Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

17.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56301

⸱

22 november 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

Mitophagy, het proces van clearing beschadigd de mitochondriën, is noodzakelijk voor mitochondriale homeostase en gezondheid onderhoud. Dit artikel presenteert een aantal van de meest recente mitophagy detectiemethoden in menselijke cellen, Caenorhabditis elegansen muizen.

Samenvatting

Mitochondriën zijn de krachtpatsers van cellen en cellulaire energie in de vorm van ATP produceren. Mitochondriale dysfunctie bijdraagt aan biologische veroudering en een breed scala aan aandoeningen waaronder neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD), metabole ziekten en voortijdige veroudering syndromen. Onderhoud van mitochondriale gezondheid hangt af van mitochondriale biogenese en de efficiënte goedkeuring van disfunctionele mitochondria via mitophagy. Experimentele methoden te nauwkeurig detecteren autophagy/mitophagy, met name in diermodellen, hebben zijn uitdagend om te ontwikkelen. Recente vooruitgang op weg naar het begrip van de moleculaire mechanismen van mitophagy heeft de ontwikkeling van nieuwe mitophagy detectietechnieken ingeschakeld. Hier introduceren we verschillende veelzijdige technieken voor het controleren van mitophagy in menselijke cellen, Caenorhabditis elegans (bijvoorbeeldRosella en DCT-1 / LGG-1 stammen), en muizen (mt-Keima). Een combinatie van deze mitophagy detectietechnieken, met inbegrip van cross-soorten evaluatie, zal de nauwkeurigheid van de metingen van de mitophagy verbeteren en leiden tot een beter begrip van de rol van mitophagy bij gezondheid en ziekte.

Inleiding

Mitophagy is essentieel voor mitochondriale onderhoud. Mitochondriën kruisen meerdere cel signalering van trajecten en zijn universele sub cellulaire organellen die verantwoordelijk zijn voor cellulaire energieproductie, celstofwisseling en calcium homeostase1,2,3, 4. mitochondria voortdurend ervaring uitdagingen van endogene en exogene bronnen, zoals reactieve zuurstof soorten (ROS) en toxische stoffen in het mitochondriale, respectievelijk, die leiden tot de generatie van "leeftijd" en disfunctionele mitochondriën. Accumulatie van beschadigde mitochondriën verlaagt de efficiëntie van de ATP productie terwijl het verhogen van de hoeveelheid schadelijke ROS, en is gekoppeld aan de leeftijd gerelateerde ziekten zoals metabole ziekten, AD, en PD1,5,6 . Om te voorkomen dat mitochondriën geïnduceerde cellulaire dysfunctie, cellen moeten specifiek herkennen beschadigd mitochondriën en efficiënt verwijderen hen via een cellulaire proces genoemd mitochondriale autophagy (mitophagy). Dit toonde het belang aan van mitophagy in gezondheid en ziekte illustreert de behoefte aan nauwkeurige en efficiënte methoden voor het detecteren van mitophagy zowel in vitro als in vivo.

Mitophagy is een proces van meerdere stappen waarbij veel eiwitten en eiwit complexen5,7,8. Kortom, wordt een beschadigde mitochondrion eerst herkend en opgeslokt door een dubbel-membraned phagophore, die afkomstig van het plasmamembraan, endoplasmatisch reticulum, Golgi-complex, nucleus of mitochondrion zelf9,10 zijn kan. De sferische phagophore kieuwopeningenvorm en uiteindelijk zeehonden de mitochondriën binnen, vormen de mitochondriale autophagosome (mitophagosome). De mitophagosome combineert vervolgens met het lysosoom voor afbraak, vorming van een autolysosome waarin de beschadigde mitochondrion aangetast en gerecycleerde7,8 is. Grote autophagic eiwitten ook betrokken bij mitophagy omvatten: Autophagy verwante 7 (ATG7) en Beclin1 (initiatie), Microtubule-Associated eiwit 1A/1B-Light ketting 3 (LC3-II) (LGG-1 in C. elegans) en p62 (onderdelen van phagophore), en Lysosomale-geassocieerde membraan glycoproteïne 2 (LAMP2)6,7. Daarnaast zijn er verschillende essentiële eiwitten uniek voor mitophagy, met inbegrip van PTEN-geïnduceerde putatief Kinase 1 (roze-1), Parkin1, nucleaire Dot eiwit 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 interactie eiwit 3 zoals (NIX/BNIP3L) (DCT-1 in C. elegans), o.a.5,6,11.

