiefilter naar de onderkant van de conische flesje van 15 mL
5. Vortex buizen voor ten minste een volle minuut op hoog om te distantiëren van de bacteriën van de nitrocellulose filter. De LB moet worden bewolkt met bacteriële cellen ( Figuur 2).
6. Met behulp van steriele glasparels of een steriele strooier, plaat 200 µL van de entsuspensie vortexed van de donor-besturingselement naar LBA Nal30 Kan50 platen label " Donor Control, 200 µL ".
7. Herhaal de stap hierboven (3.6) voor de geadresseerde control, labeling van de platen " ontvanger Control, 200 µL ".
8. Herhaal de stap hierboven (3.7) voor de bibliotheek, labelen van de platen " Library, 200 µL ".
9. Maken extra verdunningen (dat wil zeggen, 1:5, 1:10 en 1:100 verdunningen, met behulp van LB niet met antibiotica als een oplosmiddel) van de bibliotheek. Plaat 200 µl van onverdunde bibliotheek en extra verdunningen op adequaat LBA Nal30 Kan50 platen label.
10. Plaats platen in de 37 ° C incubator voor 18 h. klonen met transposons ingevoegd in een gen dat ervoor zorgt dat een groot verlies van fitness kan duren langer om te groeien en verschijnen op de plaat. Er moet een scala aan kolonie maten ( Figuur 3). Donor en ontvanger stam platen moeten geen kolonies op hen.

4. Kies de aangewezen verdunning van de bibliotheek moet worden gebruikt voor de definitieve Mutant bibliotheek

1. bepalen een verdunning van de bibliotheek van stap 3.9 dat veel koloniën van verschillende groottes die levert adequaat worden verdeeld. Het doel is om zo veel koloniën mogelijk op één plaat, maar niet zoveel dat de koloniën samenvoegen met elkaar en voor resources concurreren. Dit nummer moet ongeveer 500-2.000 kolonies per plaat. Een voorbeeld van juiste kolonie dichtheden op een plaat is afgebeeld in Figuur 3.
2. Registreren het aantal kolonies op de platen.
3. Bereken de frequentie van geconjugeerde (het aantal conjugants per ontvanger cel). Dit moet in de range van 1 x 10 ^-4 tot en met 1 x 10 ^{-6 19}.
4. Bepalen het aantal mutanten gewenst in de definitieve bibliotheek gebaseerd op downstream-toepassingen. Vele gebruikers moeten gewoon een bibliotheek met zoveel mutanten mogelijk. Voor het genereren van zoveel transposon invoegingen als theoretisch mogelijk (een invoegpositie elke basenpaar), streven naar benaderendely hetzelfde aantal kolonies als basenparen in het genoom (dat wil zeggen, ~4.5 x 10, ⁶ voor E. coli) volledig verzadigen het genoom met alle mogelijke transposon invoegingen. Het is belangrijk op te merken, veel mutanten herbergen invoegingen in de essentiële of functioneel belangrijke genen niet zal kunnen worden teruggevorderd, zoals deze mutaties fataal zijn voor de ontvanger zullen.
5. Bereken hoeveel volume van de oorspronkelijke bibliotheek is nodig voor het maken van een bibliotheek van de gewenste grootte. Bijvoorbeeld, is de gewenste bibliotheek grootte 5 x 10 ⁴ mutanten. De verdunning met de beste afstand van kolonies van stap 3.9 was 200 µL van een 1:10 verdunning. Het aantal kolonies op deze plaat wordt geschat op ongeveer 2.000 kolonies. Als 5 x 10 ⁴ mutanten nodig zijn en elke plaat 2.000 kolonies is, dan 25 platen nodig zullen zijn bij deze verdunning.

5. Oprichting van de definitieve Mutant bibliotheek

1. Herhaal stap 1 tot en met 3.8, aanpassing van het aantal platen bij stap 1.4 zo nodig (zie stap 4.4).
2. Bij stap 3.9, plaat de verdunning gekozen in stap 4.1 op zoveel borden zo nodig de bibliotheek van de gewenste grootte maken (zie stap 4.4).

