Methodenartikel

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

DOI:

10.3791/56261

⸱

18 november 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren heeft de zebravis embryo ontpopt als een populair model te bestuderen van de ontwikkelingsbiologie als gevolg van eigenschappen zoals ex utero embryo-ontwikkeling en optische transparantie. In het bijzonder de zebravis embryo is uitgegroeid tot een belangrijke organisme te bestuderen gewervelde nier organogenese, alsmede multiciliated cel (MCC) ontwikkeling. Om te visualiseren MCCs in de embryonale zebrafish nier, wij hebben ontwikkeld, een gecombineerde protocol van geheel-mount fluorescente in situ -hybridisatie (FISH) en hele monteren immunofluorescentie (IF) waarmee de hoge resolutie beeldvorming. Dit manuscript beschrijft onze techniek voor samen het lokaliseren van afschriften van RNA en eiwitten als een instrument om de regulering van de ontwikkelings programma's via de uitdrukking van verschillende afkomst factoren beter te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen decennia, heeft de zebravissen (Danio rerio) ontpopt als een eersteklas modelorganisme te bestuderen van de ontwikkelingsbiologie. De embryo's ontwikkelen buiten de moeder en optisch transparant zijn. Ook de vorming van vitale organen zoals de ogen, nieren en reukkolf treedt snel op met structuren gevormd door gewoon 24u plaatsen bevruchting (hpf). De zebravis genoom is bovenal zeer geconserveerd met zoogdieren1,2,3. Daarnaast, hebben zebravis en zoogdieren organen soortgelijke anatomie en fysiologie. De zebravis embryonale nier-, of pronephros, toont de waarde van de modelsysteem voor de behandeling van de genfunctie tijdens de vroege nephrogenesis en bepaling van het lot van geconserveerde epitheliale cel populaties van de gewervelde Nefron4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ook geworden de zebravis embryo steeds belangrijker bij de behandeling van de ontogenie MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.

Zoals hun naam al doet vermoeden, zijn MCCs epitheliale cellen gekenmerkt door een bundel van motile cilia gelegen aan de apicale oppervlakte17. In de zebravis, MCCs functioneren in vloeistofstromen en zijn gedispergeerd in een "peper" zoals wijze over het gehele van het midden van elke Nefron van de pronephros door 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. Hoewel ze hebben slechts opgemerkt in een handvol van menselijke nier ziekte gevallen18,19,20,21, MCCs heersen in andere zoogdieren weefsels zoals de hersenen en luchtpijp22,23,24, die een groot aantal uitdagingen voor experimenteel design vormt. Elegante studies in verschillende gewervelde modellen, met inbegrip van de zebravis hebben aangetoond dat een geconserveerde traject van MCC lot, met de inkeping signalering traject als een inhibitor van de omwenteling van MCC ontwikkeling12,17,25 ,26,27. Dus, de zebravis pronephros biedt een gemakkelijk toegankelijk model voor het bestuderen van de genetische mechanismen van MCC ontwikkeling in vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.

Zowel de transparantie en de gemakkelijke genetische manipulatie van zebravis embryo's hebben bewezen te zijn van onschatbare kenmerken bij de studie van de genetische en moleculaire trajecten die lot van de cel, weefsel groei en ontwikkeling van de vroege embryo1,2 regelen ,3. Als dergelijke, traditionele technieken te visualiseren van eiwitten en gene afschriften, zoals in situ hybridisatie en hele mount als, zijn toegepast op en geoptimaliseerd voor de zebravis16,28,29, 30,31,32,33,34,35,,36,,37,38. Door het combineren van populaire protocollen voor vis en als, is het mogelijk label te analyseren MCCs in vivo16,28,37,38.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol gebruikt zebrafish volwassenen onderhouden en verzorgd door het centrum voor Zebrafish onderzoek aan de Universiteit van Notre Dame. Alle methoden voor het werken met volwassenen van de zebravis en embryo's zijn door de institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.