Een gemeenschappelijke methode voor de opsporing van wijzigingen in niveaus van autophagy is door de verhouding tussen LC3-II/LC3-I of LC3-II/actine. Deze methode is echter niet-specifieke, zoals een toename van deze verhouding kan een verhoogde initiatie of een bijzondere waardevermindering heeft ondergaan samensmelting van mitophagosome en lysosoom12weerspiegelen. Een andere methode is het evalueren van de colocalization tussen een autophagy marker (bijvoorbeeldLC3) en een mitochondriale eiwit (bijvoorbeeldTranslocase van buitenste mitochondriale membraan 20 (TOMM20, die kan worden afgebroken door Proteasomen)). Echter, dit kan alleen veranderingen in de totale mitophagy aangeven en kan geen onderscheid maken de stappen welke blokkade optreedt. Dit kan worden verduidelijkt met behulp van lysosomale remmers (bijvoorbeeld, E64d + Pepstatin A, zogenaamde EP) parallel aan de accumulatie van mitophagosomes veroorzaken. Het verschil tussen het aantal mitophagosomes op de basislijn en het aantal mitophagosomes na behandeling met EP kan duiden op mitophagy. Deze beperkingen hebben gevraagd de ontwikkeling van nieuwe mitophagy detectietechnieken. Met het oog op de toenemende relevantie van mitophagy in een breed spectrum van ziekten bij de mens presenteren wij verschillende robuuste mitophagy detectietechnieken die nuttig voor onderzoekers zijn kunnen. Wij dekken zowel in vitro als in vivo technieken en adviseren combineren meerdere technieken om te controleren of de wijzigingen van de mitophagy.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dieren (mannelijke en vrouwelijke muizen) werden geboren en getogen in een geaccrediteerde dier faciliteit, overeenkomstig en goedkeuring van het NIH Animal Care en gebruik Comité. Euthanasie methoden moeten verenigbaar zijn met alle nationale en institutionele regelgeving.