6. Schatting van de dichtheid van de bibliotheek

1. tellen hoeveel kolonies er zijn per plaat, en daardoor krijgen een ruwe schatting van hoe dicht de bibliotheek is. Bijvoorbeeld: een totaal van 2 x 10 ⁵ kolonies zijn verguld. Het genoom van de MG1655 E. coli is ongeveer 4.5 x 10 ⁶ basenparen. Dus, een bibliotheek met ongeveer 2 x 10, ⁵ voegt betekent dat er een invoegen gemiddeld elke 22 basenparen en dat elk gen moet worden gemuteerd ongeveer 45 keer, gegeven dat één gen is ongeveer 1 x 10 ³ basenparen. Invoegingen in essentiële genen zijn waarschijnlijk zeer ondervertegenwoordigde in deze bibliotheek, en dus de dichtheid in niet-essentiële genen is waarschijnlijk groter dan dit. Dit soort berekening biedt een met een globale schatting van transposon dichtheid.

7. Bundeling van Transposon bibliotheek en opslag

1. na het tellen van kolonies, voeg 1 mL LB (of meer indien nodig) naar de bibliotheek plaat en gebruiken van een steriele strooier Schraap bacteriën van de plaat. Verwijder de bacteriële schorsing en plaats in een 50 mL klasse a of 15 mL conische flesje. Herhaal dit voor alle platen.
2. Vortex de gepoolde entsuspensie voor een volle minuut naar het homogeniseren van de opschorting.
3. Steriele glycerol toevoegen om een eindconcentratie van 20%.
   1. 100 x 20 µL aliquots in 0,25 mL buizen voorbereiden gemakkelijk uitgroei.
   2. Bereiden ten minste twee of meer 1 mL aliquoot in cryovials.
4. Slaan alle aliquots bij -80 ° C

Results

Na 18 uren van groei, platen moeten bevatten veel kolonies met een verscheidenheid aan formaten van de kolonie (Figuur 3). Verschillende kolonie maten aangeven van klonen van verschillende fitness, en zijn een goed teken dat het protocol heeft gewerkt. De besturingselementen van de donor en ontvanger moet geen groei op de platen. Gebruik van het bovengenoemde protocol moet opleveren ruim 2 x 10,⁵ kolonie vormende eenheden (kve). Het protocol bij vijf repliceren vervoegingen tegelijk schaalvergroting moet ongeveer 1 x 10⁶ CFU opleveren. In vorige werk, analyse met behulp van de volgende generatie sequencing aangegeven dat een dergelijke schaal omhoog bibliotheek moet opleveren > 2 x 10⁵ unieke ingevoegde⁶. Zeer hoge CFU (d.w.z., 1 x 10⁶ CFU) het aantal unieke ingevoegde naar verwachting plateau, zoals alle beschikbaar (niet-dodelijke) invoegingen worden vertegenwoordigd.

Figuur 1 : Schematische van bacteriële conjugatie en inbrengen van transposon in het chromosoom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Afbeelding van filters onderdompelen in LB-media voor en na vortexing. Vóór vortexing, cellen zitten vast aan het filter en de media is duidelijk. Na de vortexing, de media weer troebel wordt als cellen zijn gekomen off van het filter en in de media zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : (A) representatieve plaat van transposon bibliotheek na 18 h van groei. (B) Close-up van kolonie maten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Het protocol hier beschreven zorgt voor de bouw van een dichte invoeging bibliotheek. Deze methode zorgt voor de oprichting van een transposon-bibliotheek met meer dan 2 x 10⁵ unieke transposon mutanten met tot 5 mL cultuur volume⁶. Het is relatief gemakkelijk uit te voeren, maakt gebruik van de reagentia beschikbaar in de meest elementaire microbiologie labs is schaalbaar en vereist weinig dure apparatuur of verbruiksartikelen zoals electroporation cuvettes.