1. de embryo fixatie

  1. Verzamelen zebrafish embryo's met behulp van de eerder beschreven methoden39,40. Op 24 hpf, voeg 500 µL van aspecifieke protease mengsel oplossing (50 mg/mL) van de E3 in een embryo schotel Incubate bij kamertemperatuur (RT).
  2. Zodra embryo's begint uit te breken van de chorion, verwijder alle vloeistof uit de embryo schotel.
  3. Het wassen van de embryo's 2 - 3 keer met verse E3 door toevoeging van ongeveer 20 mL E3, wervelende zachtjes de E3 in de schotel en vervolgens de vloeistof decanteren in een vloeibare afvalstoffen vergaarbak.
  4. Om te euthanaseren de embryo's vóór de vaststelling, voeg toe 2 mL 0,2% tricaïne op de E3.
  5. Breng de embryo's in een 5 mL glazen ampul met behulp van een plastic pipet van Pasteur. Verwijder allermeest naar de oplossing van de tricaïne/E3 met behulp van de pipet nadat de embryo's hebben geregeld naar de onderkant van de flacon.
  6. Fix 24 hpf embryo's met 4% paraformaldehyde (PFA) 5 mL voor 2-4 h op RT, zonder agitatie.
    Let op: PFA is giftig en PFA oplossingen moeten worden behandeld onder een chemische motorkap, terwijl de onderzoeker is het dragen van een veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas. Voorbereiding van de PFA-fixeerspray uit de gekorrelde PFA poeder moet worden uitgevoerd met uitzonderlijke zorg, zoals de gekorrelde PFA neigt te verspreiden door middel van statische lading.
    Opmerking: Embryo's kunnen oplossen in 4% PFA overnacht bij 4 ° C. Bereiden van 4% PFA door verwarming van 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan de kook terwijl het voortdurend roeren de oplossing te ontbinden volledig de gekorrelde PFA. Zodra de oplossing is afgekoeld terug naar RT, de 4% PFA filter gesteriliseerd is door het passeren van een wegwerp systeem van 0,45 µm voor vacuüm filtratie, dan en aliquoted in 15 mL of 50 mL porties voor opslag bij-20 ° C.
  7. Verwijderen van de 4% PFA en wassen embryo's tweemaal met 1 X fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (PBST) op RT. wassen de embryo's keer met 5 mL 100% methanol (MeOH) op RT. Voeg 5 mL vers 100% MeOH op de embryo's en Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 20 minuten.
    Opmerking: Embryo's kunnen worden opgeslagen in 100% MeOH bij-20 ° C tot klaar voor de voorbereiding van het embryo.

2. de embryo voorbereiding en kruising

  1. Hydrateren van de embryo's door het wassen eenmaal in 5 mL 50% MeOH in 1 x PBST voor 5 min op RT. doorgaan rehydratie door het wassen van de embryo's in 5 mL 30% MeOH in 1 x PBST voor 5 min op RT. wassen de embryo's in 5 mL 1 x PBST tweemaal voor elke 5 min op RT.
  2. Permeabilize van de embryo's door ze aan het broeden in 5 mL van een oplossing van 1:1,000 proteïnase K (pK) (10 mg/mL) in 1 x PBST voor 2 min op RT.
    Opmerking: Oudere embryo's langer dan 2 min van de concentratie van de pK hierboven vermeld, maar een concentratie van 5 mg/mL en incubatie tijd minder dan 2 min voor embryo's jonger dan 24 wordt voorgesteld kunnen worden geïncubeerd hpf.
  3. Verwijder pK oplossing en wassen onmiddellijk in 5 mL 1 x PBST tweemaal op RT. Fix de embryo's in 5 mL 4% PFA op RT voor minstens 20 min.
    Opmerking: Embryo's kunnen oplossen in 4% PFA overnacht bij 4 ° C.
  4. Verwijder PFA en wassen tweemaal in 5 mL van de 1 x PBST op RT.
  5. Transfer van de embryo's in 5 mL 1 x PBST in platte bodem microcentrifuge buizen rechtop geplaatst in een microcentrifuge rack op RT om interacties tussen elk embryo en de daaropvolgende hybridisatie oplossing.
  6. De embryo's twee keer in 1,5 mL hybridisatie oplossing (Hyb +) op RT. Voeg 1,5 mL verse Hyb + wassen en embryo's bij 70 ° C in een kruising oven voor 4-6 h uit te broeden.
  7. De 1,5 mL Hyb + vervangen met een volume van sonde oplossing (10 µL RNA sonde/500 µL Hyb +) voldoende om de embryo's volledig te dekken.
    Opmerking: Synthetiseren antisense RNA sonde met eerder beschreven methoden39.
  8. De sonde 's nachts in de oven van de kruising bij 70 ° C met de afzonderlijke buizen geplaatst rechtop in de microcentrifuge rek, te vermengen zonder schudden.

