Techniek van minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing in muizen voor inductie van links ventriculaire hypertrofie

Samenvatting

Het doel van dit protocol is te beschrijven stap voor stap de techniek van minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing (TAC) in muizen. Door eliminatie van intubatie en ventilatie die verplicht is voor de gebruikte standaardprocedure zijn, minimaal invasieve TAC vereenvoudigt de operatieve procedure en vermindert de stam het dier op te zetten.

Samenvatting

Transversale aorta vernauwing (TAC) in muizen is een van de meest gebruikte chirurgische technieken voor experimentele onderzoek van druk overbelasting-geïnduceerde ventriculaire hypertrofie (LVH) en de progressie van links naar hartfalen. Deze procedure is in het merendeel van de gerapporteerde onderzoeken uitgevoerd met intubatie en ventilatie van het dier dat maakt het veeleisende en tijdrovende en draagt bij aan de chirurgische lasten aan het dier. Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een vereenvoudigde methode van minimaal invasieve TAC zonder intubatie en ventilatie van muizen. Kritische stappen van de techniek worden benadrukt met het oog op lage sterfte en hoog rendement in inducerende LVH.

Mannelijke C57BL/6 muizen (10-week-oude, 25 à 30 g, n = 60) werden verdoofd met een enkele intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine en xylazine. In een spontaan ademhaling dier na een 3-4 mm bovenste gedeeltelijke sternotomy, een segment van 6/0 zijde hechtdraad schroefdraad door het oog van een afbinding steun werd aangenomen onder de aortaboog en gebonden over een afgestompte 27-gauge naald. Sham bediende dieren onderging de dezelfde chirurgische voorbereiding maar zonder vernauwing van de aorta. De doeltreffendheid van de procedure in het inducerende LVH wordt getuigd door een aanzienlijke toename van het hart/lichaam / gewichtsverhouding. Deze verhouding wordt verkregen dagen 3, 7, 14 en 28 na chirurgie (n = 6-10 in elke groep en elk tijdstip). Met behulp van onze techniek wordt LVH waargenomen in TAC t.o.v. sham dieren vanaf dag 7 tot dag 28. Operatieve en late (meer dan 28 dagen) sterfte zijn beide zeer laag op 1,7%.

Kortom, onze kosteneffectieve techniek van minimaal invasieve TAC in muizen draagt zeer lage operatieve en post-operatieve sterfte en is zeer efficiënt in het inducerende LVH. Het vereenvoudigt de operatieve procedure en vermindert de stam het dier op te zetten. Het kan gemakkelijk worden uitgevoerd door de kritische stappen in dit protocol.

Inleiding

In het afgelopen jaar, de studie van hartfalen is uitgevoerd in levensvatbare diermodellen¹. Vergeleken met grote dierlijke modellen van hartverlamming, hebben kleine dierlijke modellen talrijke potentiële voordelen. Naast lagere kosten van huisvesting en onderhoud zijn kleine dierlijke modellen toegankelijk voor meer onderzoekers als gevolg van de minder complex faciliteiten die nodig zijn².

Hartfalen Muismodellen biedt veel van dezelfde voordelen als de rat-modellen. Bovendien tot verminderde huisvesting kost³, Muismodellen profiteren van de beschikbaarheid van relevante transgene en knockoutstadia (KO) stammen. De mogelijkheid van cel type-specifieke, afleidbare KO of transgene strategieën maken de muis een waardevol instrument te bestuderen van de pathogenese van hartfalen en te proberen vast te stellen nieuwe therapeutische regimes³.

Onder de muis modellen van hartfalen gebruikt momenteel⁴, dwarse aorta vernauwing (TAC) die voor het eerst door Rockman^{5 beschreven werd} is het aangewezen model voor het genereren van druk overbelasting-geïnduceerde links ventriculaire hypertrofie (LVH)^{1 , 3}. het grootste voordeel van dit model is de mogelijkheid tot stratificatie van LVH², hoewel links ventriculaire remodelleren in reactie op TAC is variabel tussen verschillende muis stammen. In het bijzonder, ontwikkelen C57BL/6 muizen snelle LV dilatatie na TAC, die niet met andere stammen^4,6,7kan optreden.

