Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

6.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56230

⸱

13 november 2017

 ,  ,  , 
1McGill University and Génome Québec Innovation Centre, 2Biomedical Engineering Department, McGill University, 3Parallex BioAssays Inc.

In dit artikel

Samenvatting

We tonen een module chiptechnologie voor het uitvoeren van cross-country-reactivity-vrije multiplexed sandwich-immunoassay door simpelweg twee dia's uitlijnen. Een apparaat module wordt gebruikt voor het op betrouwbare wijze overbrengen van reagentia van microarray-naar-microarray. De module-chip kan worden gebruikt voor alle biochemische reacties vereisen colocalization van verschillende reagentia zonder kruisbesmetting.

Samenvatting

Multiplexed eiwit analyse blijkt superieur diagnostische gevoeligheid en nauwkeurigheid in vergelijking met enkele eiwitten. Het antilichaam microarrays is voorzien van duizenden micro-schaal immunoassay gelijktijdig uitgevoerd op een enkele chip. Sandwich assay formaat assay specificiteit verbetert door het detecteren van elke doelstelling met twee antilichamen, maar lijdt aan Kruisallergie tussen reagentia dus beperken hun multiplexing vermogens. Colocalization microarray (ACM) van de antilichaam is ontwikkeld voor cross-country-reactivity-vrije multiplexed eiwit detectie, maar vereist een dure spotter on-site voor microarray fabrikatie tijdens testen. In dit werk tonen we een module-chiptechnologie die reagens van microarray overbrengt-naar-microarray door eenvoudig uitlijnen twee chips samen, dat dus geen spotter is nodig tijdens de incubatie van de steekproef en de verdere toepassing van detectie van antistoffen (wat schar betreft) op opslag van vooraf gevlekte dia's, het prepareren van objectglaasjes uit assay uitvoering distantiëren. Beide een- en tweepersoonskamers overdracht methoden worden voorgesteld om nauwkeurige uitlijning tussen de twee microarrays en de fabricage van de dia voor beide methoden worden beschreven. Resultaten tonen aan dat < 40 μm uitlijning is bereikt met dubbele overdracht, een dichtheid van de matrix van 625 vlekken/cm2te bereiken. Een 50-plexed-immunoassay verricht om aan te tonen van de bruikbaarheid van de chip module in multiplexed eiwit analyse. Detectiegrenzen van 35 eiwitten zijn in het bereik van pg/mL.

Inleiding

Een panel van biomarkers bestaande uit meerdere eiwitten kan bieden hogere gevoeligheid en specificiteit dan een enkele biomarker in de diagnose van complexe ziekten zoals kanker1,2. De enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA) is de technologie van de gouden standaard in klinische laboratoria bereiken van een limiet van detectie bij lage pg/mL in plasma, maar grenzen aan één doel per assay3,4,5gebruikt. Antilichaam microarrays zijn ontwikkeld voor de opvang van duizenden verkleinde testen uitgevoerd gelijktijdig op een enkele Microscoop dia6,7,8. Echter het multiplexing vermogen van deze methode wordt beperkt door reagens gestuurde Kruisallergie, die voortvloeien uit de toepassing van een mengsel van wat schar betreft, en wordt het moeilijker met een toenemend aantal doelstellingen9,10 , 11. Pla et al. hebben verklaard dat de daaruit voortvloeiende kwetsbaarheid van een multiplex sandwich assay schalen als 4N(N-1) waarbij N het nummer van de streefcijfers12is.

