G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Summary

Beschrijven we een techniek voor het combineren van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing te identificeren laat replicerende regio's van het genoom.

Abstract

Vele technieken zijn ontwikkeld om de voortgang van DNA replicatie via de S-fase van de celcyclus. De meeste van deze technieken hebben gericht geweest op opheldering van de locatie en het tijdstip van de inleiding van het genoom dubbel in plaats van de voltooiing ervan. Het is echter van essentieel belang dat wij regio's van het genoom die laatste volledig repliceren begrijpen, omdat deze gebieden kampen met verhoogde niveaus van chromosomale breuk en mutatie, en ze geassocieerd met zowel ziekte en veroudering zijn. Hier beschrijven we hoe we een techniek die is gebruikt voor het controleren van replicatie inleiding om te identificeren die regio's van het genoom in plaats daarvan laatste volledige replicatie hebben uitgebreid. Deze aanpak is gebaseerd op een combinatie van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing. Hoewel dit verslag concentreert zich op de toepassing van deze techniek op gist, kan de aanpak worden gebruikt met alle cellen die kunnen worden gesorteerd in een stroom cytometer volgens DNA-inhoud.

Introduction

Eukaryotische genoom replicatie wordt gestart op meerdere afzonderlijke locaties, oorsprong van replicatie, van welke replicatie vorken gaan in beide richtingen (herzien in Fragkos et al., 2015¹) genoemd. Oorsprong variëren in zowel hun timing en de efficiëntie van vuren, en verscheidene technieken zijn ontwikkeld om te controleren van de replicatie oorsprong activiteit en het ophelderen van de oorzaken van deze variatie. De activiteit van individuele oorsprong kan worden afgeleid uit de niveaus van single-stranded DNA², welke vormen rond de oorsprong van het actief, of met behulp van 2D gelelektroforese volgen ....

Protocol

1. bereiding van cellen voor stroom Cytometry sorteren

1. Inoculeer 15 mL reageerbuisjes met elk 8 mL YEPD Bouillon zodanig dat de culturen een dichtheid van 5 x 10,⁶ tot en met 1.5 x 10⁷ cellen per mL na overnachting groei bereiken (zie discussie opmerking 1).
2. Spin down gistcellen (1.400 x g, op kamertemperatuur of 4 ° C) in een centrifugebuis van 15 mL schroefdop voor 5 min, resuspendeer de cellen in 1,5 mL 70% ethanol, en overdracht aan een 1.6 mL microfuge buis, deze zitten voor 1 uur bij kamertemperatuur of ten minste 3 uur op ijs (verhuur kan worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij 4 ° C) (zie punt van discussie (2)).

Results

We hebben de procedure die hierboven beschreven te identificeren laat replicerende sites in ontluikende gist gebruikt. Deze aanpak met behulp van een bekende laat replicerende regio op een kunstmatig chromosoom testen bleek de techniek nauwkeurig en betrouwbaar. Onze resultaten ook gebleken dat het biologische belang van tijdige afronding van replicatie door aan te tonen dat een late replicerende regio op chromosoom 7, die we geïdentificeerd als laat repliceren op basis van de resultaten .......

Discussion

Hoewel deze techniek robuust is en relatief ongecompliceerd, bijzondere aandacht moet worden besteed aan het volgende:

(1) Wij raden dat culturen gedurende ten minste 12 uur groeien voordat ze log fase, bereiken aangezien de verschillen manifesteren in celcyclus distributies als culturen worden geoogst na het bereiken van de gewenste dichtheid slechts 4 h na inoculatie. Onze veronderstelling is dat een celcyclus distributie die een relatief stabiel evenwicht heeft bereikt beter een "echte" log.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
YeaStar Genomic DNA kit	Genesee Scientific	11-323
1 µM SYTOX Green	ThermoFisher	57020	resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2
50 mM sodium citrate, pH 7.2
RNase solution (0.25 mg / mL)	Sigma	R6513	0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20°
proteinase K solution (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C
Model 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III columns	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q33216
Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 instrument	Illumina	SY–401–2501
gsnap alignment software	open source software / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap