Beschrijven we een techniek voor het combineren van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing te identificeren laat replicerende regio's van het genoom.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vele technieken zijn ontwikkeld om de voortgang van DNA replicatie via de S-fase van de celcyclus. De meeste van deze technieken hebben gericht geweest op opheldering van de locatie en het tijdstip van de inleiding van het genoom dubbel in plaats van de voltooiing ervan. Het is echter van essentieel belang dat wij regio's van het genoom die laatste volledig repliceren begrijpen, omdat deze gebieden kampen met verhoogde niveaus van chromosomale breuk en mutatie, en ze geassocieerd met zowel ziekte en veroudering zijn. Hier beschrijven we hoe we een techniek die is gebruikt voor het controleren van replicatie inleiding om te identificeren die regio's van het genoom in plaats daarvan laatste volledige replicatie hebben uitgebreid. Deze aanpak is gebaseerd op een combinatie van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing. Hoewel dit verslag concentreert zich op de toepassing van deze techniek op gist, kan de aanpak worden gebruikt met alle cellen die kunnen worden gesorteerd in een stroom cytometer volgens DNA-inhoud.
Inleiding
Eukaryotische genoom replicatie wordt gestart op meerdere afzonderlijke locaties, oorsprong van replicatie, van welke replicatie vorken gaan in beide richtingen (herzien in Fragkos et al., 20151) genoemd. Oorsprong variëren in zowel hun timing en de efficiëntie van vuren, en verscheidene technieken zijn ontwikkeld om te controleren van de replicatie oorsprong activiteit en het ophelderen van de oorzaken van deze variatie. De activiteit van individuele oorsprong kan worden afgeleid uit de niveaus van single-stranded DNA2, welke vormen rond de oorsprong van het actief, of met behulp van 2D gelelektroforese volgen specifieke replicatie tussenproducten3, die beide kunnen worden opgespoord met radioactieve sondes. Beide technieken zijn gemakkelijker toegepast in S. cerevisiae dan bij zoogdiercellen omdat oorsprong beperkt tot specifieke bekende opeenvolgingen in de voormalige zijn. Met de komst van microarrays werd het mogelijk om te beoordelen van oorsprong afvuren wereldwijd. Eerst gebeurde dit door het labelen van DNA met zware isotopen, cellen van een blok van de G1 vrijgeven in medium met lichte isotopen en vervolgens toezicht op de vorming van zware-licht hybride DNA in het genoom4. De invoering van hoge-doorvoer sequencing toegestaan soortgelijke genoom-brede monitoring van oorsprong activiteit zonder de eis van dure isotopische labeling. Cellen werden gesorteerd in een stroom cytometer volgens DNA inhoud en hun DNA onderworpen aan diepe sequencing. Omdat de sequentie dekking opbrengst van 1 x tot 2 x in de loop van de S-fase, kan replicatie van de relatieve timing worden beoordeeld door vergelijking van Lees diepten van cellen in de S-fase aan die van de G1 of G25,6. Deze technieken, met name toegepast op gist, geleid tot een dieper begrip van hoe opeenvolging van DNA, chromatine structuur en DNA replicatie eiwitten oorsprong timing en efficiëntie reguleren.
