Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56302

⸱

4 oktober 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Biochemische en structurele analyses van geglycosyleerde eiwitten vereist relatief grote hoeveelheden van homogene monsters. Hier presenteren we een efficiënte chemische methode voor site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten gezuiverd van bacteriën door zich te richten van reactieve Cys thiolen.

Samenvatting

Stromale interactie molecuul-1 (STIM1) is een type-ik transmembraan eiwit gelegen aan het endoplasmatisch reticulum (ER) en plasma membranen (PM). ER-ingezeten STIM1 regelt de activiteit van PM Orai1 kanalen in een proces dat bekend staat als bediende calcium (Ca2 +)-vermelding die is het belangrijkste Ca2 + signalering proces dat de immuunrespons drijft opslaan. STIM1 ondergaat posttranslationele N- glycosylation op twee luminal Asn sites binnen het Ca2 + sensing domein van het molecuul. Echter de biochemische, biofysische, en de biologische effecten van de structuur van N- geglycosyleerde STIM1 waren slecht begrepen totdat onlangs als gevolg van een onvermogen om gemakkelijk verkrijgen van hoge niveaus van homogene N- geglycosyleerde proteïne. Hier beschrijven we de uitvoering van een in vitro chemische aanpak die glucose wordt naar specifieke proteïne sites die van toepassing zijn hecht voor het begrip van de onderliggende effecten van N- glycosylation op eiwitstructuur en mechanisme. Met behulp van de oplossing nucleaire magnetische resonantie spectroscopie beoordelen we beide efficiëntie van de wijziging alsook de structurele gevolgen van de bijlage van de glucose met een enkelvoudige steekproef. Deze aanpak kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van de talloze geglycosyleerde eiwitten in de natuur aangetroffen.

Inleiding

Opslaan van bediende calcium (Ca2 +) post (SOCE) is de grote pad waarop immuuncellen Ca2 + van de extracellulaire ruimte in het cytosol duren. In T lymfocyten binding T-cel-receptoren gelegen op het plasma-membraan (PM) antigenen die eiwit tyrosine kinases activeren (herzien in 1,2,3). Een cascade van fosforylering leidt tot de activering van fosfolipase-γ (PLCγ) die vervolgens doorgeeft van de hydrolyse van membraan phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2) in diacylglycerol en inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3 ). IP-3 is een kleine diffusible boodschapper dat aan IP-3 receptoren (IP-3R) op het endoplasmatisch reticulum (ER) waardoor deze receptor-kanaal opent en toelaat Ca2 + bindt aan de gradiënt van de concentratie van de ER stromen lumen naar het cytosol (herzien in 4). Receptor signalering van G-eiwit gekoppelde en tyrosine kinase receptoren in een verscheidenheid van andere prikkelbaar en niet-prikkelbaar cel typen lood op de dezelfde productie van IP-3 en activering van IP-3Rs.

Als gevolg van de eindige Ca2 + opslagcapaciteit van de ER, de IP-3-gemedieerde release en resulterende toename van cytosolische Ca2 + is alleen voorbijgaande; echter deze uitputting van de ER luminal Ca2 + diep gevolgen stromale interactie molecuul-1 (STIM1), een type-ik transmembraan (TM) eiwit meestal aangetroffen op de ER membraan 5,6,7. STIM1 bevat een lumen-georiënteerde Ca2 + sensing domein bestaat uit een paar van de EF-hand en steriele α-motief (EFSAM). Drie cytosolische georiënteerde spiraalsnoer-spoel domeinen zijn gescheiden van de EFSAM door de één TM domein (herzien in 8). Na ER luminal Ca2 + uitputting ondergaat EFSAM een destabilisatie-coupled oligomerisatie 7,9 waardoor structurele herschikkingen van de TM en spiraalsnoer-spoel domeinen 10. Deze structurele veranderingen uitmonden in een overlapping van STIM1 bij ER-PM kruispunten 11,12,13,14 door middel van interacties met PM-phosphoinositides 15, 16 en Orai1 subeenheden 17,18. Orai1 eiwitten zijn de PM subeenheden die aan formulier Ca2 + kanalen 19,20,21,22 monteren. De STIM1-Orai1-interacties bij ER-PM kruisingen vergemakkelijken een open Ca2 + versie geactiveerd Ca2 + (CRAC) kanaal conformatie waarmee het verkeer van Ca2 + in het cytosol door de hoge concentraties van de extracellulaire ruimte. In de immuun cellen, de aanhoudende cytosolische Ca2 + waterstand via CRAC kanalen veroorzaken de Ca2 +- Calmoduline/calcineurin afhankelijke defosforylerings van de nucleaire factor van geactiveerde T-cellen, die vervolgens de kern en begint transcriptionele verordening van genen bevordering van T-cel activatie 1,3. Het proces van de CRAC kanaal activering door STIM1 23,24 via agonist-geïnduceerde ER luminal Ca2 + uitputting en de resulterende aanhoudende cytosolische Ca2 + elevatie wordt collectief SOCE 25genoemd. De vitale rol van SOCE in T-cellen is duidelijk door de onderzoeken die aantonen dat erfelijke mutaties in zowel STIM1 als Orai1 leiden strenge gecombineerde immunodeficiency syndromen 3,19,26, tot kunnen 27. EFSAM start SOCE na sensing ER-luminal Ca2 + uitputting via het verlies van Ca2 + coördinatie op de canonieke EF-hand, dat uiteindelijk leidde tot de destabilisatie-coupled zelfstandige vereniging 7, 28,29.