Het plotselinge begin van hypertensie bereikt met TAC oorzaken een ongeveer 50% toename in LV massa binnen 2 weken, waardoor snel onderzoeken de activiteit van farmacologische of moleculaire interventies die gericht zijn op de ontwikkeling van LVH⁴modulerende. De acute inductie van ernstige hypertensie door TAC niet precies het reproduceren van de progressieve links ventriculaire hypertrofie en remodelleren waargenomen in de klinische setting van aorta stenose of arteriële hypertensie. Dit model wordt echter gebruikt door veel onderzoekers te identificeren en aanpassen van nieuwe therapeutische doelen in hartfalen⁴.

Uitvoeren van TAC in muizen vereist meer chirurgische expertise die nodig is voor andere technieken die worden gebruikt voor het opwekken van LVH en latere hartfalen². De meeste auteurs uitvoeren deze procedure door intubating en ventileren van de dierlijke^2,8, waardoor deze procedure meer veeleisende en tijdrovende en wordt toegevoegd aan de chirurgische lasten voor het dier. Alleen enkele onderzoekers hebben minimaal invasieve TAC gebruikt in hun studie met korte verwijzing naar de chirurgische ingreep^9,10,11.

Het doel van dit protocol is te beschrijven stap voor stap een vereenvoudigde en gebruikersvriendelijke techniek van minimaal invasieve dwarse vernauwing van de aorta in muizen, markeren de kritieke fasen van de procedure. Door de volgende belangrijke stappen, kunt een gemakkelijk deze techniek uitvoeren.

Protocol

mannelijke C57BL/6J muizen (10 weken, 25 à 30g, n = 60) in dit protocol worden gebruikt. Dieren een humane behandeling met inachtneming van de richtsnoeren geformuleerd door het Franse Ministerie van landbouw en van hoger onderwijs en onderzoek, en alle procedures worden uitgevoerd overeenkomstig de Europese richtlijn van de Raad van de Gemeenschap van 24 November 1986 () 86/609/EEG) en de Franse wetten. Het protocol is goedgekeurd door de " regionale ethische commissie voor dier experimenten CREMEAS " (#2016092816207606).

1. voorbereiding op de operatie

1. de muizen gedurende een week na aankomst in het dier faciliteit op een 12/12 uur licht/donker cyclus, in standaard kooien, met voedsel (voor details zie de tabel van materialen) en water beschikbaar ad libitum.
2. Op de dag van de operatie, plaats de muizen in afzonderlijke kooien een paar minuten vóór de inductie van de anesthesie, teneinde eventuele extra stress bij het dier. Alle chirurgische instrumenten de dag voor de operatie steriliseren.
3. Tijdens peritoneally injecteren van een enkelvoudige dosis van een mengsel van ketamine (51.4 mg/kg) en xylazine (3,3 mg/kg) verdund in een zoutoplossing (0,9% NaCl).
4. Zorg ervoor dat van de diepte van de narcose door het ontbreken van de teen-retraite reflex.
5. Scheren van de nek en borst van het dier met een commercieel beschikbare scheermes en desinfecteren van de geschoren zone met 70% alcohol.
6. Het dier op een schone kurk werken pad liggende plaatsen en de poten vast met plakband.

