Mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit Assay en Ca2 +-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd

Samenvatting

Dit protocol is gericht op het beschrijven van een methode om te onderzoeken of het Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}- geactiveerd mitochondriale zwelling van geïsoleerde mitochondria van SH-SY5Y cellen stapsgewijze.

Samenvatting

De productie van ATP door oxidatieve fosforylatie is de primaire functie van de mitochondriën. Mitochondriën in hogere eukaryoten ook deelnemen aan cytosolische Ca^{2 +} bufferen en de ATP productie in mitochondriale kan worden bemiddeld door intramitochondrial gratis Ca^{2 +} concentratie. CA^{2 +} retentie capaciteit kan worden beschouwd als het vermogen van de mitochondriën te behouden van calcium in de mitochondriale matrix. Geaccumuleerde intracellulaire Ca^{2 +} leidt tot de doorlaatbaarheid van de innerlijke mitochondriale membraan, genoemd de opening van mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP), die leidt tot het weglekken van moleculen met een moleculair gewicht van minder dan 1,5 kDa. CA^{2 +}-mitochondriën zwelling wordt gebruikt om aan te geven van de opening van de mPTP geactiveerd. Hier beschrijven we twee testen om te controleren de Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën geactiveerd. Na bepaalde hoeveelheden van Ca^{2 +} worden toegevoegd, kunnen alle stappen worden voltooid in één dag en geregistreerd door een microplate-lezer. Dus, deze twee eenvoudige en effectieve testen kunnen worden vastgesteld om te beoordelen de Ca^{2 +}-mitochondriale functies.

Inleiding

Mitochondriën zijn de belangrijkste cellulaire organen te produceren bijna 95% van de ATP in de cellen van zoogdieren gebruikt door oxidatieve fosforylering. Het is gemeld dat de afgezonderd micromolar concentratie van Ca^{2 +} door de mitochondriën, de aanwezigheid van ADP en anorganisch fosfaat kan worden gebruikt om phosphorylate ADP op¹ATP synthese. Wanneer de concentratie van cytosolische Ca^{2 +} boven een drempel gaat, mitochondriën kunnen opname Ca^{2 +} snel en efflux het langzaam. Zo kunnen de functionerende mitochondriën toestroom de verhoogde cytosolische Ca^{2 +}. Irrelevant voor de deelname aan de oxidatieve fosforylatie, de mitochondriale Ca^{2 +} ook deelnemen aan de cytosolische calcium-signalen en het mechanisme van de mitochondriale apoptotic activeren door de opening van de mPTP in de binnenste mitochondriale inducerende membraan². Het is algemeen erkend dat een abnormale verhoging van de intracellulaire Ca^{2 +} mitochondriale enorme zwelling veroorzaken kan door het openen van de mPTP-³. Dus, dit protocol heeft tot doel te beoordelen van de mitochondriale functie door het kwantificeren van de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-trigged mitochondriale zwelling.

CA^{2 +} retentie capaciteit is de meting van het vermogen van de mitochondriën om opname cytosolische calcium. Mitochondriën kunnen buffer het cytosolische vrij calcium en calcium-afhankelijke cellulaire processen regelen door opname van de calcium in de vorm van inactieve precipitaten. Verminderde Ca^{2 +} retentie capaciteit treedt op in stress verschijnselen die is gekoppeld aan de beperking van de energie en zelfs neurodegeneratieve ziekten^4,5. Geïsoleerde mitochondriën of digitonin-permeabel cellen kunnen worden gebruikt voor identificatie van de Ca^{2 +} retentie capaciteit, en de verhoogde capaciteit om te accumuleren Ca^{2 +} door geïsoleerde mitochondriën met de additonal glutamaat en malate wordt niet verricht door de mitochondriale isolatie procedure⁶. Een bepaalde hoeveelheid digitonin moet worden gebruikt om de permeabilize van de plasma-membranen van verschillende celtypes. Het hexapotassium zout van Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof, een Ca^{2 +}-gevoelige cel-impermeant zichtbaar licht-prikkelbaar indicator, gebruikte⁷is geweest. CA^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof is een indicator van de lage-affiniteit en gebruikt om te tonen dat intracellulaire gratis Ca^{2 +} concentraties stijgen blijven tijdens langdurige (5 min) stimulaties⁸. Deze methode is minder gevoelig dan de radioactieve filter techniek maar werd sterk vereenvoudigd. De extra Ca^{2 +} calcium groene fluorescentie verheft en de Ca^{2 +} ICT door mitochondriën retourneert de fluorescentie op basislijn. Opeenvolgende toevoegingen van Ca^{2 +} aangebracht totdat de mitochondriën niet opname extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Een fluorescentie microplate lezer kan worden gebruikt om voortdurend verslag de calcium groene fluorescentie.

