Methodenartikel

Bouw en evaluatie van een lymfkliertest Calvarial osteolyse Model door blootstelling aan CoCrMo deeltjes in aseptische losraken

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56276

⸱

17 februari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een model lymfkliertest calvarial osteolyse door blootstelling aan CoCrMo deeltjes, die een ideale diermodel vormt voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes van slijtage en verschillende cellen in aseptische losraken.

Samenvatting

Slijtage deeltje-geïnduceerde osteolyse is een belangrijke oorzaak van aseptische losraken artroplastiek mislukking, maar het onderliggende mechanisme is onduidelijk. Als gevolg van lange follow-up nodig voor de detectie en sporadisch voorkomen, is het uitdagend om te beoordelen van de pathogenese ofparticle-geïnduceerde osteolyse in klinische gevallen. Vandaar, optimale dierlijke modellen zijn vereist voor verdere studies. De lymfkliertest model van calvarial osteolyse opgericht door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een effectieve en geldig instrument voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes en verschillende cellen in aseptische losraken. In dit model, werden CoCrMo deeltjes eerst verkregen door hoog-vacuüm drie-elektrode gelijkstroom en geresuspendeerde in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing met een concentratie van 50 mg/mL. Vervolgens werd 50 µL van de resulterende schorsing toegepast op het midden van de lymfkliertest snuituil na scheiding van de craniale beenvlies door scherpe dissectie. Na twee weken, de muizen werden opgeofferd en snuituil exemplaren zijn geoogst; kwalitatieve en kwantitatieve evaluaties werden uitgevoerd door de haematoxyline en eosine-kleuring en micro computertomografie. De sterke punten van dit model zijn eenvoud van de procedure, kwantitatieve evaluatie van botverlies, snelheid van osteolyse ontwikkeling, potentiële gebruik transgene of knock-out modellen, en een relatief lage prijs. Dit model kan echter niet worden gebruikt om te beoordelen van de mechanische kracht en chronische effecten van deeltjes in de aseptische losraken. Lymfkliertest calvarial osteolyse model gegenereerd door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een ideaal hulpmiddel voor de beoordeling van de interacties tussen slijtage deeltjes en verschillende cellen, bijvoorbeeld, macrofagen, fibroblasten, botcellen en osteoclasten, in aseptische losraken.

Inleiding

Aseptische losmaken is de meest voorkomende oorzaak van totale heup artroplastiek (THA) en totale knie-artroplastiek (TKA) falen, waarvoor herziening chirurgie1. Het onderliggende mechanisme blijft echter onduidelijk2. Een lange follow-up is nodig voor de detectie van deeltje-geïnduceerde osteolyse, wiens optreden zeldzaam is; dus is het uitdagend om te verkennen zijn pathogenese in klinische gevallen. Vandaar, verdere studies gericht op complexe cellulaire en weefsel mechanismen vereisen dat zowel in vivo experimenten in deeltje-geïnduceerde osteolyse modellen en in vitro tests in cellen gerelateerde tot bone homeostase3dragen. Een geldige diermodel is belangrijk in de gevolgen van slijtage deeltjes voor botverlies, bewijze voor het verder cellulaire assays onthullen.

Een lymfkliertest calvarial osteolyse model gebouwd door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een doeltreffende en geldige methode voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes en verschillende cellen in aseptische losraken. In dit model veroorzaken CoCrMo deeltjes calvarial osteolyse door inducerende ontsteking cytokinen in macrofagen, activeren osteoclasten osteoblast proliferatie remmen en bevordering van osteoblast apoptosis.

Het duurt slechts twee weken om dit model. Osteolyse kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd door de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring en micro berekend tomografie (micro-CT)2. Bovendien, heeft dit model een relatief lage kosten, en transgene en knockoutstadia muis modellen kunnen worden gebruikt om een groot aantal verbindingen op verschillende doses3scherm.

De procedure voor het vaststellen en evalueren van dit model is eenvoudig. Eerst werden CoCrMo deeltjes verkregen door hoog-vacuüm drie-elektrode gelijkstroom en geresuspendeerde in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een concentratie van 50 mg/mL. Vervolgens werd 50 µL van de resulterende schorsing toegepast op het midden van de lymfkliertest snuituil na scheiding van de craniale beenvlies door scherpe dissectie. De muizen werden opgeofferd na twee weken, en snuituil monsters zijn geoogst; kwalitatieve en kwantitatieve analyses werden uitgevoerd door H & E kleuring van andmicro-CT.

Een lymfkliertest calvarial osteolyse model gebouwd door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een ideaal hulpmiddel voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes CoCrMo en verschillende cellen, zoals macrofagen, fibroblasten en botcellen osteoclasten, in aseptische losraken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Nanjing universiteit.