2. Chirurgie

1. steriele chirurgische techniek wordt gebruikt in de procedures. In een spontaan ademhaling dier, uitvoeren van een longitudinaal middellijn cervicale snede meer dan 10 mm met een 11-mes van supra-sternale inkeping naar de mid borst om bloot het borstbeen ( Figuur 1).
2. Intrekken van de schildklier door het passeren van een 4/0 monofilamenten polypropyleen verblijf hechtdraad met een Crile-hout naald houder en tape aan de werkende pad.
3. Scheiden botweg de vooraf tracheale spieren met een micro-chirurgische Tang te ontdekken van de luchtpijp.
4. Dia voorzichtig de gladde-tipped micro-chirurgische pincet met de gesloten kaken gebogen over de luchtpijp en achter het borstbeen.
5. Door zorgvuldig openen en sluiten van de kaken van de gladde-tipped gebogen microchirurgische verlostang verrichten een botte dissectie onder de vooraf tracheale spieren en achter het borstbeen tot het borstvlies opzijschuiven.
6. Begrijpen de juiste supra-clavicular spieren met de gladde-tipped rechtstreeks micro-chirurgische Tang en trek voorzichtig de borst van het dier.
7. Schuif de inferieure kaak van het bot nipper onder het borstbeen en het uitvoeren van een 3-4 mm bovenste gedeeltelijke sternotomy ( Figuur 2). Het onderste deel van de mini-sternotomy iets naar links direct.
8. Passeren een 7/0 monofilamenten polypropyleen verblijf hechtdraad van binnen naar buiten de tweede intercostale ruimte aan elke kant van de mini-sternotomy met behulp van een micro-chirurgische naald houder. Blijf dicht bij costo-sternale hoek om te voorkomen dat schade aan intercostale en interne thoracale vaartuigen of borstvlies.
9. Verspreid de sternale randen met behulp van 7/0 monofilamenten polypropyleen verblijf hechtingen aan elke kant en pas deze aan naar het pad van het werken met plakband.
10. Voorzichtig opzij verplaatsen de vooraf tracheale spieren, mediastinale vet en zwezerik met behulp van gladde-tipped gebogen microchirurgische pincet om te visualiseren de aortaboog onder spaarstand vergroting (2-3 X) ( Figuur 3). Bepaalde zorg niet te raken of beschadigen van de pariëtale pleura om te voorkomen dat de ontwikkeling van de pneumothorax.
11. Bloot van het zachte weefsel onder de aortaboog door koppelverkoop pincet ( Figuur 4 A) en spreid voorzichtig haar kaken. Bereiden van een tunnel in het zachte weefsel onder de aortaboog met een tweede gelijkmakende Tang door voorzichtig openen en sluiten van de kaken in de weke.
12. Geven een segment van 6/0 zijde ligatuur schroefdraad door het oog van een afbinding hulp ( Figuur 4 B) gehouden in de linkerhand onder de aortaboog en het op te halen door koppelverkoop pincet gehouden in de rechterhand tussen de oorsprong van de juiste innominate en linker gemeenschappelijk halsslagaderen ( Figuur 5).
13. Knippen van een 27-gauge naald tot een lengte van 5 mm en botte beide uiteinden door hen met een Crile naald houder. De afgestompte 27-gauge naald naast de aortaboog ( Figuur 6) met een gladde-tipped rechtstreeks micro-chirurgische Tang en binden van de hechtdraad gezellig rond de naald en de aorta tussen de juiste innominate en linker gemeenschappelijke halsslagader slagaders met behulp van de twee gelijkmakende verlostang ( Figuur 7). Uitvoeren om te binden zonder speling de hechtdraad, een eerste dubbele knoop gevolgd door vier extra knopen. Ervoor te zorgen dat alle knopen plat zijn.
14. Na afbinding, Verwijder snel maar voorzichtig de naald te bereiken een 0,4 mm diameter vernauwing en een reproduceerbare dwarse 65-70% aorta vernauwing.
15. Controleren voor hemostase van het zachte weefsel rond de aortaboog, de sternale randen en vooraf tracheale spieren. Resorbeerbare hemostatische gaas zetten waar lekt bloed wordt waargenomen. Verwijder de 7/0 monofilamenten polypropyleen blijven hechtingen gebruikt voor het verspreiden van de sternale randen.
16. Geven een eenvoudige 6/0 monofilamenten polypropyleen hechtdraad met de houder van een micro-chirurgische naald van buiten aan binnenkant van de linker tweede intercostale ruimte en vervolgens van binnen naar buiten de juiste tweede intercostale ruimte. Blijf dicht bij costo-sternale hoek om te voorkomen dat schade aan intercostale en interne thoracale vaartuigen of borstvlies.
17. Brengen samen de sternale randen door 6/0 polypropyleen monofilament hechtdraad koppelverkoop met een Crile-hout naald houder.
18. Sluit de huid met een 5/0 monofilamenten polypropyleen hechtdraad uitgevoerd in één laag met een Crile-hout naald houder.
19. Voeren de sham procedure identiek aan de operatie van de vernauwing, maar zonder een hechtdraad rond de aorta koppelverkoop.

3. Post-operatieve herstel

1. de dieren nauwlettend. overdracht van de muis naar een individuele kooi en breng dit in een liggend.
2. Toestaan de muis te herstellen onder een opwarming van de aarde licht tot volledig wakker (minder dan 1 uur na de verdoving inducerende).
3. Voor postoperatieve Analgesie, injecteren 0,1 mg/kg van buprenorfine intraperitoneally. Herhaal subcutane injecties van 0,1 mg/kg van buprenorfine elke 8 h voor de eerste drie dagen zoals aangegeven.
4. Plaats van de bediende muizen in standaard kooien (maximaal 3 muizen per korf) en minimum 2 muizen per kooi.