3. warme wast en blokkeren

Opmerking: Hot wast zijn uitgevoerd door de passende oplossing zetten de embryo's en vervolgens aan het broeden in de oven van de kruising bij 70 ° C. Plaatsen om te houden de wassen oplossingen bij 70 ° C, 50 mL buizen van elke oplossing in de kruising oven wanneer de sonde / Hyb + mengsel wordt toegevoegd.

  1. Het verwijderen van de sonde. Het wassen van de embryo's tweemaal bij 70 ° C in 1,5 mL 50% formamide/2 x saline-Natriumcitraat (SSC) buffer voor elke 20-30 min.
    Opmerking: De sonde kan worden opgeslagen in Hyb + bij-20 ° C en opnieuw gebruikt op een later tijdstip.
  2. Wassen van de embryo's eens bij 70 ° C in 1,5 mL 2 x SSC voor 15 min. wassen de embryo's tweemaal bij 70 ° C in 1,5 mL 0,2 X SSC voor elke 20-30 min. Vervangen 0.2 x SSC met 1,5 mL blokkerende reagens en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
    Opmerking: Het is mogelijk om te broeden blokkerende reagens op RT voor 4 uur in plaats van de overnachting.

4. antilichaam-incubatie en maleïnezuur Buffer wast

Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.

  1. Vervang de blokkerende reagens met 0,2 mL anti-DIG-POD in blokkerende reagens bij een verhouding van 1:1,000 en incubeer gedurende 3U onder aluminiumfolie of een andere licht-blokkerende dekking op RT.
    Opmerking: U kunt ook het antilichaam kan na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
  2. Na 3U, door de embryo's te wassen in 1,5 mL maleïnezuur buffer 2 - 4 keer gedurende 10-15 minuten, elk op RT. Incubate de embryo's 's nachts bij 4 ° C in 1,5 mL verse maleïnezuur buffer.
    Opmerking: Het is niet nodig om na een nacht bebroeden in maleïnezuur buffer, maar doen dus vermindert sonde achtergrond.

5. sonde detectie en verwijdering van Peroxidase

Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.

  1. Maleïnezuur buffer te verwijderen en te vervangen met 1,5 mL 1 x PBS. Wassen van embryo's twee keer in 1,5 mL 1 x PBS voor 5 minuten elk op RT. Incubate embryo's in 0,2 mL van Cy3 fluorescerende kleurstofoplossing gedurende 60 minuten op RT.
    Opmerking: Incubatietijd kan variëren voor verschillende sondes.
  2. Wassen van de embryo's keer met 1,5 mL van het volgende percentage MeOH in 1 X PBS voor 10 min op RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH en 100% MeOH.
  3. Incubeer de embryo's met 1,5 mL voor 1% H2O2 in MeOH voor 30 min op RT. Wash de embryo's keer met 1,5 mL van de volgende oplossingen van de MeOH in 1 x PBS voor 10 min op RT: 75% MeOH 50% MeOH en 30% MeOH. Het wassen van de embryo's tweemaal voor elke 5 min op RT in 1,5 mL 1 x PBS.
    Opmerking: Embryo's kunnen worden opgeslagen in PBS's nachts bij 4° C.

6. immunofluorescentie

Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.

