Beoordeling van de urinewegen Junction obstructie gebreken door methyleenblauw kleurstof injectie

Samenvatting

Methyleenblauw kleurstof injectie in het bekken renal vergemakkelijkt de beoordeling van de urinewegen junction obstructie gebreken tijdens de ontwikkeling van muis embryonale urinewegen. Hier, wordt een protocol voor methyleenblauw kleurstof injectie in het bekken renal beschreven.

Samenvatting

Urinewegen junction obstructie gebreken zijn aangeboren anomalieën inducerende hydronephrosis en hydroureter. Lymfkliertest urinewegen junction obstructie gebreken kunnen worden beoordeeld door het bijhouden van methyleenblauw kleurstof stroom binnen het urine-systeem. Kleurstof methyleenblauw wordt geïnjecteerd in het bekken van de renal van perinatale embryonale nieren en kleurstof stroom wordt gecontroleerd van de renal bekken van de nieren via de urineleider en in het lumen van de blaas na het toepassen van hydrostatische druk. Kleurstof accumulatie zal blijken in de blaas lumen van de normale perinatale urinewegen, maar tussen de renal bekken en het eindpunt van een abnormale urineleider, zal worden beperkt als urinewegen obstakels optreden. Deze methode bevordert de bevestiging van de urinewegen junction obstakels en visualisatie van hydronephrosis en hydroureter. Dit manuscript wordt een protocol voor methyleenblauw kleurstof injectie in het bekken van de renal te bevestigen urinewegen junction obstakels beschreven.

Inleiding

Het urine-systeem bestaat uit een paar van de nieren en de urineleiders en een gemeenschappelijk blaas en urinebuis. De belangrijkste functie van het urine-systeem is het handhaven van de homeostase van het lichaam door het beheer van het water en elektroliet evenwicht van het bloed. De nieren filteren het bloed controle elektrolyt concentraties en zuur-base evenwicht, en produceren van urine om overtollig water en afvalstoffen, met inbegrip van opgeloste stoffen en metabolieten uitscheiden. Urine wordt vervolgens vervoerd via de urineleider uit de renal bekken van de nier naar de bladderin een unidirectionele wijze waar ze worden opgeslagen en uiteindelijk uitgeschakeld via de urinebuis¹.

De urineleiders zijn rechte buizen die afkomstig zijn uit de nephric buis. Na de ontluikende uit de nephric buis ten embryonale dage 10.5 (E10.5) in de muis, de urineleider Steel kieuwopeningenvorm en onderscheidt in een meerdere lagen structuur urothelium die ondoordringbare tussen muis genaamd E12.5 en E16.5. De Mesenchyme cellen rondom de urineleider stengel zijn ook onderscheid gemaakt tussen drie lagen bestaande uit innerlijke stromale cellen, tussenliggende dikke zachte spiercellen en buitenste adventitial fibroblasten. Ureterale peristaltische golven initiëren in het bekken renal worden verspreid via de laag van de gladde spieren van de muur van de urineleider naar de blaas voor het vervoer van urine^2,3, dat wordt geproduceerd bij het basisgewicht van E16.5 in de muis¹.

Aangeboren afwijkingen van de nieren en urinewegen (CAKUT) behoren tot de meest voorkomende genetische ziekten, aanwezig in ongeveer 1% van menselijke foetussen^1,4, en bestaat uit een scala aan fenotypen met inbegrip van hydronephrosis en hydroureter. De abnormale ophoping van urine in de nier en urineleider resulteert in de vorming van hydronephrotic-nier- en hydroureter. Een oorzaak van de vorming van hydronephrosis en/of hydroureter is een verstopping van de urinewegen. Ureteropelvic junction obstructie (UPJO) wordt veroorzaakt door afwijkende urine stroom als gevolg van een blokkade tussen de proximale urineleider en de renal bekken, resulterend in hydronephrosis en het verkleinen van de proximale hydroureter met gehoekt of hardnekkige vouwen^{5, 6}. Daarnaast heet het ectopische inbrengen van de distale urineleider in de blaas muur of het voortplantingskanaal ureterovesical junction obstructie (UVJO). UVJO kan ook leiden tot hydronephrosis en hydromegaureter vorming^7,8. Een extra ureterovesical junction (UVJ) defect is vesicoureteric reflux (VUR). VUR wordt gekenmerkt door de stroom van de retrograde urine uit de blaas naar de nieren op UVJ. In vergelijking met UVJO, zijn perinatale embryo's met VUR niet duidelijk zichtbaar een opgezwollen hydronephrotic nier- of ernstige hydroureter fenotype⁹.