Om af te zwakken Kruisallergie in antilichaam microarrays, microarray antilichaam-colocalization is (ACM) ontwikkeld in ons laboratorium voor multiplex sandwich assay12. Capture antilichamen (cabines) zijn bevlekt op een substraat met een microarray spotter. Nadat blokkerende monsters worden toegepast op het oppervlak, en vervolgens afzonderlijke wat schar betreft zijn gespot op de dezelfde plekken met de cAb-antigeen-complex. Alle Kruisallergie-scenario's tussen antilichamen en antigenen kunnen worden verlicht met ACM en detectiegrenzen op pg/mL zijn bereikt. Het test-protocol vereist echter voorbereiden en de wat schar betreft spotten tijdens de experimenten met behulp van een on-site microarray spotter met hoge precisie voor uitlijning doel, namelijk duur en tijdrovend, beperking van de ruime toepassing van deze technologie in andere laboratoria. Een handheld ACM, genaamd module chip is ontwikkeld voor cross-country-reactivity-vrije en spotter-vrije multiplex sandwich immunoassay13,14,15. Cabines en wat schar betreft worden vooraf bevlekt op een dia assay en een overdracht dia respectievelijk in microarray opmaken en opgeslagen. Tijdens de test, de dia's worden opgehaald en een microarray van wat schar betreft collectief zijn overgezet naar de assay dia door gewoon het uitlijnen van de twee chips samen. Een module-apparaat wordt gebruikt voor betrouwbare reagens overdracht. Nitrocellulose bedekt dia's met een relatief grote antilichaam bindingscapaciteit zijn gebruikt als de assay dia's op te vangen van de vloeibare druppeltjes en aldus een reagens overdracht vergemakkelijken, echter de dia's zijn duurder dan reguliere glas dia's en microarray scanners compatibel met niet-transparante dia's zijn nodig voor signaal overname.

In dit werk tonen wij het protocol van het uitvoeren van een multiplex sandwich-immunoassay met een module-chip. Een apparaat van de nieuwe module is ontwikkeld voor meer handige en betrouwbare reagens overdracht van microarray-naar-microarray. Nog belangrijker is, hebben hier we de overzetmethode reagens op regelmatige glas dia's met de module-chip opgericht. 1024 plekken werden met succes overgebracht en uitgelijnd op een glasplaatje, aanzienlijk uitbreiden van het gebruik van deze technologie in de meeste laboratoria.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. fabricage en opslag van snap chips

  1. interne overdrachtmethode ( Figuur 1a)
    1. Spot cAb oplossingen met 400 µg/mL antilichamen en 20% glycerol in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op een nitrocellulose (of een functionalized glas) assay dia met een inkjet microarray spotter 13 bij een relatieve vochtigheid van 60% (1.2 nL voor elke vlek) met 800 µm center-naar-midden afstand. Zorg ervoor dat de dia is vastgesteld op de spotter dek volgens een hoek (hier, de bodem verlaten hoek werd gebruikt).
    2. De gevlekte assay dia bij kamertemperatuur voor 1 h met een relatieve vochtigheid van 60% Incubeer.
    3. Klem een dia module pakking met 16 vakken op de assay dia te verdelen in 16 wells. Spoel de dia drie keer door het toevoegen van 80 µL van PBS met 0,1% Tween-20 (PBST) in elk goed en schudden op 450 rpm op een shaker, 5 min telkens.
    4. Toevoegen 80 µL van het blokkeren van oplossingen voor elk goed en laat gedurende 1 h op 450 rpm.
    5. Verwijderen van de pakking en droog de assay dia met een stikstofstroom.
    6. Een overdracht dia op het dek van de spotter fix en druk op de linkerbenedenhoek van de dia tegen de bodem verlaten hoek van het dek spotter. Inkjet spot een array van uitlijning merken (een oplossing van polystyreen micro-parels) met dezelfde indeling als die bij de cabines.
    7. Laat de uitlijning marks droog. Flip de overdracht dia en zet het terug op het dek van de spotter, vaststelling tegen de linker onderhoek.
    8. Bereiden de dAb spotten oplossingen met 20 µg Mo/mL antilichamen, 20% glycerol en 1% BSA.
    9. Met behulp van de spotter ' s camera, neem een foto van een uitlijning is ingeschakeld. Uitvoering van deze foto in het spotten programma als een fiducial en krijgen van het systeem van de erkenning van het beeld van de inkjet-spotter te identificeren van het meest bovenste linker merk. Gebruik de coördinaat als de eerste plek van de dAb-matrix. Plek 8 nL per druppel met een center-naar-midden afstand van 800 µm.
  2. Dubbele overzetmethode ( Figuur 1b)
    1. een overdracht van dia 1 plaats op het dek van de spotter inkjet tegen de bodem verlaten hoek. Ter plaatse cabines oplossingen met 400 µg/mL antilichamen, 20% glycerol en 1% BSA in PBS op de dia met een inkjet microarray spotter bij een relatieve vochtigheid van 60% (0,4 nL voor elke vlek en ~ 200 µm in diameter). De centrum-naar-midden afstand is 400 µm.
    2. Snap de overdracht dia met een nitrocellulose bekleed (of een functionalized glas) assay-dia met behulp van een apparaat module ( Figuur 2) overdracht van de cabine druppels op de dia die bepaling.
      1. Beurt alle zes knoppen aan de zijkant van het apparaat van de module door 90 graden te trekken en vergrendelen van alle plunjers in geopende toestand. De overdracht dia invoegen door de houder van de dia in het recipiënt met de afgekapte hoek tegenover de vaste pogo-Pins. De eerste set van drie knoppen voor het vrijgeven van de plunjers met de gouden pogo-Pins en zorg ervoor dat de dia's worden geduwd tegen de uitlijning pinnen.
        2. Een nitrocellulose-gecoate dia invoegen
      2. in de module apparaat ondersteboven zittend op de 4 pogo-pins. De tweede set van drie knoppen loslaat plunjers met de zilveren speld en ervoor te zorgen dat de dia's worden geduwd tegen de uitlijning pinnen.
      3. Sluit het apparaat module door het plaatsen van de bovenste schelp op de houder van de dia met behulp van de pijlers van de uitlijning en de gaten voor een nauwkeurige positionering.
      4. Het apparaat gesloten module invoegen in zijn kooi en duw de sluiting tab helemaal naar beneden om de microarrays face-to-face tijdens het toepassen van de juiste druk. Gesloten voor 1 min. houden
    3. Scheiden van de dia's. Incubeer de assay dia bij kamertemperatuur voor 1 h met een relatieve vochtigheid van 60%. Wassen, blokkeren en drogen van de assay dia, zoals beschreven in stappen 1.1.3 - 1.1.5.
    4. Plaats een andere overdracht dia op de inkjet spotter dek en duw tegen de bodem verlaten hoek. Ter plaatse schar oplossingen met 50 of 100 µg/mL van antilichamen (zie tabel 1), 20% glycerol, en 1% BSA in PBS. Ervoor zorgen dat elke vlek 0.8 nL en de centrum-naar-midden afstand tussen plekken is 400 µm.
    5. De bepaling en de overdracht dia opslaan. Zegel van zowel de test en de overdracht dia's in een luchtdichte zak met droogmiddel en zet in een vriezer van-20 ° C.