Glycosylatie is de covalente gehechtheid en de verwerking van oligosaccharide structuren, ook bekend als glycanen, door verschillende biosynthetic stappen in de ER en Golgi (herzien in3332, 30,). Er zijn twee dominante soorten glycosylatie in eukaryoten: N-gekoppelde en O-gekoppeld, afhankelijk van de specifieke aminozuur en Atoom het overbruggen van de koppeling. N- glycosylation, glycanen zijn bevestigd aan de kant keten amide van Asn, en in de meeste gevallen de inleiding stap vindt plaats in de ER als de polypeptide keten pakt de lumen- 34. De eerste stap van N- glycosylation is de overdracht van een veertien-suiker kern structuur bestaande uit glucose (Glc), mannose (Man) en N- acetylglucosamine (GlcNAc) (d.w.z. Glc3Man9GlcNAc2) van een ER membraan lipide door een oligosaccharyltransferase 35,36. Verdere stappen, zoals splitsing of overdracht van glucose residuen, zijn in de ER gekatalyseerd door specifieke glycosidases en glycosyltransferases. Sommige eiwitten die ER verlaten en verhuizen naar het Golgi kunnen verder verwerkte 37te zijn. O- glycosylation verwijst naar de toevoeging van glycanen, meestal aan de kant keten hydroxylgroep van Ser of Thr residuen, en deze wijziging gebeurt volledig in het Golgi-complex 33,34. Er zijn verschillende structuren van het O- glycan die kunnen worden samengesteld uit N- acetylglucosamine fucose, galactose en sialic zuur met elke monosaccharide toegevoegd sequentieel 33.

Terwijl zonder specifieke volgorde is geïdentificeerd als voorwaarde voor vele soorten O- glycosylation, een gemeenschappelijke reeks van consensus is in verband gebracht met de N-wijziging gekoppeld: Asn-X-Ser/Thr/Cys, waarbij X een aminozuur kan zijn behalve Pro 33. STIM1 EFSAM bevat twee van deze consensus N- glycosylation sites: Asn131-Trp132-Thr133 en Asn171-Thr172-Thr173. Inderdaad, vorige studies hebben aangetoond dat EFSAM N- geglycosyleerde bij zoogdiercellen op Asn131 en Asn171 38,39,40,41kan zijn. Eerdere studies van de gevolgen van de N- glycosylation op SOCE geweest elkaar echter suggereren onderdrukt, Potentiation of geen effect door deze posttranslationele wijziging op SOCE activering 38,= "xref" > 39,40,41. Onderzoek over de onderliggende biofysische, biochemische en structurele gevolgen van EFSAM N- glycosylation is dus van vitaal belang voor het begrijpen van de regelgevende gevolgen van deze wijziging. Als gevolg van de eis van hoge niveaus van homogene eiwitten in deze in vitro experimenten, werd een site-selectieve benadering hechten covalent glucose wordt aan EFSAM toegepast. Interessant, veroorzaakt Asn131 en Asn171 glycosylatie structurele veranderingen die convergeren in de kern van de EFSAM en de biofysische eigenschappen ter bevordering van STIM1-gemedieerde SOCE 42te verbeteren.