Trouwe transmissie van genetische informatie tijdens cellulaire proliferatie vereist niet alleen succesvol inleiding van DNA-replicatie, die plaatsvindt op de oorsprong, maar ook de succesvolle voltooiing van de replicatie, die optreedt waar de replicatie vorken ontmoeten. Als inleiding van replicatie verschilt het tijdstip van voltooiing van de replicatie het genoom met bepaalde regio's resterende niet-gerepliceerde zelfs laat in de celcyclus. Dergelijke regio's mogelijk met name ver van actieve replicatie oorsprong of sequenties of chromatine structuren die de polymerase van DNA belemmeren kunnen bevatten. Laat het repliceren van regio's kan manifesteren zich als kwetsbare sites, die worden geassocieerd met een chromosomale breuk en een hogere mutatie, en zijn betrokken bij kanker en veroudering7,8,9. Ondanks het belang van goede voltooiing van DNA-replicatie voor handhaving van de stabiliteit van het genoom, heeft ons begrip van waar en hoe dit gebeurt echter bleef ver achter dat van replicatie inleiding. En terwijl afzonderlijke genen waarvan laat replicatie geassocieerd met de ziekte is zijn bestudeerd met, bijvoorbeeld, qPCR10, global studies gericht op het ophelderen van de locaties en de onderliggende oorzaken van een te late replicatie hebben ontbroken. Hier beschrijven we een techniek die we verwijzen naar het als "G2 seq" waarin we stroom cytometry combineren met hoge doorvoersnelheid sequencing licht te werpen op de voltooiing van de replicatie van het genoom in gist11. Met kleine wijzigingen, kan dit protocol worden aangepast aan alle cellen die stroom-gesorteerd op basis van DNA-inhoud worden kunnen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van cellen voor stroom Cytometry sorteren
- Inoculeer 15 mL reageerbuisjes met elk 8 mL YEPD Bouillon zodanig dat de culturen een dichtheid van 5 x 10,6 tot en met 1.5 x 107 cellen per mL na overnachting groei bereiken (zie discussie opmerking 1).
- Spin down gistcellen (1.400 x g, op kamertemperatuur of 4 ° C) in een centrifugebuis van 15 mL schroefdop voor 5 min, resuspendeer de cellen in 1,5 mL 70% ethanol, en overdracht aan een 1.6 mL microfuge buis, deze zitten voor 1 uur bij kamertemperatuur of ten minste 3 uur op ijs (verhuur kan worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij 4 ° C) (zie punt van discussie (2)).
- Spin down gistcellen in de microfuge (14.000 x g, 4 ° C) voor 1 min resuspendeer in 1 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 7,2, spin down (14.000 x g, 4 ° C) voor 1 min, gecombineerd supernatant, resuspendeer in 1 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 7,2 , met 0,25 mg/mL RNAse oplossing gedurende 1 uur bij 50 ° C, of 's nachts bij 37 ° C in de warmte blok of water bad.
- Voeg 50 µL proteïnase K oplossing (20 mg/mL geresuspendeerde in 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% gewicht aan volume glycerol) en incubeer gedurende 1 uur bij 50 ° C.
- Spin down cellen (14.000 x g, 4 ° C) resuspendeer de cellen in 1 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 7,2, spin down (14.000 x g, 4 ° C), gecombineerd met vacuüm supernatant, resuspendeer in 1 mL 1 µM groene nucleïnezuur stam geresuspendeerde in 50 mM Natriumcitraat , pH 7,2 en broeden in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, bewerk ultrasone trillingen ten 2 x voor 2 s elke (uitgangsvermogen 2 watt).
2. de cel sorteren
- Met behulp van een cel sorter, sorteren cellen volgens DNA inhoud in fasen G1, S, "vroege G2" en "late G2", het verzamelen van ten minste 1,6 miljoen haploïde cellen van elke fase van de celcyclus zoals in Figuur 1 (zie punt van discussie (3)).
- Cellen overbrengen microfuge buizen en spin down cellen gedurende 20 minuten bij 14.000 x g bij 4 ° C in de microfuge gecombineerd supernatant met vacuüm (de pellet kan worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C voor onbepaalde tijd; Zie discussie punt (4)).
3. DNA-extractie en de voorbereiding van de Sequencing van bibliotheken
Opmerking: De volgende stappen zijn gebaseerd op "protocol I" in de gist Genomic DNA-extractie Kit (Zie Tabel van materialen).
- Voeg 120 µL van "Spijsvertering Buffer," een eigen buffer waarmee de lytische enzym gist te verteren de celwand en 5 µL van gist lytische enzym, resuspendeer door vortexing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 40-60 minuten.