Een aanzienlijk voordeel van deze methode is dat de gebruiker in theorie breed latitude bij de keuze van enterobacterial ontvangende stammen heeft. Dit papier, evenals anderen¹¹, E. coli gebruiken als een geadresseerde stam, maar de pJA1 plasmide is met succes gebruikt met andere enterobacterial ontvangende soorten zoals Shigella flexneri⁶ en Salmonella enterica SL1344¹⁰van de stam van de serovar Typhimurium. Theoretisch, de oorsprong van de γ van replicatie (ori_R6Kγ) in pJA1 kunt deze plasmide worden gehandhaafd in een brede gastheer bereik¹⁹, toestaan dat de ontvangende stam is pir +. Onlangs, nieuwe methoden zijn beschreven waarmee voor de bouw van de pir + in een waaier van enterobacterial stammen²⁰, waardoor extra flexibiliteit. Bovendien is de regio van300 basenpaar menigte uit de RP4 plasmide in pJA1 kunt conjugative overdracht van deze plasmide aan een breed scala van gram-negatieve bacteriestammen¹⁹. Simpel gezegd, deze methode kan theoretisch worden gebruikt met een scala aan geadresseerden stammen, zolang aan verscheidene voorwaarden wordt voldaan: de stam is pir+, en is gemarkeerd met een antibiotica-resistentie uitzondering kanamycine en de stam van de donor.

Een cruciale stap in het protocol ligt bij het schatten van het juiste aantal cellen aan de plaat uit in stap 4.1. Als kolonies zijn te nauw verdeeld, ze concurreren voor voedingsstoffen op de plaat en minder fit mutanten worden samengehouden. Dit kan leiden tot een vermindering van het totale aantal mutanten. Als alternatief, als kolonies zijn verdeeld te ver uit elkaar, zal er te weinig kolonies op de plaat, en het totale aantal agar platen die nodig zijn om een grote bibliotheek wordt belastend. Daarom is het belangrijk het juiste evenwicht in termen van kolonie aantallen per plaat.

Het is belangrijk om uit te voeren van de besturingselementen in het protocol om ervoor te zorgen dat de stappen werkt zoals beschreven. Met name bij het gebruik van nalidixic zuur als een contra selectie tegen de stam van de donor, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de negatieve donor controle platen zijn vrij van kolonies. Dit is omdat er mogelijk een lage snelheid (ongeveer 1 x 10^-10)-²¹ van spontane weerstand tegen nalidixic zuur, opbrengst van valse positieven. Het tarief van conjugatie en de omzetting ervan is meestal ongeveer 2 x 10^{-4 19}. Daarom is het percentage conjugatie en omzetting van verschillende ordes van grootte groter is dan het aantal spontane weerstand tegen nalidixic zuur. Daarom is het tarief valse positieven in vergelijking met echte omzetting gebeurtenissen is zeer laag en als te verwaarlozen beschouwd wanneer het protocol werkt. Echter als tarieven van geconjugeerde of omzetting aanzienlijk zijn verlaagd, (van lage paring efficiëntie en/of gebrek aan inductie van de transposase-gen met IPTG) en het protocol is opgeschaald te compenseren dit, dan is het aantal valse positieven (klonen die hoeft niet de transposon ingevoegd) kan ook toenemen.

Sommige wijzigingen kunnen worden aangebracht om incubatie keren in stappen 3.2 en 3.10. Stap 3.2 Staten die vervoeging voor 6 uur plaatsvinden moet, maar in onze ervaring, deze stap van tijd kan worden gevarieerd (d.w.z., 4-7 h) zonder dat de resultaten aanzienlijk wijzigen. Daarnaast kan stap 3.10, de duur van die de kolonies worden geïncubeerd op de platen van de agar ook worden aangepast. Dit kan variëren afhankelijk van het gemiddelde tarief van de tijd of de groei van de ontvangende stam te verdubbelen. Bovendien leverde 18 h in onze ervaring, een verscheidenheid aan formaten van de kolonie, die aangeeft van een bibliotheek met diverse fitness. Echter kolonies met sterk verminderde fitness kunnen langer duren om te groeien en dus niet zichtbaar zijn na 18u. Als deze methode wordt gebruikt om te vinden van klonen van uiterst verminderde fitness, mogen langere incubatietijd tijden en minder kolonies op de plaat te verminderen verdringing (d.w.z., 48 h, 50-300 kolonies) worden gebruikt.