1. CoCrMo Particle voorbereiding

  1. Opvragen CoCrMo deeltjes met behulp van een kunstmatig hoog-vacuüm drie-elektrode gelijkstroom-4. Plaats CoCrMo legering in het instrument onder 10-3 Pa vacuüm, 0,04 MPa argon en waterstof 3:2 (v/v), en 650 A kathode huidige.
  2. Meet de diameter van de CoCrMo deeltjes.
    1. 1 mg CoCrMo deeltjes in 1,5 mL watervrij ethanol toevoegen.
    2. Resuspendeer CoCrMo deeltjes in watervrij ethanol door ultrasone schudden bij 28 kHz en 600 W gedurende 5 minuten.
    3. Een druppel (ongeveer 20 µL) van de toepassing van de resulterende schorsing voor de objectieve tabel van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Serie TEM foto's bij 200 kV versnelling spanning en 0,24 nm resolutie vastleggen.
    4. De meegeleverde software gebruiken voor het berekenen van de gemiddelde diameter en deeltje grootteverdeling in TEM microfoto.
  3. Decontaminatie van endotoxines
    1. Autoclaaf 50 g van deeltjes gedurende 15 minuten staan bij 121 ° C en 15 psi.
    2. Detecteren van endotoxines door een kwantitatieve Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay (< 0,25% EU/mL werd geacht om aan te geven van endotoxinen afwezigheid)5.
  4. Resuspendeer de deeltjes in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een concentratie van 50 mg/mL stockoplossing6.

2. bouw van het Model Calvarial osteolyse

  1. Anesthetize 6 weken oude C57BL/J6 muizen (zes muizen per groep) withpentobarbital (50 mg/kg). Gebruik de snuifje-test om te beoordelen van het niveau van de verdoving. Voorkomen van ogen met normale zout drogen.
  2. Muizen in de vatbaar positie plaatsen. Verwijder de vacht op de schedel met een scheerapparaat en desinfecteren van de huid met behulp van medische katoenen ballen met 75% ethanol.
  3. Voor de lokalisatie van de punt, twee punten, waaronder de middelpunten tussen de twee ogen en oren, respectievelijk te identificeren. Vervolgens bepalen de lijn tussen de twee bovenstaande punten, en de huid langs de bovenstaande regel incise met een schaar (figuur 1A).
  4. Verwijder de craniale beenvlies uit de snuituil met een scalpel (figuur 1B)6.
  5. Sutuur (geologie) huid aan beide uiteinden voorzien van eenvoudige onderbroken hechtdraad.
  6. Maak een hechtdraad lijn door het midden van de incisie zonder knopen. Houd de twee uiteinden van de hechtdraad lijn.
  7. Insluiten 50 µL van het CoCrMo deeltje schorsing (50 mg/mL, in PBS) in het midden van de calvarias (Figuur 1 c)2.
  8. Knoop de laatste steek binnen eenvoudig onderbroken hechtdraad (Figuur 1 d).
  9. Muizen gedurende nog eens 2 weken.

3. evaluatie van Calvarial osteolyse Model door het scannen van Micro-CT

  1. De muizen met kooldioxide te offeren. Decapitate de muizen in het horizontale vlak. Verwijder het hersenweefsel binnen en de huid en vacht buiten. Oogst van de calvarias voor verdere experimenten.
  2. Zachtjes opruimen al het zachte weefsel op de snuituil met een pincet. De calvarias in PBS 24 h vóór micro-CT scan de gewiste calvarias in 4% paraformaldehyde op 4 ° C voor 24 h. Immerse vaststellen.
  3. Analyseren van de muizen-calvarias met hoge resolutie micro-CT bij een isometrische resolutie van 18 µm en X-ray energie instellingen van 45 kV en 550 mA.
  4. Het gedrag van drie-dimensionale reconstructie van micro-CT data met de software.
  5. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse.
    1. Selecteer eerst de vierkante streek rond de middellijn hechtdraad als de regio van belang.
    2. Ten tweede, het meten van de botmineraaldichtheid (BMD), bone volume/totaal volume (BV/TV), trabecular nummer (Tb.N), trabecular dikte (Tb.Th), trabecular scheiding/afstand (Tb.Sp) en percentage van totale porositeit met de meegeleverde software voor micro-CT.
    3. Ten derde, vergelijk de drie groepen voor verschillende metingen door one-way ANOVA. Toepassing voor post-hoc analyse van variantie, Bonferroni methode2.