In het laboratorium muis, kan stroom van urine worden onderzocht door de injectie van een kleurstof, zoals methyleenblauw, in de renal bekken⁹. De injectedmethylene blauwe oplossing zal het traceren van het traject van de urine van de renal bekken via de urineleider en in de blaas. Hydronephrosis kan worden herkend door een uitbreiding van de kleurstof in de nier. UPJO kunnen worden gedetecteerd als een stagnatie van kleurstof stroom op de proximale urineleider met opgezwollen renal bekken⁵. Een verwijding van de urineleider aangegeven door een uitlopende diameter toont een voorbeeld van hydroureter. Ten slotte, kleurstof accumulatie op de muur van de blaas of op de site van het voortplantingskanaal geeft UVJO met opgezwollen hydronephrotic nier en hydromegaureter^7,10uitgezet. U wilt opsporen VUR, de oplossing kleurstof wordt geïnjecteerd in de blaas en latere retrograde stroom wordt gecontroleerd in de nier⁹.

Hier, wordt een protocol voor injectie van de kleurstof methyleenblauw in het bekken renal van een perinatale embryo gepresenteerd. Dit protocol staat het traceren van urine vloeien voort uit de renal bekken via de urineleider en in de blaas en wordt gecontroleerd of potentiële urinewegen junction obstakels zoals UPJO of UVJO.

Protocol

Muizen (Wnt5a flox / flox muizen (Wnt5a ^tm1.1Tpy) en Dll1Cre lijn, UVJO muismodel) ⁷ werden beheerd volgens de richtlijnen van NIH voor de verzorging en het gebruik van proefdieren was en studeerde onder een protocol dat door het NCI-Frederick Animal Care en gebruik Comité goedgekeurde.

1. bereiding van de kleurstof methyleenblauwoplossing

1. meten van 0.1 g methyleenblauw poeder.
2. Volledig los van de methyleenblauw in 10 mL normale zout of 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door vortexing.
3. Filteren de methyleenblauwoplossing van 10 mg/mL met een spuit filter (membraan poriegrootte 0.45µm) te elimineren verstopping tijdens injectie.
4. Assemble een steriele hoofdhuid ader set (27GX3/4 ″) met een disposable spuit 3 mL en vul de spuit met 3 mL gefilterd methyleenblauwoplossing.
   Opmerking: Om te voorkomen hydrostatische druk en latere kleurstof stroom, plaats het uiteinde van de naald boven de spuit gevuld met methyleenblauwoplossing.

2. Dissectie van prenatale embryo's

1. schone ontrafeling van schaar en pincet met 70% ethanol.
2. Voor het verzamelen van perinatale embryo's op E18.5 of E19.5, euthanaseren zwangere muizen eerst met behulp van CO ₂ inademing en voer cervicale dislocatie volgens de richtlijnen van de NIH.
   Opmerking: De zwangere vrouwelijke muis meestal geeft geboorte starten op E18.5, grotere nieren zijn echter makkelijker te manipuleren. Daarom zijn de nieren bij E19.5 dichter tot geboorte eenvoudiger uit te voeren deze analyse op. Pups echter met bilaterale urinewegen obstakels sterven na de geboorte. Afhankelijk van de kenmerken van experimentele muizen, een geschikte dag/afhaaltijd empirisch moet worden bepaald.
3. 70% ethanol op het ventrale buik oppervlak spuiten en open vervolgens de buikholte ventrally met behulp van ontleden schaar en pincet.
4. Lift de hele baarmoeder en scheiden van het lichaam door te snijden met het ontleden van schaar op de toppen van de baarmoeder horens.
5. De hele baarmoeder met 1 x PBS spoel in een petrischaal.
6. De baarmoeder segmentally met het ontleden van schaar te knippen en verwijderen van de placenta decidua met pincet om bloot van de embryo's in de dooier zakjes te ontleden.
7. De dooierzak eerst verwijderen en verwijder het vruchtwater membraan met de ontrafeling van de verlostang om te bevrijden van de perinatale embryo.
8. Decapitate een embryo met het ontleden van de schaar. Veeg overtollige bloed met steriel gaas kussentjes. PIN het embryo naar beneden met het ventrale oppervlak tot op een ontleden Microscoop uitgerust met een digitale camera voor imaging. Verzamelen van zijn staart voor genotypering zonodig.
   Opmerking: Het uitvoeren van injecties één embryo tegelijk.
9. Open zorgvuldig de buikholte van een embryo met een tang door scheuren van de huid. Verwijder daarna voorzichtig overtollige organen en weefsels zoals lever, maag en darm met een tang door snijden ze of trekken ze uit bloot van de nieren, de urineleiders en de blaas die zich bevinden dorsally ( figuur 1A). Absorberen overtollige bloed uit de ontleed embryo met steriel gaas kussentjes zonodig.
   Opmerking: Teveel bloed interfereert met de identificatie van het bekken van de renal voor de kleurstof injectie.