  1. Wassen van de embryo's 1,5 mL van ddH2O voor 5 min op RT. Wash de embryo's in 1,5 mL pre gekoeld aceton (opgeslagen bij-20 ° C) 7 min op RT. de embryo's eenmaal in 1,5 mL ddH2O gedurende 5 minuten wassen op RT. Wash de embryo's eenmaal in 1.5 mL 1 x PBST met 1% DMSO (PBDT) voor 5 min op RT.
  2. Incubeer de embryo's in 1,5 mL PBDT + 10% foetale runderserum (FBS) op een rocker op RT gedurende 2 uur.
  3. PBDT + FBS verwijderen en te vervangen met 1,5 mL primaire antilichamen, anti-geacetyleerd tubuline (geproduceerd van muis) en anti-γ-tubuline (geproduceerd van konijn), samen op 1:400 PBDT + 1% verdund FBS. Incubeer de embryo's 's nachts bij 4 ° C.
    Opmerking: Incubatie tijden kunnen variëren afhankelijk van het primaire antilichaam. Testen van verschillende tijdsintervallen mogelijk moet optimaliseren labeling.

7. secundair antilichaam

Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.

  1. Schakel overtollige unbound antilichaam van de embryo's, wassen in 1,5 mL PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl voor 1 min op RT op een rocker.
  2. Wassen van de embryo's 5 keer in 1,5 mL van PBDT + 1% wassen FBS + 0,1 M NaCl gedurende 30 minuten op een rocker op RT. de embryo's in 1,5 mL PBDT + 1% FBS gedurende 30 minuten op RT op een rocker.
  3. Incubeer de embryo's 's nachts bij 4 ° C in 200 µL van de secundaire antilichamen, Alexa 488 geit anti-muis IgG en Alexa 647 geit anti-konijn IgG, verdund samen in PBDT op 1:500.

8. DAPI kleuring

Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.

  1. Wassen de embryo's snel op RT in 1,5 mL PBDT twee keer. Vervang PBDT met 1,5 mL DAPI, 1:15000 in 1 X PBST wordt verdund en incubeer 15 min op RT op een rocker.
  2. Wassen van de embryo's in 1,5 mL PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl drie keer op RT gedurende 15-20 minuten elk. Het bewaren van embryo's in 1,5 mL van PBDT bij 4 ° C tot klaar om te monteren en afbeelding.

9. montage- en Imaging voor Zebrafish Pronephros

  1. Lag embryo laterale op glasplaatje in een klein volume, ongeveer 10 µL, PBDT.
  2. Knijp het embryo achter de ogen met een paar fijne pincet voor het verwijderen van het hoofd en enkele van de dooier-bal.
  3. Gebruik de fijne pincet voorzichtig schrapen weg de resterende dooier bal uit het lichaam van het embryo. Verwijder de gedissocieerde dooier en extra vloeistof van de dia met een dun weefsel.
  4. Voeg een druppel montage media aan de resterende staart van het embryo en plaats zodat de staart zijwaarts wordt gelegd. Plaats een dekglaasje aan op de top van de staart aan het afvlakken van de steekproef, dan plaats in een overdekte glijbaan-vak.
  5. Beeld van nier cilia bij 60 X vergroting op een confocal microscoop met behulp van de volgende kanalen: DAPI in blauw (laser instellen op 408.0 nm), FITC in het groen (laser instellen op 488.0 nm), Cy3 kleurstof-geëtiketteerden in het rood (laser instellen op 561.0 nm), en Alexa 680 in wit (laser instellen op 637.0 nm).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wild-type zebrafish embryo's werden vastgesteld op 24 hpf en onmiddellijk bereid zoals hierboven beschreven. Figuur 1 toont een experimentele workflow samen met geselecteerde geïllustreerde stadia. De workflow beschreven in stappen 1-8 omvat de processen van monster inkoop, fixatie en manipulatie van de vaste weefsel aan endogene afschriften van een label met antisense riboprobes gevolgd door immunofluorescentie naar label expressie gebrachte eiwitten van belang. Stap 9 in de werkstroom wordt verwezen naar de montage en beeldvormende technieken specifiek ontworpen voor het optimaliseren van de visualisatie van de zebravis embryonale kofferbak. In de tekeningen die gepaard gaan met stap 9, illustreren we de methode voor de manipulatie van de positionering van het weefsel op een glasplaatje. In deze stap worden de embryo's hoofd en dooier bal verwijderd, verlaten van de staart kunnen lateraal worden gepositioneerd tussen een glasplaatje en dekglaasje aan. Verwijdering van de dooier bal en het hoofd wordt voorgesteld voor de beste beeldvorming van de bevolking van de MCC in de pronephros, zoals de eidooier bal auto-licht en de montage proces belemmert.

Representatieve beelden verkregen met behulp van een confocal microscoop vindt u in Figuur 2, waaruit het dezelfde wild-type embryo bij 60 X vergroting en een digitale zoom op de dezelfde vergroting blijkt. De bovenste panelen bieden beelden van elk individueel kanaal, terwijl de onderste twee panelen de samengestelde overlay van deze beeldvorming gegevens zijn. Het witte vak (in de linker kolom afbeelding) schetst het gebied dat is de focus van de digitale zoom (de rechterkolom afbeelding). Gemarkeerd in het laatste deelvenster van de digitale zoom, kernen in de DAPI waren gelabeld en MCCs geconstateerd op basis van een antisense riboprobe ontworpen te herkennen odf3b, antilichamen tegen γ-tubuline duiden de basale organen waarbij α-tubuline duidt de cilia. In de digitale zoom van de samengestelde overlay, de gele onderbroken rondje geeft aan dat de omtrek van een MCC, die werd geïdentificeerd als gevolg van het bezit van odf3b afschriften, meerdere basale organen en cilia. De aangrenzende mono-ciliated cel, gemarkeerd met een gele gestippelde cirkel, werd geïdentificeerd op basis van het fenotype van het bezitten van een enkele basale lichaam en een enkele cilium.

figure-results-1
Figuur 1: schematische van experimentele stroomdiagram. Dit stroomdiagram toont een experimentele workflow, gepaard met illustraties van kritieke fasen waarbij de sneeuwvlok koude incubatie aangeeft, de drie gebogen lijnen geven de warmte en de klok vertegenwoordigt lange incubatie tijden. De werkstroom kan worden uitgevoerd in een minimum van 6 dagen (Zie dagnummer in de hogere juiste hoek van elke stap in het proces), hoewel sommige stappen kunnen worden uitgevoerd over langere perioden, zoals vermeld in het protocol. Een gedetailleerde beschrijving van de montage proces is getrokken uit, tonen de laatste gemonteerde embryo staart tussen het glasplaatje en dekglaasje aan. Een zwarte onderbroken doos schetst het gebied dat is beeld bij 60 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: vertegenwoordiger resultaten voor het visualiseren van MCCs van de zebravis pronephros. Maximale beeld projecties van een 24 hpf wild-type zebrafish embryo op 60 X vergroting evenals een digitale zoom op de confocal bij 60 X vergroting van de dezelfde embryo. De witte vakken geven aan het gebied gericht op voor de zoom. Individuele vlekken van de DAPI (kernen), odf3b (MCCs), γ-tubuline (basale instanties) en α-tubuline (cilia) zijn gemarkeerd en vervolgens samengevoegd in de onderste twee panelen. In de digitale zoom, wij bieden benaderingen van de cellocaties als volgt: een MCC is geschetst door de onderbroken gele cirkel, en de gele gestippelde cirkel schetst een mono-ciliated cel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hierboven is geoptimaliseerd voor het labelen van MCCs in de pronephros met odf3b transcripties en α-tubuline in 24 hpf zebrafish embryo's. Voor de beste resultaten, is het aanbevolen om het gebruik van vers vaste en bereid embryo's. Embryo's die zijn vastgesteld en in MeOH of Hyb + opgeslagen bij-20 ° C gedurende langer dan één week kunnen worden gebruikt, maar de kans op ongewenste achtergrond kleuring neemt toe met de tijd dat de embryo's worden bewaard in opslag.