- Voeg 120 µL van "Lysis-buffermengsel," een eigen buffer die wasmiddel, en vortex hard voor 10-20 s bevat.
- Voeg toe 250 µL chloroform - Meng voor 1 min.
- Draaien op maximale snelheid in een microfuge gedurende 2 minuten.
- Het laden van het supernatant op de DNA-bindende kolom en centrifuge op maximale snelheid in een microfuge voor 1 min.
- Voeg 300 µL van "DNA wassen Buffer," een eigen buffer dat ethanol en centrifuge voor 1 min op maximale snelheid in een microfuge bevat. Negeren van de stroom door, voeg 300 µL van DNA was Buffer, en herhaal het proces van wassen.
- De spin kolom overbrengen in een verse microfuge buis, voeg 60 µL van water (niet TE) - 1-3 min wachten en vervolgens Centrifugeer gedurende 10 s tot elueer de DNA.
- Meten van de concentratie door 5 µL van DNA toe te voegen aan 195 µL van dsDNA hoge gevoeligheid reagens dat al verdunde 1:200 in dsDNA hoge gevoeligheid buffer en vervolgens maatregel fluorescentie in een Fluorimeter, met 10 µL van meegeleverde normen voor kalibratie; tussen 10 en 50 ng van DNA totale opbrengst verwachten.
- Bewerk ultrasone trillingen ten (piek Incident Power 450, plicht Factor 30%, cycli per barsten 200, behandeling tijd 60 s, waterniveau 6) te breken van DNA in 250-350 bp fragmenten.
- Bereiden van een bibliotheek met behulp van DNA monster voorbereiding kit en het volgnummer van het (minstens 10 miljoen 50 bp single-end leest) op het DNA sequencing instrument in de snelle modus (zienoot discussie (5)).
4. analyse van het rangschikken van gegevens en generatie van replicatie profielen
- Uitlijnen van sequenties aan Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genoom met behulp van Gsnap12 (zienoot discussie (6)).
- Vaststellen per-basenpaar Lees diepten met behulp van Bedtools' "genomeCoverageBed" software13.
- Verwijderen van artefactual spikes in Lees diepten, indien aanwezig (zienoot discussie (7)).
- Vloeiend lezen diepten door chromosoom medianen met een 20 kb glijden venster met "runMean"-functie in R pakket "caTools" (zienoot discussie (8)).
- Perceel Lees diepten in de S-fase, vroege G2 en laat G2 als een percentage van volledig gerepliceerde Lees diepten (zienoot discussie (9)).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We hebben de procedure die hierboven beschreven te identificeren laat replicerende sites in ontluikende gist gebruikt. Deze aanpak met behulp van een bekende laat replicerende regio op een kunstmatig chromosoom testen bleek de techniek nauwkeurig en betrouwbaar. Onze resultaten ook gebleken dat het biologische belang van tijdige afronding van replicatie door aan te tonen dat een late replicerende regio op chromosoom 7, die we geïdentificeerd als laat repliceren op basis van de resultaten ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel deze techniek robuust is en relatief ongecompliceerd, bijzondere aandacht moet worden besteed aan het volgende:
(1) Wij raden dat culturen gedurende ten minste 12 uur groeien voordat ze log fase, bereiken aangezien de verschillen manifesteren in celcyclus distributies als culturen worden geoogst na het bereiken van de gewenste dichtheid slechts 4 h na inoculatie. Onze veronderstelling is dat een celcyclus distributie die een relatief stabiel evenwicht heeft bereikt beter een "echte" log...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door subsidie NIH GM117446 A.B.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM natriumcitraat, pH 7.2 |
| 50 mM natriumcitraat, pH 7.2 | |||
| RNase oplossing (0,25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0,25 mg / mL RNaseA gesuspendeerd in 50 mM natriumcitraat, pH 7.2, kook RNase oplossing voor de eerste keer 10 minuten en bewaar daarna bij -20° |
| proteinase K oplossing (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, bewaar bij -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III kolommen | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap uitlijnsoftware | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
Referenties
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