Na Ca^{2 +} accumulatie, mitochondriën depolarized, vrijgegeven Ca^{2 +} in het medium, en begon te zwellen. CA^{2 +}-mitochondriën zwelling wordt gebruikt om aan te geven van de opening van de mPTP geactiveerd. Elektronenmicroscopie en de daling lichtabsorptie bij 540 nm kan worden gebruikt voor het meten van de Ca^{2 +}-geactiveerd mitochondriale zwelling^10,11. Volume van de mitochondriën kan rechtstreeks worden bepaald door de voorwaartse hoek lichtverstrooiing¹², waar de dalingen van de extinctie passieve zwelling van de mitochondriale matrix reflecteren.

Hier, we illustreren de methodologie te onderzoeken van de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën van de cellen van de SH-SY5Y geactiveerd.

Protocol

1. isolatie van Mitochondria

Opmerking: Alle oplossingen en apparatuur moeten worden precooled op 0 - 4 ° C en op ijs.

1. Zaad ongeveer 3 x 10⁶ SH-SY5Y cellen per 10 cm cel cultuur schotel. Cultuur cellen in hoge-glucose Dulbecco gewijzigd van Eagle medium met 10% foetale runderserum, penicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 µg/mL). Handhaven bij 37 ° C in een broedstoof met 5% CO₂ 's nachts.
   Opmerking: ten minste 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y cellen zijn nodig voor elke isolatie assay.
2. Verwijder het medium en de cellen met ongeveer 1 mL ijs koud PBS in een 10 cm schotel voor de cultuur van de cel 3 keer wassen.
3. Voeg nieuwe 1 mL ijs koud PBS in 10 cm cel cultuur schotel en schraap de Adherente cellen in een nieuwe 1,5 mL-buis. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
4. Tijdens het centrifugeren, bereiden 5 mL mitochondriale isolatie buffer (250 mM sacharose, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic zuur), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA) aangevuld met 50 μl van protease remmers voorraad oplossing (100 x concentratie; 1 EDTA-gratis tablet opgelost in 500 µL van ddH₂O).
5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 mL van mitochondriale isolatie buffer. Incubeer de 1,5 mL-buis op ijs gedurende 30 minuten.
6. Lyse de zwevende cellen met een glas homogenizer (15-25 strokes) op en neer handmatig op ijs.
   Opmerking: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen cellen worden gehomogeniseerd. Tellen de onbeschadigde cellen en bared kernen Microscoop visueel en bevestigen dat > 90% cel breuk is opgetreden.
7. Breng het homogenaat in een tube 1,5 mL en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot het verwijderen van het puin (kernen en resterende intact cellen).
8. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min 4 ° C.
9. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 15 min 4 ° C.
10. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met mitochondriën met 1 mL van mitochondriale isolatie buffer.
11. Centrifugeer de oplossing gedurende 15 minuten staan bij 14.000 x g 4 ° C om het neerslaan van de mitochondriën.
12. De resulterende mitochondriën pellet moet worden bewaard op ijs en geresuspendeerde in 50-100 μl KCl media (125 mM KCl, 2 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 5 mM glutamaat, 5 mM malate, en 2 μM rotenon, pH 7.4) volgens het volume van het pellet vóór elke kont ay.
13. Gebruik 5 μL van mitochondriale oplossing om te meten de mitochondriale eiwitconcentratie door standaard BCA assay, OD562 meten met behulp van een plaat lezer¹³.