De chemische bevestiging van glycosyl groepen aan Cys thiolen geweest gevestigde door een baanbrekende werk die eerst gedemonstreerd het nut van dit enzym-vrije benadering voor het begrip van de specifieke effecten van glycosylatie op eiwit functie 43 , 44. meer recentelijk als ten aanzien van STIM1, de Asn131 en Asn171 residuen waren gemuteerd naar Cys en glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] werd gebruikt om covalent glucose te koppelen aan de gratis thiolen 42. Hier beschrijven we deze aanpak die niet alleen mutagenese gebruikt te nemen site specifieke Cys residuen voor wijziging, maar geldt ook oplossing nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie om te snel beoordelen van zowel de efficiëntie van de wijziging en de structurele verstoringen als gevolg van de glycosylatie. Met name deze algemene methodologie is gemakkelijk aan te passen aan het bestuderen van de effecten van beide O- of N- glycosylation van om het even welk recombinantly eiwit geproduceerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. polymerase-kettingreactie (PCR)-gemedieerde plaats-geleide mutagenese voor de opneming van Cys in een vector van de expressie bacteriële huisdier-28a.

  1. Bepaal de concentratie van het huisdier-28a vector (d.w.z. dubbele gestrande DNA) met behulp van ultraviolet (UV) uitsterven coëfficiënt 0.020 (μg/mL) cm -1 op 260 nm.
  2. Synthetiseren een paar aanvullende mutagene inleidingen voor elke Cys mutatie die ik) Er dienen minimaal 15 nucleotiden ter aanvulling van de sjabloon voorafgaand aan de eerste honk mismatch en 15 nucleotiden ter aanvulling van de sjabloon na het definitieve basis mismatch, ii) primer van de totale lengte niet meer dan 45 nucleotiden, en iii) een guanine of cytosine bevindt op de positie van de eerste en laatste nucleotide van elke primer (tabel 1). Zorgen primer synthese wordt uitgevoerd met behulp van een schaal en cartridge zuivering van 0,025 μmol.
  3. Met een high-fidelity polymerase van DNA, instellen van twee 20 µL PCR reactie mengsels: één met de voorwaartse primer en de tweede met de omgekeerde primer. Bereiden van ieder mengsel bevatten van de eindconcentraties van 1 x PCR buffer met 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μM primer, 0.4 μL DMSO, 1,25 ng/μL sjabloon DNA, 0,02 U/μL high-fidelity polymerase van DNA.
  4. Thermisch cyclus de afzonderlijke mengsels met behulp van een drie-stappen-protocol: 98 ° C gedurende 30 s (denaturering), 53-56 ° C gedurende 30 s (gloeien), 72 ° C gedurende 30 s kilobase(kb) -1 (verlenging) van de sjabloon DNA. Herhaal de temperatuur programma voor 5 cycli en een finale 72 ° C uitbreiding stap voor 7,5 min. toevoegen
  5. Na de eerste PCR met voorwaartse en omgekeerde inleidingen in afzonderlijke buizen, combineer de producten in een enkele buis (dat wil zeggen 40 μL totale) en blijven de PCR reactie voor een extra 20 cycli met gebruik van dezelfde fietsen parameters zoals beschreven in stap 1.4.
  6. Electrophorese 15 μl van het PCR reactiemengsel op een 1% (m/v)-agarose gel met 0,5 x Tris, azijnzuur, ethyleen diamine tetra azijnzuur (EDTA) buffer (TAE) uitgevoerd. Als besturingselementen, electrophorese een equivalente hoeveelheid sjabloon DNA die heeft niet vergroot door PCR en een aliquoot gedeelte van het referentie-DNA-ladder waarin marker bands zowel groter en kleiner dan de grootte van de verwachte PCR product.
  7. Na Elektroforese bij 120 V voor 40 min, dompelen de gel in water met 0.5 μg/mL ethidium bromide (en) en schud gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bevestig de full-length sjabloon heeft versterkt door de mutagene inleidingen als een toename in de relatieve ethidium bromide fluorescerende intensiteit van de versterkte band ten opzichte van de controle sjabloon band onder UV-licht (302 nm).