4. evaluatie van Calvarial osteolyse Model door H & E kleuring

  1. Decalcify snuituil monsters in 15% Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (NA2EDTA)-PBS bij 4 ° C. Veranderen de ontkalking oplossing elke dag voor 3 weken.
  2. De ontkalkte monsters inbedden in paraffine voor een 2 x 1 cm x 1 cm kubus en snijd ze in 2 µm secties op het gebied van deeltjes depositie.
  3. Vlekken van de secties met haematoxyline en eosine7zoals hiervoor is beschreven.
  4. De lichte microscopie van microfoto van de algehele pathomorphism vastleggen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De in-house geproduceerde nanoschaal CoCrMo deeltjes werden ongeveer 50 nm (3.56 standaardfout) in diameter, zoals gekwantificeerd door TEM (Figuur 2). Na Gasbedwelming met behulp van de muis calvarias CoCrMo deeltjes, de dieren (n = 6 per groep) twee weken voor een ander werden gehandhaafd. Binnen de twee weken, de calvarial incisie volledig genezen was, en de hechtdraad kan vallen. Een lokale infectie of nonunion mei bot verlies beoordeling beïnvloeden. Na ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn twee belangrijkste methoden voor slijtage deeltje-geïnduceerde osteolyse in muizen: de lucht-etui-model en het model van calvarial osteolyse. Het model van de lucht-zakje, is een subcutaan gegenereerde lucht-etui eerst gevestigd, gevolgd door slijtage deeltje invoering en implantatie in het bot weefsel8. De muur zakje bootst het beenvlies in aseptische losraken. Bot-implantatie is echter nonvascular met geen biologische activiteit, waardoor het moeilijk te beoordelen van directe interactie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de nationale Natural Science Foundation van China (81572111), de Clinical Science en technologie Project Stichting van de oostelijke provincie Jiangsu (BL2012002), de wetenschappelijke onderzoek Project van Nanjing (201402007), de natuurwetenschappen Stichting van de provincie Jiangsu (BK20161385), en de speciale stichting van Chinese medische arts Association (2015COS0810).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CoCrMo legering van protheseWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IIGrondstof om CoCrMo nanodeeltjes te verkrijgen
Gemaakte hoogvacuüm drie-elektrode gelijkstroomCollege of Materials Science & Engineering, Nanjing University of TechnologyZelf ontworpen machine
6 weken oude mannelijke C57BL/6J muizenModel animal research center van Nanjing UniversityN000013
100% EthanolNanjing ReagentC0691514023Solvent van CoCrMo nanodeeltjes voor transmissie-elektronenmicroscoop scanning
1.5 ml Microcentrifuge buisjesTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW603
Microanalytische balansShenzhen Qun long Instrument Equipment Co., LTDEX125DZH
Ultrasone shakerShanghai Yuhao scientific instrument co., LTDYH-200DHOm CoCrMo nanodeeltjes te suspenderen
Transmissie-elektronenmicroscoopFEITecnai G20
SimplePCI softwareCompix Inc.6.6 versieOm de gemiddelde diameter en deeltjesgrootteverdeling te berekenen.
Hoge sterilisatiepanQIULONGYIQIKYQL-100DSOm endotoxine te decontamineren
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) AssayCharles RiverR13025Om endotoxine te detecteren 
15 ml Microcentrifuge buisjesTaizhou Suyi MedicalB122
Fosfaat-buffered salineBoster Biological TechnologyAR0030Solvent van CoCrMo nanodeeltjes stockoplossing
Pentobarbital NatriumSigmaP3761Om muizen te verdoven
Normale zoutoplossingSACKLERSR8572EP-15Om uitdroging van muizenogen te voorkomen
75% EthanolNanjing ReagentC0691560275Desinfectie
Medische katoenen balShuitao1278298933Desinfectie
ShaverKemeiKM-3018Om de vacht te scheren
SchaarRWD LIFE SCIENCES12005-10Om de huid in te snijden
HechtdraadRWD LIFE SCIENCEF34001-01Om de huid te hechten
NaaldhouderRWD LIFE SCIENCEF33001-01Om de huid te hechten
NaaldRWD LIFE SCIENCER14003-12Om de huid te hechten
Vessel forcepsRWD LIFE SCIENCEF22003-09Om de huid te hechten
ScalpelRWD LIFE SCIENCES31010-01Om de calvaria te verzamelen
PincetRWD LIFE SCIENCEF12006-10Om de calvaria te verzamelen
100 µL pipettenEppendorf3120000240Om deeltjessuspensie in de calvatias in te bedden
100 µL pipette tipsAXYGENT-200-YOm deeltjessuspensie in de calvatias in te bedden
5 ml MicrotubesTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4% ParaformaldehydeServicebioG1101Fixatie
Micro Computed Tomography SkyScanSkyScan1176
Ethyleen Diamine Tetraacetic AcidServicebioG1105Decalcificatie
ParaffinServicebio#0001
Paraffine slijpmachineLeicaRM2125RTS
Glazen diaServicebioG6004
DekglasServicebio200
HE-kleuring kitServicebio#1-5HE-kleuring
LichtmicroscoopNikonE200

Referenties

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MuismodelMicro CT analyseH E kleuringpartikelsuspensiecraniaal periosteumbotmineraaldichtheidTEM beeldvorming

Gerelateerde artikelen