Extra valkuilen van deze methode zijn dat het niet kunnen gebruiken van een geadresseerde stam die al kanamycine bestendig. Het mogelijk de kanamycine weerstand markering in het plasmide pJA1 voor een alternatieve selecteerbare marker, zoals chlooramfenicol weerstand te overwinnen deze hindernis omwisselen. Het kan ook zijn vermeldenswaard dat, in theorie, is het mogelijk om te gebruiken een ontvangende spanning die bestand is tegen ampicilline, als de pJA1 plasmide met de ampicilline-resistentie marker is verloren kort na de omzetting.

De oprichting van een dichte transposon-bibliotheek op de genetische achtergrond van keuze is potentieel voordelig zijn voor tal van downstream toepassingen. Een dichte transposon bibliotheek kan bijvoorbeeld worden gebruikt auxotrofe mutanten met behulp van replica plating²² identificeren of identificeren van mutanten die gebreken vertonen bij de vaststelling van een infectie^1,2. Meer onlangs, als DNA sequencing kosten zijn gedaald en nieuwe technologieën, zoals de volgende generatie sequencing geworden alledaags, transposon bibliotheken zijn gebruikt met diepe DNA rangschikkend om inzicht in gen wezenlijkheid, genfunctie, en genetische interacties. Enkele van deze methoden worden geëvalueerd in ²³ en bevatten methoden zoals transposon geleide invoeging site rangschikken (TraDIS), transposon sequencing (Tn-seq), high-throughput invoegen tracking door diepe sequencing (HITS) en plaatsingskosten sequencing ( INSeq). Al deze downstream methoden, is afhankelijk van de bouw van dichte transposon invoeging bibliotheken. Terwijl andere vectoren voor bepaalde downstream methoden worden gebruikt wellicht, geeft het protocol beschreven hier een overzicht van de belangrijkste procedurele punten te volgen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron nitrocellulose filters (steriel)	Millipore	HAWP02500	Alternatief kan blottingpapier worden gebruikt (hieronder vermeld)
Blotting papier gesneden in cirkels van ~ 1 inch, vervolgens autoclaved/gesteriliseerde in folie. Er is geen verschil in efficiëntie tussen de nitrocellulose filters of blotting papier	GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm	3030-917	Alternatief kunnen nitrocellulose filters worden gebruikt (hierboven vermeld)
Metalen Forceps, sterieel	VWR/Global Science New Zealand	MURRE009/01
Petrischalen, sterieel, 90 mm diameter, 68 mL volume,  12.5 mL werkvolume.	Interlab New Zealand	2303-1090
Steriele glazen spreiders	VWR/Global Science New Zealand	NZNZSPREADER	Alternatief kunnen steriele glazen kralen worden gebruikt voor het verspreiden van cultuur op platen (hieronder vermeld)
Steriele glazen kralen	VWR/Global Science New Zealand	HERE1080603	Alternatief kan een steriele glazen spreider worden gebruikt voor het verspreiden van cultuur op platen (hierboven vermeld)
Nalidixinezuur (optioneel)	GoldBio.com	N-015-250
Ampicilline natriumzout BioChemica	VWR/Global Science New Zealand	APLIA0839.0025	bereid volgens aanbeveling van de fabrikant
Kanamycine sulfaat BioChemica	VWR/Global Science New Zealand	APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid)	Thermofisher New Zealand	FMTR0393
Difco Agar gegranuleerd	Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand	214530
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base)	Thermofisher	12795-084
Glycerol bidestild 99,5 %	VWR/Global Science New Zealand	VWRC24388.320
15 ml polypropelene steriele conische flacons	VWR/Global Science New Zealand	CORN430791
Microcentrifugebuizen, platte dop, 1.7ml, Ultra-heldere PP, gegradueerd, autoclaveerbaar en invriesbaar	VWR/Global Science New Zealand	AXYGMCT-175-C
50ml Centrifugeerbuizen, Falcon, PP, conisch, gedrukte graduatie, met platte schroefdop, sterieel	VWR/Global Science New Zealand	BDAA352070
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur
Incubator op 37C
Autoclaaf voor het steriliseren van media