1. detectie van Mitophagy in menselijke cellen

  1. Detectie van mitophagy met behulp van mt-Keima plasmide
    Opmerking: Het Keima eiwit, gesmolten in een mitochondrium doel signaal, vereenvoudigd als mt-Keima, is nuttig voor in vivo mitophagy detectie gebleken. MT-Keima is een ratiometric pH-gevoelige fluorescerende eiwit dat groene fluorescentie (excitatie 458 nm) in basic of neutrale voorwaarden en rode fluorescentie (excitatie 561 nm) in zure omstandigheden vertoont. Gezonde mitochondriën gedijen in basic of neutrale voorwaarden (pH 7-8) en groene fluorescentie wanneer transfected met mt-Keima worden aangeduid. Als mitochondriën ondergaan van mitophagy fuse met zure lysosomen, de pH druppels naar 4.5 en mitochondriën met mt-Keima vertonen rode fluorescentie6,13,14. Nog belangrijker is, is de mt-Keima resistent tegen lysosomale proteasen, inschakelen van de evaluatie van de mitophagy over langere perioden. Het onderstaande protocol is ontworpen voor 6-Wells-platen.
    1. Dag 1: Primaire menselijke cellen (bv, fibroblasten) of vereeuwigd menselijke cellen (bv, Hela cellen of U2OS cellen) gebruiken. Zaad ongeveer 0,3-1 × 10-6 cellen/well (afhankelijk van de snelheid van de groei cel om cellen te 70% confluentie bereiken op de volgende dag) in een 6-well-plate. Handhaven van de cellen in de volledige cel kweekmedium (Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) medium aangevuld met 10% FBS, en 1% gemengde oplossing van penicilline-streptomycine), en broeden in een cel cultuur incubator bij 37 ° C (20% O2, 5% CO2 ). Voeg 1 mL volledige cel kweekmedium per putje in een 6-well-plate.
      Opmerking: Gene overexpressie/knockdown of drug behandelingen kunnen worden gedaan op deze fase6.
    2. Dag 2: Meng mt-Keima plasmide DNA6 en DNA transfectiereagens (het mengsel voor één putje van de plaat van een 6-well).
      1. Verdun 15 µL van een DNA-transfectiereagens met 150 µL van serumvrij medium volgens protocol van de fabrikant.
      2. Verdun 2-5 µg mt-Keima plasmide DNA met 150 µL van serumvrij medium.
      3. Verdunde mt-Keima plasmide toevoegen aan verdunde DNA transfectiereagens, vortex voor 10 s, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
        Opmerking: Optimalisatie van DNA transfectie omstandigheden kan het nodig zijn afhankelijk van de grootte van de plaat (Zie de fabrikanten protocollen voor details).
      4. DNA/transfectie reagens mengsel ontkleuring aan cellen toevoegen, dan schudden de platen gedurende 5-10 s zachtjes totdat de oplossing geheel is gemengd.
    3. Dag 3: Wijzig de media door vervanging van het DNA transfectie reagens-bevattende medium met verse volledige cel kweekmedium (1 mL/putje).
    4. Dag 4: Het imago van de cellen met behulp van de confocal microscopie6. Gebruik twee imaging kanalen: groene kanaal (excitatie 458 nm, emissie 570-695 nm) aan visualiseren normale mitochondriën en rode kanaal (excitatie 561 nm, emissie 570-695 nm) te visualiseren mitochondriën die mitophagy ondergaan. Willekeurig afbeeldingsgebieden 20 onder 40 x vergroting ter dekking van een totaal van 100-200 cellen in elke goed.
    5. Gegevensanalyses uitvoeren. Berekening van de "mitophagy index" (percentage van mitochondriën ondergaan mitophagy), met behulp van de software van de analyse van de afbeelding te kwantificeren van het bedrag van de fluorescentie in beide de rode en groene kanalen: de verhouding tussen rode fluorescentie te rood + groen fluorescentie, nemen en vermenigvuldig met 1006.
      Opmerking: Alternatieven voor Transfectie zijn het gebruik van mt-Keima stabiel uitgedrukt HeLa cel lijnen14. Aangezien HeLa cellen doen niet express Parkin, moet Parkin stabiel te studeren Parkin-afhankelijke mitophagy in deze cellijn worden uitgedrukt.
  2. Detectie van mitophagy met behulp van de colocalization tussen cytochroom C oxidase subeenheid II (COXII) en LAMP2
    Opmerking: COXII is een eiwitten mitochondriaal genoom-gecodeerde binnenste membraan. De 'mitophagy-index' is gelijk aan de verhouding van de COXII colocalized met LAMP2 uitgedrukt als een percentage van het totale bedrag van COXII.
    1. Zaad van HeLa cellen (of andere cellen van belang vermeld in stap 1.1.1) in een 4-well kamer dia (1-5 × 104 cellen in 1 mL volledige cel kweekmedium per putje) in een cel cultuur incubator bij 37 ° C (20% O2, 5% CO2) 's nachts.
    2. Voeg 3.0 µL van 10 mM carbonyl cyanide - 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP) en broeden in de cel cultuur incubator (stap 1.2.1) voor 3 h.
      Opmerking: Andere drugs op het gebied van mitophagy mogen worden gebruikt.
    3. Verwijderen met behulp van een precisiepipet 1 mL gestolde voedingsbodem, wassen van de cellen tweemaal met 1 mL/goed of koude (0-4 ° C) 1 x PBS. Laat de oplossing zitten voor 10-30 s voordat de volgende wasbeurt. Dan Voeg 0,5 mL 3,7% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS aan elk putje en incubeer gedurende 10 min op het ijs om op te lossen van de cellen.
