Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

Samenvatting

Een eenvoudige en efficiënte microinjection protocol voor het bewerken van het gen in channel catfish embryo's met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem wordt gepresenteerd. In dit protocol, begeleiden RNAs en Cas9 eiwit in de dooier van één-cel embryo's waren microinjected. Dit protocol is gevalideerd door kloppen uit twee channel catfish immuun-gerelateerde genen.

Samenvatting

Het volledige genoom van de channel catfish, Ictalurus punctatus, heeft sequenced, wat leidt tot meer kansen voor de studie van channel catfish genfunctie. Gene knock-out is gebruikt voor het bestuderen van deze gene functies in vivo. De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR geassocieerde eiwit 9 (CRISPR/Cas9) systeem is een krachtig hulpmiddel gebruikt voor het bewerken van genomic opeenvolgingen van DNA om te veranderen van de genfunctie. Terwijl de traditionele benadering is geweest om CRISPR/Cas9 mRNA in de eencellige embryo's door middel van microinjection, kan dit een langzaam en inefficiënt proces in meerval. Hier, wordt een gedetailleerd protocol voor microinjection van channel catfish embryo's met CRISPR/Cas9 eiwit beschreven. Kort, eieren en sperma werden verzameld en dan kunstmatige bevruchting uitgevoerd. Bevruchte eieren werden overgedragen aan een petrischaal met Holtfreter de oplossing. Geïnjecteerd volume was gekalibreerd en vervolgens begeleiden RNAs/Cas9 gericht op de tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM 1) gen en rhamnose bindend lectine (RBL) gen werden microinjected in de dooier van één-cel embryo's. Het gen raakeffect was succesvol want microdeleties werden bevestigd door DNA sequentiebepaling. De voorspelde eiwit sequentie wijzigingen als gevolg van deze mutaties frameshift opgenomen en afgekapt eiwit vanwege voortijdige stop codonen.

Inleiding

Microinjection is een gemeenschappelijk laboratorium techniek gebruikt voor het leveren van een kleine hoeveelheid van een stof zoals DNA, RNA, eiwitten en andere macromoleculen in cellen of embryo's via een glazen capillaire¹. Microinjection wordt uitgevoerd met behulp van speciale apparatuur installatie met inbegrip van een microinjector, micromanipulator en een Microscoop². De techniek is gebruikt door onderzoekers genetisch wijzigen vele organismen door middel van de generatie van transgenics, gene uitsparingen en gentherapie, met als doel inzicht in de dynamiek van intracellulaire componenten³

Protocol

Dit experiment werd uitgevoerd op de vis Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Auburn University, AL. Alle experimentele protocollen die worden gebruikt in dit experiment werden goedgekeurd door de Auburn University institutionele Animal Care en gebruik Comité (AU-IACUC), voordat het experiment werd gestart. Een lijst van de apparatuur en benodigdheden gebruikt in dit experiment kan worden gevonden in de tabel van de materialen. De volgende zijn de stappen en procedures voor de voorbereiding en microinjection van kanaal meerval one-cel embryo's zoals geïllustreerd in Figuur 1.

1. broeden ....

Resultaten

Om aan te tonen van de efficiëntie van het protocol van microinjection, werden ontworpen om te richten van de channel catfish tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM1) gen en rhamnose bindend lectine (RBL) gen gRNAs microinjected.

TICAM 1
DNA sequencing van vectoren uit afzonderlijke kolonies van samengevoegd, gekloonde PCR producten bleek de indel mutaties, geïnduceerde in TICAM.......

Discussie

Een gedetailleerd protocol voor microinjection van channel catfish embryo's te bereiken van gen knock-out werd gepresenteerd. Injectie van CRISPR/Cas9 eiwitten in de dooier is veel eenvoudiger, bespaart u tijd en vereist geen uitgebreide opleiding in vergelijking met de microinjecting van de blastodiscus van het embryo één-cel, die de gemeenschappelijke techniek voor de meeste genenoverdracht en gene bewerken met vis ^{30 , 42}. het huidige protocol bewezen succesvo.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reproboost implant	Center of Marine Biotechnology		Luteïniserend hormoon afgifte hormoon analoog (LHRHa) voor het induceren van ovulatie bij vrouwelijke kanaalkatvis
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		Voor sedatie van broedvis tijdens hormooninjectie en eitjes verwijderen.
Fenol rood	Sigma-Aldrich	P0290	0,5%, steriel gefilterd
Stereomicroscoop	Olympus	213709	Voor het visualiseren van de eieren tijdens micro-injectie
Microinjector	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MPPI-3	Voor het aanbrengen van de injectiemateriaal in de embryo's
Micromanipulator	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MM33	Voor het vasthouden en controleren van de beweging van de injectienaald.
Eppendorf Microloader	Eppendorf	5242956.003	Voor het laden van injectieoplossing in micro-injectienaalden.
Verticale naaldtrekker	David Kopf Instruments	Model 720	Voor het trekken van micro-injectienaalden
Cas9-eiwit	PNA Bio Inc.	CP01	Recombinant Cas9-eiwit uit Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR Systeem	Roche Diagnostics, USA		Voor PCR en amplificatie van DNA-sjablonen die gebruikt worden in gRNA-voorbereiding
Borosilicaat glas capillairen	Fisher Scientific		1 mm buitendiameter (OD), voor het maken van micro-injectienaalden.
Petrischaal	VWR	25384-302	Voor het vasthouden van de embryo's tijdens de micro-injectie.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Plantaardige bakboter voor het coaten van kuiltjes en petrischalen.
Holtfreter`s oplossing	Zelf gemaakt		59 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 0,76 mM CaCl2, 1,67 mM MgSO4 om de gemicro-injecteerde embryo's te incuberen tot het uitkomen.
Doxycyclinehyclaat USP (monohydraat)	Letco Medical	690904	Antibioticum toegevoegd aan Holtfreter's oplossing tot 10 ppm om bacteriële infecties te voorkomen.