Wijzigingen en het oplossen van deze techniek zijn noodzakelijk voor het afstemmen van deze methode voor andere suites van bepaald merkers, bijvoorbeeld andere antisense riboprobes en andere antistoffen. Veel methoden voor het aanpassen van de parameters van de stappen in het proces van hele berg in situ hybridisatie geweest eerder gedocumenteerd door onze fractie en anderen31,34,36,,38, 39. Ook elk eiwit antilichaam vergt een aantal controles op het gebied van de kleuring van tijden en geschatte reeksen van verdunningen en incubatie tijden voor elke primair antilichaam worden best geschat door evaluatie van gedocumenteerde resultaten28, 35. voor embryo's jonger dan 24 hpf, pK behandeling moet korter zijn dan 2 min, waar embryo's ouder dan 24 hpf pK langer dan 2 min moet worden behandeld. Ook embryo's ouder dan 24 hpf van pigment vóór de pK behandeling moet worden gebleekt.

Na kleuring met de fluorescerende kleurstofoplossing, is het van cruciaal belang voor het verwijderen van alle resterende vlek, antilichaam en Peroxidasen door het uitvoeren van de reeks van methanol en waterstofperoxide wast. De PBS wast onmiddellijk na zijn essentieel voor het verwijderen van overtollige methanol uit de embryo's. Nog belangrijker is, voordat u verdergaat met de IF-antistoffen, hebben we vonden de aceton en gedeïoniseerd water wast dat de embryo's minder kans zich te houden aan elkaar en/of de centrifuge buizen. In onze ervaring, antilichamen voor specifieke transcriptiefactoren en andere genen, hoewel zij efficiënt kunnen werken westelijke vlekken, werken niet goed voor als in de zebravis. Echter werken zeer geconserveerde en overvloedige eiwitten, zoals α-tubuline en β-catenine, goed in de zebravis voor als16,37.

Met vis is het mogelijk om te visualiseren van RNA transcripties van genen die nog geen specifieke antistoffen in de zebravis. Door het combineren van vissen met als, zoals blijkt uit dit protocol, kan co lokalisatie van afschriften van RNA en eiwit worden gezien in vivo (Figuur 2). De flexibele aard van het protocol kan snelle oplossing voor de visualisatie van verschillende afschriften van RNA en eiwitten in vele weefsels en tijd punten. Wanneer gecombineerd met de al gerespecteerde trekken van zebravis embryo's, biedt dit protocol van vis + als een ander hulpmiddel voor het verkennen van de expressie van genen en eiwitten belangrijk bij verordening van de ontwikkelingsdoelen traject.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de toekenning van R01DK100237 aan R.A.W. en de National Science Foundation Graduate onderzoek Fellowship nr. DGE-1313583 naar A.N.M. Wij danken ook de College van wetenschap zomer Undergraduate Research Fellowship-programma voor steun aan M.U. We bedank het centrum voor Zebrafish onderzoek aan de Universiteit van Notre Dame voor hun specifieke verzorging van onze zebrafish. Wij zouden ook willen bedanken de afdeling biologische wetenschappen, alsmede de leden van ons lab voor al hun steun en waardevolle inzichten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
non-specific protease mixture solutionRoche11459643001, pronase from Streptomyces griseusVerdunn in E3 zonder methyleenblauw om een stockoplossing van 50mg/mL te maken; bewaar bij -20°C
E3 oplossingVerdun 50X E3 (250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 in gedistilleerd water) in gedistilleerd water; voeg 1 x 10-5 M methyleenblauw (sigma M9140) toe om besmetting te remmen
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methaansulfonaat)FlukaA5040-250GOm een stockoplossing van 0,2% te maken, los 1 g tricainepoeder op in 10 mL Tris, pH 9,5 en gedistilleerd water tot 500 mL
embryo schotelsVWR351029
5 mL glazen flaconsWheaton225012
wegwerpbare plastic Pasteur pipettenVWR414004-004
4% paraformaldehyde (PFA) oplossingElectron Microscopy Services19210Los 4% PFA op in 1X PBS en breng onder een afzuigkap aan de kook. Koel en verdeel in porties, bewaar dan bij -20°C. Niet opnieuw invriezen na ontdooien voor gebruik.
10X PBSAmerican BioanalyticalAB11072Verdun in gedistilleerd water om een 1X stock te maken
Tween-20 stockAmerican BioanalyticalAB02038Maak een 0,1% Tween-20 stock door te verdunnen in gedistilleerd water.
1X fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (PBST)SigmaP94160,1% Tween-20 in 1X PBS
methanol (MeOH)Sigma34860-4L
proteinase KRoche3115879001Los op in gedistilleerd water om een stock van 10 mg/mL te maken; verdeel in porties en bewaar bij -20°C
microcentrifugebuisjes met platte bodemVWR87003-300; 87003-298
formamideAmerican BioanalyticalAB00600bewaar bij -20°C
hybridisatieoplossing (HYB+)50% formamide, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/mL gist torula RNA, 50 μg/&/;L heparine; bewaar bij -20°C
hybridisatieovenFisher Scientific13-247-10Q
20X saline-sodiumcitraat (SSC) bufferoplossingAmerican BioanalyticalAB13156verdun in gedistilleerd water om 2X en 0,2X stocks te maken
blokkerende reagentioplossingRoche11096176001verdun in maleïnezuurbuffer om een stockoplossing van 10% te maken; bewaar bij 4°C
maleïnezuurbufferoplossingSigmaM0375 en S7653150mM maleïnezuur, 100mM NaCl (pH 7,5)
anti-Digoxigenin-POD, Fab-fragmentenRoche11207739910bewaar bij 4°C
Cy3 fluorescente kleuringsoplossingPerkinElmer, Inc.NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 systeembewaar bij 4°C; bereid verse kleuringsoplossing door een 1:50 verdunning van TSA-reagens (opgelost in 60 uL DMSO) in de kitbuffer te maken
Waterstofperoxide (H2O2)SigmaH1009-500mLbewaar bij 4°C
moleculair gezuiverd gedistilleerd water (ddH2O)Mediatech25-055-CM
acetonAmerican BioanalyticalAB00636-01000bewaar een portie bij -20°C
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
foetaal bovien serum (FBS)Gibco10438-034verdeel in porties en bewaar bij -20°C
monoklonaal anti-acetyleerd tubuline klon 6-11B-1Sigma-AldrichT6793verdeel in porties en bewaar bij -20°C
anti-γ-tubuline antilichaam geproduceerd in konijnSigma-AldrichT5192verdeel in porties en bewaar bij -20°C
odf3b cDNA klon MGC:63985OpenBiosystemsIMAGE:6792478bewaar bacteriële glycerolstock bij -80°C
NaCLAmerican BioanalyticalAB01915-05000
Alexa flour 647 geit anti-konijn IgGLife TechnologiesA21245bewaar bij 4°C; bescherm tegen licht
Alexa fluor 488 geit anti-muis IgGLife TechnologiesA11029bewaar bij 4°C; bescherm tegen licht
DAPILife TechnologiesD1306verdeel in porties en bewaar bij -20°C
glas plaatjeThermo-Fisher4445
glas dekglasThermo-Fisher12-540A18 x 18 mm
fijne pincettenRobozRS-1050Dumont Pincetjes Model #55
montage mediumPolysciences, Inc.18606, Aqua-Poly/Mountbewaar bij 4°C
confocale microscoop en bijbehorende softwareWe gebruiken een Nikon C2plus Confocale Microscoop met NIS-elements AR software
slingerBio-Rad1660710EDU

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).
  3. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  4. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  5. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  6. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  7. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
  9. Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  10. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  11. Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  12. Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
  13. Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18(2007).
  14. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
  15. Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
  16. Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
  17. Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
  18. Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
  19. Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
  20. Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
  21. Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
  22. Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
  23. Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
  24. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
  25. Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
  26. Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
  27. Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
  28. Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
  29. Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
  30. Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
  31. Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
  32. Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
  33. Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
  34. Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
  35. Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060(2013).
  36. Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
  37. Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  38. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
  39. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604(2014).
  40. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063(2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zebravisembryowhole mount FISHimmunofluorescentieprotocolRNA prote ne co lokalisatieconfocale microscopieODF3Bgeacetyleerde alfa tubulinegamet tubulinebeeldvorming van de pronefros

Gerelateerde artikelen