      Let op: PFA is toxine. Werken in een zuurkast bij het gebruik van de PFA.
    4. Negeren van de PFA-oplossing met behulp van een precisiepipet 1 mL, wassen van de cellen tweemaal met koude 1 X PBS (1 mL/putje; laat oplossing zitten voor 10 s voordat de volgende wasbeurt), en permeabilize van de cellen met 1 mL/goed van 0,25% wasmiddel (in 1 x PBS) gedurende 10 minuten op het ijs.
    5. Gooi de permeabilizing buffer, voorzichtig wassen de cellen tweemaal met koude 1 x PBS en teruggooi (laat de oplossing zitten voor 10 s tussen de wasbeurten). Blokkeren van de cellen met 1 mL/goed voor 5% FBS in 1 x PBS overnacht bij 4 ° C. De kamers om te voorkomen dat vochtverlies te dekken.
    6. 0,5 mL per putje van een gemengde antilichaam-oplossing met COXII antilichaam (muis, 1:250 verdunning) en LAMP2 antilichaam (konijn, verdunning 1:20-1:50) in 1 x PBS met 5% FBS, en winkel op ijs bereiden voor 0,5-1 h.
    7. Neem de dia 4-well kamer uit de koude kamer en gooi de blokkerende oplossing met een pipet 1 mL. Voorzichtig wassen de cellen tweemaal met 1 mL/goed of koude 1 x PBS en teruggooi (laat de oplossing zitten voor 10 s tussen de wasbeurten), dan Voeg 0,5 mL/goed van gemengde antilichaam oplossing. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een roteerapparaat bij lage snelheid.
    8. Negeren van de eerste antilichaam oplossing met behulp van een precisiepipet 1 mL en voorzichtig wassen de cellen drie keer met 1 mL/goed of koude 1 x PBS en negeren. Laat de oplossing voor 10 zit s voordat de volgende wasbeurt. 1 mL/putje van fluorescerende secundaire antilichamen (bv, geit anti-konijn met rode fluorescente proteïne (RFP) voor LAMP2; nm golflengte 568 en geit-antimuis met groen fluorescente proteïne (GFP) voor COXII nm golflengte 488) invoegtoepassing 1:250 verdunning met 5% FBS in 1 x PBS. Bedek de dia 4-well kamer met aluminiumfolie en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een roteerapparaat bij lage snelheid.
    9. Gooi de tweede antilichaam-oplossing met een pipet 1 mL. Voorzichtig wassen de cellen zesmaal met 1 mL/goed of koude 1 x PBS. Laat de oplossing zitten voor 1 min vóór de volgende wasbeurt.
    10. Monteren van de cellen met 50 µL per putje van antifade montage medium met DAPI en voeg cover slips.
    11. Afbeelding van de cellen onder een confocal microscoop met 66 x vergroting en immersie-olie (tegel scant / mozaïeken kunnen worden gebruikt om het aantal cellen beeld door de software te verhogen). Gebruik dezelfde instellingen zoals belichtingstijd kanaal digitale winst, digitaal offset, etc. in alle imaging processen (zie software instructies voor details)15.
    12. Gebruik de software van de analyse van de colocalization kwantitatief analyseren ten minste 20 willekeurige beelden van 100 cellen15. De functie "Gesloten Bezier-" hele individuele cellen te selecteren. Vergelijken van de Pearson colocalization coëfficiënt van GFP aan RFP, gewogen of ongewogen, om te bepalen mitophagy niveaus in geanalyseerde cellen. Waarden voor horizontale en verticale crosshairs van de software van de analyse van het colocalization in de gehele analyse te handhaven. Nauwkeurig instellen deze crosshairs, bereiden van twee extra soorten cellen en labelen van een COXII en de andere LAMP2. Stel vervolgens crosshairs direct boven de verdeling van de pixel voor elk kanaal15 (Zie de instructies van de software voor meer informatie).
  3. Een hoge doorvoersnelheid imaging meting voor mitophagy screening
    Opmerking: Het uitvoeren van hoge-doorvoer schermen van mitophagy-inducerende of mitophagy-remmende stoffen uit grote samengestelde bibliotheken technisch eist. Een beeldvormende techniek gebaseerd op de colocalization van de mitochondriën met autophagosomes is een meer simplistisch, maar zeer gevoelige alternatief voor mitophagy screening van16.
    1. Dag 1: Zaad cellen (bijvoorbeeld, menselijke primaire fibroblasten op 5.000 cellen/100 mL cel voedingsbodems per putje) in een 96-wells-plaat (zie stap 1.1.1).
    2. Dag 2: De cellen vanaf de tweede dag met FCCP of andere stoffen van belang voor aangewezen incubatietijd behandelen (zie stap 1.2.2).
    3. Volg stappen 1.2.2-1.2.9 met behulp van de primaire antilichamen voor COXII (muis, 1:250 verdunning met 5% FBS in 1 x PBS) en LC3B (konijn, 1:100-1:200 met 5% verdunning FBS in 1 x PBS). U kunt ook kunnen primaire antilichamen voor COXII en LAMP2 worden gebruikt.
    4. Het imago van de cellen met behulp van een fluorescerende lezer16. Het verzamelen van beelden in willekeurig geplaatste velden en met een minimum 500 cellen per putje.
    5. Analyseren van gegevens met behulp van een cel analyzer aangepast protocol16.

2. detectie van Mitophagy in C. elegans

Opmerking: De nematode C. elegans biedt een platform voor het mitophagy op het niveau van organisch assay. Twee spanningen kunnen worden gebruikt voor het controleren van mitophagy: (1) mitochondriën-gerichte Rosella (mtRosella) of (2) mitophagy receptor DCT-1 gefuseerd met GFP samen met autophagosomal marker LGG-1 gefuseerd met Discosoma sp. rood fluorescerende eiwit (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy controleren met Rosella biosensor
    Opmerking: Rosella is een moleculaire biosensor die een pH-ongevoelig DsRed gesmolten tot een pH-gevoelige GFP variant combineert. De Rosella biosensor profiteert van de pH-verschillen tussen de zure lysosoom (pH ~ 4.5) en andere cellulaire compartimenten. Deze biosensor is gebruikt om te controleren met succes mitophagy in Saccharomyces cerevisiae en verschillende zoogdieren cellijnen, zoals HeLa, HEK293 en HCT11618,19. We deze veelzijdige dual-belichting fluorescerende verslaggever aangepast en gegenereerd transgene C. elegans nematoden uiting van mitochondriën-gerichte Rosella (mtRosella) in spiercellen lichaam-muur. Mitophagy-inductie wordt aangegeven door een verminderde GFP/DsRed-ratio van mtRosella fluorescentie.
    1. Dag 1: Kies L4 larven van wormen uiting van mitochondriën-gerichte Rosella (mtRosella) in spiercellen van de lichaam-muur op een bord van de Nematode groei Media (NGM) met E. coli (OP50) met behulp van een dissectie Microscoop5agarvoedingsbodem. 10-20 wormen/plaat plaatsen op ten minste drie 3,5 cm platen. Incubeer de nematoden in de standaard temperatuur van 20 ° C5.
      Opmerking: Zie referentie voor de worm-anatomie, met inbegrip van de identificatie van L4 larven20, en de manier om een pick die wordt gebruikt voor het overbrengen van wormen van de ene locatie naar een andere21.
    2. Dag 5: Synchroniseren nematoden door het selecteren van 15-20 L4 transgene larven en overbrengen van hen naar vers OP50 agarvoedingsbodem NGM plaat. Het gebruik van ten minste vijf platen per experimentele conditie.
    3. Dag 7: Bereiden voertuig platen voor mitophagy-op het gebied van drugs van belang of de positieve controle.
      1. E. coli (OP50) bacteriën zaadjes door bloot NGM platen voor 15 min met 222 μW/cm2 (intensiteit) van UV-licht om ervoor te zorgen dat de mitophagy-inducerende stoffen niet worden gemetaboliseerd door bacteriën te doden. Platen moeten worden blootgesteld met 2.000 J/m2.
        Opmerking: Seconden van de blootstelling nodig = 2.000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Verbinding(en) van belang aan de bovenkant van de geplaatste NGM platen toevoegen. Een equivalente hoeveelheid samengestelde voertuig (oplosmiddel gebruikt te ontbinden verbinding, zoals dimethylsulfoxide (DMSO)) toevoegen aan de platen van het voertuig als een negatieve controle. Voor de positieve controle van mitophagy inductie, een mitochondriale veroorzaken, werd paraquat (8 mM eindconcentratie) gebruikt. Voeg een oplossing met 10 µL van 8 M paraquat voorraad met 190 µL van ddH2O op de bovenkant van de agarplaat voor de behandelde groep. Toevoegen voor de voertuig-groep, een oplossing met 10 µL van DMSO met 190 µL van ddH2O op de bovenkant van de agarplaat.
        Opmerking: De paraquat-werkende oplossing kan worden bewaard voor 1 maand bij 4 ° C.
      3. Swirl zachtjes de platen tot de drug of voertuig jassen het gehele oppervlak. Laat de platen te drogen met de deksels gesloten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur vóór de overbrenging van de wormen.
        Opmerking: Drug platen kunnen ook worden bereid door toevoeging van drugs in de vloeibare NGM voordat het stolt.
    4. Dag 7: Transfer 10-20 van 2-dagen oude volwassen transgene dieren bereid in stap 2.1.2 aan platen met ofwel paraquat, verbinding(en) van belang, of voertuig (DMSO). Incubeer de transgene dieren bij 20 ° C gedurende 2 dagen.
    5. Dag 9: Voorbereiden 2% agarose pads (Zie Aanvullend materiaal). Voeg vervolgens één druppel (10 µL) van 20 mM levamisole in M9 per pad. Immobiliseren de transgene dieren voor imaging, door ze te plaatsen in de daling van de M9-levamisole. Op de top plaatsen zachtjes een dekglaasje aan.
    6. Vangen enkele transgene dieren met behulp van een camera die is aangesloten op een epifluorescence Microscoop. Fluorescerende beelden van hele transgene nematoden uiting van mtRosella in de spiercellen lichaam-muur op 10 X vergroting5te verwerven. De verzamelde afbeeldingen opslaan.
    7. Het verwerken van de verkregen beelden met ImageJ software. Het analyseren van de spiercellen van de muur van het lichaam gelegen in de kop van de worm te voorkomen autofluorescence in de intestinale weefsel. Het meten van de gemiddelde intensiteit waarde en totaal pixelgebied voor elke fluorescerende beeld alleen van de hoofd regio van elk dier. Voor het analyseren van het specifieke gebied van belang:
      1. Selecteer 'split kanaal' onder de 'afbeelding' en 'kleur' drop-down menu om afbeeldingen te converteren.
      2. Gebruik het gereedschap 'freehand selecteren' om vast te leggen van de fluorescerende interessegebied.
      3. Selecteer de opdracht 'meting' onder het 'analyseren' drop-down menu en pixel intensiteit analyses uit te voeren.
      4. Intensiteit van de pixel moet worden genormaliseerd door te delen door de totale oppervlakte geanalyseerd intensiteit. Bij normalisatie, berekenen het GFP DsRed verhouding22.
    8. Met behulp van statistische analyse software te voeren student t-test (vergelijking tussen twee groepen) of ANOVA (vergelijking tussen meerdere groepen) voor statistische analyse met p < 0.05 als belangrijke5,17 .
  2. Beoordeling van mitophagy co lokalisatie tussen DCT-1 en LGG-1 gebruiken
    Opmerking: DCT-1 is een mitochondriale buitenmembraan eiwit dat als een mitophagy receptor in reactie fungeert op de vermeende orthologues BNIP3 en NIX/BNIP3L in zoogdieren5soortgelijke omstandigheden, spanning. Mitophagy inleiding wordt dus beoordeeld door co lokalisatie tussen DCT-1 mitophagy receptor en autophagosomal membraan eiwit LGG-1 (homolog van de zoogdieren LC3).
    1. Dag 1: Pick L4 larven van transgene dieren zowel DCT-1::GFP en DsRed::LGG-1 uiten in lichaam-muur spier cellen5 op een OP50 zaadjes NGM plaat. Plaats van 5-10 wormen/3.5 cm plaat, en het gebruik van ten minste drie platen. Incubeer de nematoden bij 20 ° C.
      Opmerking: De transgenen bevinden zich op afzonderlijke plasmiden en ze zijn niet geïntegreerd in het genoom. Pick-up nematoden uitvoering van zowel rol-6(su1006) als pmyo-2 GFP contransformation markeringen. Alleen express transgene wormen met beide markeerders contransformation zowel DCT-1::GFP en DsRed::LGG-1 in de spiercellen lichaam-muur.
    2. Volg de stappen van de 2.1.2-2.1.5.
    3. Beeld enkele lichaam-muur spiercellen met behulp van een camera die is aangesloten op een confocal microscoop5,23. Detecteren van de grenzen van het hele lichaam-muur spiercellen en nemen z-stapel afbeeldingen onder 63 x vergroting. Hogere vergroting kan ook worden gebruikt.
    4. Open en verwerken van de beelden verkregen met de confocal software. Inleiding van mitophagy wordt aangegeven door co lokalisatie van de mitophagy receptor (DCT-1::GFP) naar de markering van de autophagosomal (DsRed::LGG-1). Handmatig meten co lokalisatie evenementen in elke stapel van lichaam-muur spier cel5. Het is essentieel om alle Microscoop en de camera instellingen (lens en vergrootglas, filters, belichtingstijd, resolutie, laser intensiteit, winst, etc.) experimenten consistent te houden. Alle instellingen dient te worden opgemerkt.
    5. Met behulp van statistische analyse software te voeren student t-test (vergelijking tussen twee groepen) of ANOVA (vergelijking tussen meerdere groepen) voor statistische analyse met p < 0.05 als belangrijke5,17 . Voor twee-weg vergelijkingen gebruik van de Student t-test (p < 0.05 wordt beschouwd als belangrijke). Voor de meerdere vergelijkingen gebruik de enige factor (ANOVA) variantie-analyse, gecorrigeerd door de post hoc Bonferroni-test. Het is raadzaam analyseren ten minste 50-70 dieren of lichaam-muur spiercellen van de 30-50 voor elke experimentele voorwaarde. Herhaal het experiment ten minste driemaal.

3. opsporing van Mitophagy in muizen

Opmerking: Bovenstaande methoden voor de opsporing van mitophagy in muizen waren omslachtig, ongevoelig en moeilijk te kwantificeren. Een transgeen muismodel uitdrukken van de mitochondriale-gerichte vorm van de fluorescerende verslaggever Keima kan (mt-Keima) nu worden gebruikt voor de beoordeling van de niveaus van mitophagy in een brede waaier van fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

  1. Muizen met behulp van een protocol goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité14euthanaseren.
  2. Beveilig de muis (ventrale kant naar boven) tot het werkplatform met behulp van pennen in de ledematen. Maak een incisie in de onderbuik met behulp van microchirurgie schaar en pincet om de lever24bloot te stellen. Knip een stukje van de lever (bijvoorbeeld, een stuk van juiste kwab 1 × 1 × 1 cm) met behulp van microchirurgie schaar en pincet.
    Opmerking: Detectie van mitophagy in muizen is ingewikkeld en vereist kennis over de anatomie van de muis en zeer bekwame muis hanteren en muis chirurgie. Dit protocol biedt elementaire, belangrijke stappen op deze methode, en een meer gedetailleerde methode is beschikbaar24.
  3. Leg het lever monster op een metalen plaat op het ijs snel afkoelen van het weefsel. Houd het weefsel op de koude metalen plaat en zo snel mogelijk verwerken. Optimaal gebruik binnen 1 uur van dissectie.
  4. Til de lever monster met behulp van gebogen pincet en spoel met 5 mL ijskoud 1 x PBS.
  5. De lever overbrengen in een petrischaal (Ø 100 mm) op het ijs met behulp van de lepel einde van een spatel.
  6. Snijd de lever monster met de hand in 0,5-1 mm dik secties met behulp van single-edge mesjes.
  7. Zorgvuldig overbrengen in de weefselsecties een glazen bodem schotel met behulp van microchirurgie pincet.
  8. Stel de lever sectie zorgvuldig met een tang plat op de bodem.
  9. Dekken de gesneden lever met 3-5 druppels koude 1 x PBS.
    Opmerking: DAPI kleuring wordt aanbevolen om het identificeren van de regio van belang in bepaalde weefsels (bijvoorbeeld, hersenen)24. Als u wilt valideren co lokalisatie van het signaal rood mt-Keima met het lysosoom, kunnen lysosomale kleurstoffen, zoals dextran trapsgewijs blauw en lysosensor, gebruikte24.
  10. Het imago van de weefselsecties onder confocale microscopie via twee opeenvolgende excitaties24. Twee imaging-kanalen instellen: "groen" mt-Keima kanaal (excitatie 458 nm, emissie 570-695 nm bereik) en 'rood' mt-Keima (excitatie 561 nm, emissie 570-695 nm bereik). Imaging instellingen tussen experimentele omstandigheden behouden. Voor een efficiëntere imaging, twee dieren tegelijk te analyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Detectie van Mitophagy in menselijke cellen:

Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, waren menselijke HeLa cellen transfected met mt-Keima plasmide. Gezonde cellen aangetoond een goed georganiseerde mitochondriale netwerk (GFP, 488 nm) met enkele gevallen van mitophagy (RFP, 561 nm). Echter cellen voorbehandeld met een mitochondriaal uncoupler FCCP (30 µM voor 3U) tentoongesteld een grote stijging in mitophagy incidenti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Nauwkeurige meting van mitophagy is technisch veeleisend. Hier hebben wij diverse robuuste technieken waarmee beide kwalitatieve detectie van mitophagy en kwantificering van mitophagy niveaus in de meest voorkomende laboratorium experimentele modellen gepresenteerd.

Repliceerbaar om gegevens te vergaren, een experimenteel ontwerp met ten minste drie biologische herhalingen nodig is. Alle onderzoekers die betrokken zijn bij experimenten en de analyse moeten worden verblind experimentele groep i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Het Bohr-laboratorium heeft CRADA regelingen met ChromaDex en GlaxoSmithKline.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Atsushi Miyawaki en Dr. Richard J. Youle voor het delen van de plasmide mt-Keima en mt-Keima geïntegreerd Hela cellen. Wij danken Raghavendra A. Shamanna en Dr Deborah L. Croteau voor de kritische lezing van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale Research Program van de NIH (VAB), verlenen National Institute on vergrijzing, evenals een 2014-2015 en 2016-2017 NIA intra-laboratorium (EVF, VAB). EVF werd gesteund door HELSE SOR-OST RHF (Project No: 2017056) en het onderzoek Raad Noorwegen (Project No: 262175).

AUTEUR BIJDRAGEN:

EVF ontworpen het manuscript en het ontwerp; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH en ED schreef verschillende secties van het papier; NT, JP, HN en VAB herziene versie van het manuscript en voorzien van deskundigheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
mt-Keima muisJackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfectiereagensThermofisher#11668027
Opti-MEM medium (Gibco)Thermofisher#31985062serumvrij medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeimaaddgene#72342
COXII antilichaam (muis)abcam#ab110258
LAMP2 antilichaam (konijn)NOVUS#CD107b
geit-anti-konijn met golflengte 568 nm van rood fluorescent eiwit (RFP)Thermofisher#Z25306Alexa Fluor 568 kleurstof
geit-anti-muis met golflengte 488 nm van groen fluorescent eiwit (GFP)Thermofisher#Z25002Alexa Fluor 488 kleurstof
prolong gold antifade met DAPIInvitrogen#P36931
6-welplaatSIGMA
Corning Costar		#CLS3516
4-wel kamerslideTHermofisher, Nunc Lab-Tek#171080
Nunc F 96-welplaatThermofisher#152038
LC3B antilichaam konijnNOVUS#NB100-2220
DNA antilichaamProgen Biotechnik#anti-DNA muis monoklonaal, AC-30-10
DAPIThermofisher#D1306antifade montagemedium met DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent lezer )GE Healthcare Life Sciences#IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocale microscoopNikon#TE-2000e
Colocalisatie softwareVolocity#Volocity 6.3alternatief Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator SoftwareGE Healthcare Life Sciences#28408974
celkweekmediumThermofisher#DMEM–Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Thermofisher#15140122
Fetaal RundserumSigma-Aldrich#12003C-1000ML
CelkweekincubatorThermofisher#Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescentie microscoopZeissZeiss Axio Imager Z2
cameraOlympusOlympus DP71
confocale microscoopZeissZeiss Axio Observer Z1
confocale softwareZeissZEN 2012
beeldanalyse softwareImage Jcolocalisatieanalyse, etchttps://imagej.nih.gov/ij/
statistische analyse softwareGraphPad Software Inc., San Diego, USAGraphPad Prism softwarepakket
materiaal om een wormpick te makenSurepure Chemetals#4655De pick is gemaakt van 30 gauge 90% platina 10% iridium draad
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]Materiaalonderzoek naar Tavernarakis NektariosTransgene dieren houden bij 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]Materiaalonderzoek naar Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::RosellaMateriaalonderzoek naar Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFPMateriaalonderzoek naar Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1Materiaalonderzoek naar Tavernarakis Nektarios
Paraquat oplossingzie aanvullende gegevens voor bereiding
M9 bufferzie aanvullende gegevens voor bereiding
M9-levamisol bufferzie aanvullende gegevens voor bereiding
Glazen Microscoopplaten en DekglasjesFisher Scientific#B9992000
Chirurgische pincettenSTERIS Animal Health19 Piece Canine Spay Pack Economy
Chirurgische schaarSTERIS Animal Health19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBSThermofisher#AM962510x PBS moet worden verdund tot 1x PBS met behulp van ddH2O
schudderFisher Scientific#11-676-178Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose padzie aanvullende gegevens voor bereiding
Vibroslice bladenWorld precision instruments#BLADES-2enkelzijdig mes
metalen plaatMSC#788039880,012 inch dik x 6 inch breed x 12 inch lang, 430 Roestvrijstalen Plaat
Triton X-100detergens
Methyl viologen dihydrochloride hydraatSigma-Aldrich#856177paraquat
Incubator voor nematodenAQUALYTICIncubator om 20 °C te handhaven
Dissectie stereomicroscoopOlympusSMZ645
Confocale microscoopZeissAxioObserver Z1Voor nematoden (stap 2)
epifluorescentie microscoopZeissAxioImager Z2Voor nematoden (stap 2)
UV crosslinkerVilber LourmatBIO-LINK – BLX-E365UV lichtbron; 356 nm

Referenties

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397(2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Detectie van mitofagiemitochondriale gezondheidconfocale microscopieMito Keima plasmideC elegans stammenhumane HeLa cellenleverweefsel van muisparaquatbehandelingFCCP ontkoppelaarLAMP2 COXII co lokalisatie
In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.