2. bepaling van mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit

1. Voorbereiden van de KCl-media en voeg de Ca^{2 +}-groen fluorescente kleurstof binden aan een eindconcentratie van 0,5 μM voordat het experiment.
2. 1 ml van geïsoleerde mitochondriën (0,4 mg/mL) in KCl media met 0,5 μM Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof in elke plaat 6-well goed.
3. Incubeer de mitochondriën en het Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof in de 6-well plaat bij kamertemperatuur beschermd tegen omgevingslicht voor 1 min. 4 toevoegen μL aliquots van een 20 mM CaCl₂ oplossing (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl₂ 20 mM HEPES, 5 mM glutamaat, 5 mM-malaat, pH 7.4) aan elke plaat 6-well goed met behulp van de automatische instelling om 200 nmol Ca^{2 +}/mg-mitochondriale eiwit afzien.
4. Gebruik een fluorescentie spectrometer om te controleren de fluorescentie wijzigingen elke 3 s gedurende 2 minuten met een golflengte van excitatie van 506 nm en een golflengte van de emissie van 531 nm. De plaat is voorzien van schudden bij 600 omwentelingen per minuut voor 3 s tussen lezingen gecontroleerd door software (Figuur 1).
5. Toevoegen van een extra 4 μL hoeveelheid 20 mM CaCl₂ oplossing aan elk putje en controleren van de fluorescentie wijzigingen elke 3 s voor 2 min. Herhaal deze stap totdat de fluorescentie toeneemt met de tijd.
   Opmerking: De mitochondriën worden uitgedaagd met de toegevoegde Ca^{2 +} aangegeven door de verhoogde opname fluorescentie. Wanneer de mPTP wordt geopend, wordt de fluorescentie met tijd verhoogt.
6. Het interpreteren van het totale bedrag van Ca^{2 +} toegevoegd totdat de mPTP wordt geopend als de Ca^{2 +} retentie capaciteit.

3. bepaling van Ca ^{2 +}-geïnduceerde mitochondriale zwelling

1. Bereiden de KCl media voordat het experiment.
   1. Breng 1 mL van geïsoleerde mitochondriën (0,4 mg/mL) in KCl media in elke plaat 6-well goed.
2. Voeg 10 μL van 20 mM CaCl₂ waterige oplossing (500 nmol/mg mitochondriale eiwit) in mitochondriale eiwitten mitochondriaal zwelling activeren.
3. Opnemen van de afname van de absorptie bij 540 nm elke 3 s op een microplate-lezer gecontroleerd door software voor 10 min (Figuur 2). De fluorescentie veranderingen worden veroorzaakt door een toestroom van opgeloste stoffen over het mitochondriaal binnenste membraan.
   Opmerking: De verminderde absorptie bij 540 nm komt overeen met de gezwollen mitochondriën. Als de lezer niet dat een afname van de absorptie ziet doet, kan een langer interval lezen of lezen van tijd worden aangenomen.

Resultaten

De resultaten van de vertegenwoordiger van Ca^{2 +} retentie capaciteit:
Resultaten werden uitgedrukt als fluorescentie waarden. Met de extra pulsen van Ca^{2 +} (200 nmols/mg mitochondriale eiwit), de fluorescentie stegen met dubbele boven basislijn met de opening van de mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), een inhibitor van de omwenteling van Ca^{2 +}-geïnduceerde mPTP opening, of 1 μM atractyloside (ATR), een activator van Ca^{2 +}-geïnduceerde mPTP...

Discussie

Hier, beschreven we een eenvoudige en effectieve protocol voor de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit assay en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling assay geactiveerd.

Voor de mitochondriale isolatie, door ervoor te zorgen dat alle materialen en buizen op ijs, zijn met name wanneer de cellen homogenisatie. 0,25% trypsine-EDTA kan ook worden gebruikt om het loskoppelen van de cellen van de schotel voor 5 minuten bij 37 ° C. Na 15 tot 25 lijnen is het noodzakelijk om te observ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SH-SY5Y cellijn	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Nummer: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-bindende groen fluorescerende kleurstof
volledige proteaseremmers	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glashomogenisator	Kimble Chase	9885303002
glutamaat	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malaat	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instrumenten	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractylosid	Sigma-Aldrich	C4992
Dulbeccos gemodificeerd Eagle-medium met hoge glucose	Hyclone	SH30022	4,5 g/L glucose, L-glutamine, zonder natriumpyruvaat
foetaal bovien serum	Hyclone	SV30087
penicilline	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycine	Invitrogen	11860-038
BCA-assaykit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm celkweekschaal	NEST	704001