2. Multiplexed immunoassay met module chips

  1. ophalen de assay dia uit de diepvries. Laat de zak verzegeld gedurende 30 minuten totdat de dia tot kamertemperatuur komt.
  2. Voorbereiden 7-punts seriële verdund monsteroplossingen door stekelige eiwitten in PBS met 0,05% Tween-20.
    Opmerking: Hier, een 5-fold verdunningsfactor wordt gebruikt. De startende concentraties voor elke proteïne zijn vermeld in tabel 1.
  3. Voorbereiden monsteroplossingen zo nodig. Bijvoorbeeld, Verdun menselijk serum 4 keer in PBST buffer.
  4. Klem van een 16-vaks pakking op de dia assay.
  5. Vul één kolom met 8 putjes met de 7 eiwit verdunning oplossingen en een bufferoplossing PBST eiwit-gratis door pipetteren. Pipetteer van de monsteroplossingen in de andere 8 putten op dezelfde dia..
    Opmerking: 80 µL oplossingen worden past in elk goed. Meer dia's kunnen worden gebruikt om aanvullende monsters indien nodig meten.
  6. De monsters op een shaker op 450 rpm 1 uur bij kamertemperatuur of voor overnachting bij 4 ° C. wassen de dia drie keer met PBST in het roteerapparaat bij 450 rpm, 5 min telkens uit te broeden. Verwijder de pakking en drogen van de dia onder een stroom van stikstofgas.
  7. Halen de overdracht dia met wat schar betreft uit de vriezer. Houd de zak verzegeld gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, Incubeer de dia in een gesloten kamer (b.v. leeg tips doos) bevattende 60% vochtigheid stabilisatie bolletjes voor 20 min voor rehydratie.
  8. Snap de overdracht dia met de assay-dia met behulp van een apparaat van de module ( Figuur 2) overdracht van de dAb-druppels. Zie punt 1.2.2 voor de werking van het apparaat module.
  9. Scheiden de dia's. Incubeer de assay dia in een gesloten kamer bevattende 60% vochtigheid stabilisatie bolletjes voor 1 h. klem de assay dia met een 16-vaks pakking en spoel de dia 4 keer met PBST op een shaker op 450 rpm, 5 min telkens.
  10. Pipetteer 80 µL van oplossingen met 2,5 µg Mo/mL streptavidine fluorophore in PBS in elk putje. Incubeer gedurende 20 min in een roteerapparaat bij 450 rpm.
  11. Spoel de dia 3 keer met PBST en eenmaal met gedestilleerd water in het roteerapparaat bij 450 rpm. Verwijder de pakking en drogen van de dia met behulp van stikstofgas.