3. Injectie van kleurstof methyleenblauw in de Renal bekken en Monitoring kleurstof Flow

1. verwijderen bubbels in de naald en de leidingen door uitzetting methyleenblauwoplossing vanaf de punt van de naald door de hydrostatische druk. Til de spuit met de kleurstof oplossing boven het niveau van de naald tip om te beginnen met stroom, en dan lager de spuit om te stoppen met stroom.
2. Steek de naald in de renal bekken in de buurt van de proximale urineleider, verzorgen niet te verstoren het eenmaal geplaatst. Uitvoeren van kleurstof injectie in een nier om te bepalen van de urinewegen obstructie.
   Opmerking: Voer eerste kleurstof van injectie in een abnormale nier ⁷ door het volgen van de dezelfde manier om te bepalen van de obstructie van de urinewegen.
3. Til de injectiespuit omhoog ongeveer 20 cm te voorzien van hydrostatische druk en laat 15 µL - 60 µL van de kleurstof oplossing stroom. Het debiet zullen ongeveer 3 µL/s als de spuit is verhoogd naar deze hoogte boven het embryo.
4. Volgen de blauwe kleur van de kleurstof beginnen eerst in het bekken renal, dan in de lengte van de urineleider, en tenslotte in de blaas lumen.
   Opmerking: Het duurt ongeveer 5 s om te zien een zwakke afdrukkleur ontstaan binnen het lumen van de blaas als de ureter in de blaas juist is geplaatst. Toestaan dat de kleurstof te accumuleren op de geblokkeerde site ongeveer 15 s als geen kleurstof kleur wordt weergegeven in de blaas lumen.
5. Plaats de injectiespuit tot stop kleurstof stroom en verwijder de naald uit de nieren.
6. Neem beelden van de nier en de ureter de blaas getraceerd met kleurstof oplossing met behulp van de camera en beeldvorming wordt verbonden met een stereomicroscoop.
7. Hydronephrosis van de nier, hydroureter en het definitieve standpunt van de kleurstof oplossing noteert in een lab notebook.
8. Uitvoeren injectie van de contralaterale nier zoals beschreven in afdelingen 3.1) tot 3,5) en kleurstof stroom ongeveer 20 s Intotaalwerden.
   Opmerking: De blaas lumen zal worden gevuld met kleurstof oplossing, aangegeven door een sterke blauwe kleur en als de ureter in de blaas lumen juist is geplaatst. Na beoordeling van de urinewegen junction obstructie, de urineleiders en de blaas kunnen worden vastgesteld voor het segmenteren.

Resultaten

De nieren en de lagere urinewegen bevinden zich dorsale tot de meeste andere inwendige organen zoals de lever en de darm. Na het verwijderen van deze andere inwendige organen, zijn een paar van de nieren en de urineleiders en de blaas van een enkel zichtbaar (figuur 1A). Na succesvolle dissectie, zal de kleurstof ingespoten in het bekken renal vloeien voort uit de nier naar de blaas via de urineleider. Het bekken renal is het trechter-achtige verwijde proxima...

Discussie

Muis nieren zijn functionele begin op E16.5 en een kleurstof injectie test is theoretisch mogelijk vanaf dit punt van tijd. De nier is te klein om te worden geïnjecteerd met de kleurstof oplossing echter en fenotypen zoals hydronephrosis en hydroureter niet duidelijk worden nageleefd omdat deze fenotypen een neveneffect van urine opgebouwd als gevolg van abnormale urine vervoer zijn. Deze fenotypen, van de obstakels zoals UPJO of UVJO, zijn duidelijk op E18.5 door opgezwollen nieren en urineleiders. Grotere nieren van em...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Methyleenblauw	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMALE SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL wegwerpspuit met BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Spuitfilters met Supor Membraan	Pall Corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delikate Operatieschaart	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissectietang	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Pincet; Patroon #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Naalden 30 G x 1/2"	BD	305106