4. Hart van oogst

1. op de dag van analyse, euthanaseren de muis met een oplossing van ketamine 300 mg/kg en xylazine 20 mg/kg in een zoutoplossing door intraperitoneale injectie.
2. Eerste oogst het bloed van de vena cava inferior en vervolgens via dezelfde lijn injecteren 5 mL van oplossing van 2.6 mM EDTA in een zoutoplossing.
3. Oogst van het hart, het verwijderen van de atria en het gewicht van het hart (linker en rechter ventrikel zonder atria).
4. Scheiden links van de juiste ventricle met het septum resterende naar het linkerventrikel deel. Wegen beide weefselsteekproeven en bevriezen ze in vloeibare stikstof.

Resultaten

Voortbestaan van de operatieve en laat
De operatieve overleven was zeer hoog, 98,3% (59 van 60) voor de hele reeks (TAC en sham bediende dieren). De alleen operatieve dood was te wijten aan een bloeding complicatie in een muis geschaafd voor sham werking. Post-operatieve overleven tijdens de observatieperiode van 28 dagen was ook uitstekend, door 98,3% (58 van 59). Alleen late overlijden postoperatieve in een TAC-muis op dag (D) 16, eventueel van cardiale oorsprong.

Discussie

Het doel van dit protocol is te presenteren van een stap voor stap illustratie van de chirurgische techniek voor minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing in muizen. Gedetailleerde technische beschrijving van transversale aorta vernauwing in muizen is gemeld door andere auteurs^2,8. Echter, deze onderzoekers chirurgie uitvoeren na intubatie en ventilatie van dieren. Het gebruik van een extra stap van intubatie-ventilatie vergroot de complexiteit en de duur van de...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Surgical microscope	Olympus	SZX2-TR30
Razor	Rowenta	Nomad TN3650FO
Hechtdraad:
Polypropyleen 7/0	Ethicon	BV-1X
Polypropyleen 6/0	BBraun	C0862061
Zijde 6/0 ligatuur	FST	18020-60
Polypropyleen 4/0	Ethicon	8683
Polypropyleen 5/0	Ethicon	Z303
Geneesmiddelen:
Ketamin	Merial	Imalgène 1000, LBM154AD
Xylazine	Bayer	Rompun 2%, KP09PPC
Buprenorfine	Ceva	Vetergesic, 072013
Instrumenten:
Botgeveder	Fine Surgical Tools	16101-10
Ligatuurhulp	Fine Surgical Tools	18062-12
Knooptang	Fine Surgical Tools	18026-10
Naaldhouder Crile-Wood	Fine Surgical Tools	12003-15
Microchirurgietang	Fine Surgical Tools	11003-12
Microchirurgietang	Fine Surgical Tools	11002-12
Weefseltang	Fine Surgical Tools	11021-12
Microchirurgie naaldhouder	Fine Surgical Tools	12076-12
Microchirurgie schaar	Fine Surgical Tools	91501-09
Mayo schaar	Fine Surgical Tools	14511-15
11-bladig mes	Fine Surgical Tools	10011-00
RNA extractie en qPCR:
TriReagent	Euromedex	TR-118-200
Rneasy Mini kit	Qiagen	74704
Qubit fluorimetrische RNA-test	Fisher Scientific	10034622
RNA 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
High Capacity cDNA kit	Fisher Scientific	10400745
Taqman Master Mix	Fisher Scientific	10157154
Taqman BNP primers	Fisher Scientific	Mm01255770_g1
Taqman ANP primers	Fisher Scientific	Mm01255747_g1
Taqman ACE primers	Fisher Scientific	Mm00802048_m1
Taqman Col1a1 primers	Fisher Scientific	Mm00801666_g1
Taqman TGFb primers	Fisher Scientific	Mm01178820_m1
Taqman Gapdh primers	Fisher Scientific	Mm99999915_g1
ABIPrism  Thermocycler	Applied Biosystems	7000
Software:
GraphPad Prism	GraphPad	Prism 7
Diervoer
Complete voeding voor volwassen ratten/muizen	Safe	UB220610R