3. Dia scannen en data analyse

  1. de assay dia scannen met een fluorescentie microarray scanner met behulp van de 635-nm-laser.
  2. Extract van de netto intensiteit van elke vlek met behulp van een analyse software (bijvoorbeeld matrix-pro analyzer) 16.
  3. Berekenen de limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor elke proteïne met behulp van een software van de statistieken en de eiwit-concentratie in de monsters.
    Opmerking: De LOD wordt gedefinieerd als het Y-snijpunt van de standaard cuRvE verhoogd met drie maal de standaardafwijking van drie onafhankelijke tests.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De test procedure voor zowel enkele als dubbele overdracht methoden is afgebeeld in Figuur 1. De cabines zijn bevlekt rechtstreeks op de dia assay in één overdracht, en de wat schar betreft zijn overgezet naar de dia assay van gebruik in een spiegel patroon van de cab-bestanden (Figuur 1a). Slechts één overdrachtprocedure is vereist, maar deze methode lijdt aan afwijking tussen de twee microarrays, voornamelijk veroorzaakt door d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk, dat wij hebben ingediend een module-chiptechnologie waarmee de cross-country-reactivity-vrije multiplex immunoassay wijd-beschikbaar voor de onderzoekers met elementaire experimentele opzet. Anders dan de bestaande antilichaam microarrays, geen microarray spotter is nodig voor eindgebruikers. Zowel enkele als dubbele overdracht methoden worden gedemonstreerd, en dubbele overdracht biedt superieure uitlijning nauwkeurigheid neer aan ~ 40 μm voor 98% spots, met de grootste afwijking van 63 µm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

McGill University heeft ingediend een octrooiaanvraag over sommige aspecten van dit werk met Huiyan Li en David Juncker als uitvinders.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Rob Sladek voor het gebruik van de inkjet-spotter. Wij erkennen de uiteindelijke steun van de Canadese instituten voor gezondheid onderzoek (CIHR), de natuurwetenschappen en Engineering onderzoek Raad van Canada (NSERC), de Canadese samenleving onderzoeksinstituut van kanker en de Stichting van Canada voor innovatie (CFI). D.J. dankzij steun van Canada Research Chair.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Phosphate buffered saline tabletFisher Scientific5246501EA
Streptavidin-geconjugeerd Cy5Rocklands000-06
Tween-20Sigma-Aldrichp1379
Bovine serum albumineJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc001-000-162
GlycerolSigma-AldrichG5516
Blockingoplossing: BSA-vrije StabilGuard Choice Microarray StabilizerSurModics, IncSG02
Nitrocellulose gecoate slidesGrace Bio-Laboratories, Inc305116
Aminosilane gecoate slidesSchott North America1064875
Snap DeviceParallex BioAssays Inc.PBA-SD01
Inkjet microarray spotterGeSiMNanoplotter 2.0
Slide module gasketGrace Bio-Laboratories, Inc204862
Humidity Stabilization BeadsParallex BioAssays Inc.PBA-HU60
Array-Pro Analyzer softwareMedia CyberneticsVersion 4.5
Fluorescentie microarray scannerAgilentSureScan Microarray Scanner
Biostatistiek softwareGraphPad SoftwareGraphPad Prism 6
Endoglin capture antilichaamR&D SystemsMAB10972
Endoglin proteïneR&D Systems1097-EN
Endoglin detectie antilichaamR&D SystemsBAF1097
IL-6a (zie Tabel 1)R&D Systems
IL-6b (zie Tabel 1)Invitrogen

Referenties

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688(2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28(2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Snap Chip-technologiegemultiplexe immunoassaydetectie zonder kruisreactiviteitspotter-vrije microarrayantilichaam-microarraysandwich-assay-formaatdubbele transfermethodefluorescentiescannerStreptavidine Fluoro-4detectielimiet
Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.