    1. Als geen versterking herkenbaar is, herhaalt u de PCR na het aanpassen van de onthardende temperatuur in stappen van 0,5 ° C tussen het 53-56 ° C-temperatuurbereik.
  8. Na bevestiging van versterking van de sjabloon door de mutagene inleidingen, behandelen de resterende ~ 25 μl van het PCR reactiemengsel met het enzym van de beperking van de DpnI aan de methylated sjabloon DNA verteren. Gebruik DpnI op 0,5 µL (10 eenheden) per 25 μL PCR reactiemengsel en een eindconcentratie van 1 × DpnI reactie buffer. Incubeer gedurende 2,5 uur bij 37 ° C.
  9. Toevoegen na vertering van de sjabloon, ~ 5-10 μl van het mengsel verteerd 100 µL van warmte schok bevoegde DH5α Esherichia coli cellen in een tube van 1,75 mL microcentrifuge. Incubeer de cel-DNA mengsel op ijs voor 60 min.
  10. Heat shock het mengsel van de cel-DNA in de buis van de microcentrifuge bij 42 ° C gedurende 45 s op een blok van droge hitte. Na het mengsel op het ijs gedurende 3 minuten aan het broeden, 900 μL van kamertemperatuur Luria Bertani Bouillon (LB) aan de cellen toevoegen en spoel de cel Totaal suspensie in een tube van de ronde-onder steriele 14 mL.
  11. Broeden de celsuspensie bij 37 ° C gedurende 90 minuten met constante schudden op 190 rpm.
  12. Vervolgens het overbrengen van de celsuspensie terug in een tube van 1,75 mL microcentrifuge en centrifuge op 10.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  13. Na het centrifugeren, verwijderen van 900 μL van de bovendrijvende substantie en resuspendeer de bacteriecellen door zachte pipetteren in de resterende 100 μl van pond
  14. Transfer de resulterende geconcentreerde celsuspensie op een bord van de LB-agar met antibioticum dat selectief is voor de expressie vector (dat wil zeggen 60 μg/mLKanamycin). Aseptisch verspreid de opschorting gelijkmatig op de agarplaat en incubeer gedurende ~ 16 uur bij 37 ° C.
  15. De volgende dag, enten een één kolonie van de plaat in 5 mL vloeibare LB met de selectiedruk antiobiotic (dat wil zeggen 60 μg/mL kanamycine). Groeien de vloeibare cultuur 's nachts bij 37 ° C, met constante schudden bij 37 ° C.
  16. Isoleren en zuiveren van de gekweekte plasmide uit de cellen van de E. coli met behulp van een commercieel beschikbare kit op basis van de lysis van de alkalische procedure 45.
  17. Bevestigen de mutatie van belang aanwezig is en in de juiste leesraam door Sanger DNA sequentiebepaling van de plasmide 46.

2. Uniforme 15 N-geëtiketteerden eiwituitdrukking in BL21 ΔE3 Escherichia coli.

Opmerking: verschillende recombinante eiwitten vereisen verschillende expressie voorwaarden. Het volgende is de geoptimaliseerde procedure voor de expressie van het menselijke eiwit STIM1 EFSAM.

  1. Transformeren de expressie vector herbergen de Cys mutaties (d.w.z. huisdier-28a-EFSAM) in BL21 ΔE3 codon (+) warmte schok bevoegde cellen en plaat op LB-agar platen die de antibiotica selectiedruk bevatten zoals beschreven in stappen 1.9-1.14) met de volgende wijzigingen: direct plaat een hoeveelheid 150 μl uit de ~ 1.000 μL totale celsuspensie op de LB-agarplaat zonder de noodzaak voor het bijeenbrengen van de cellen in een buis van microcentrifuge door middel van centrifugeren.
  2. De volgende dag, aseptisch Pipetteer een één kolonie in een 200 mL conische kolf met 20 mL LB aangevuld met de juiste antibioticum (dat wil zeggen 60 kanamycine μg/mL voor huisdier-28a-EFSAM). Deze vloeibare starter cultuur 's nachts (d.w.z. ~ 16 h) bij 37 ° C, met constante schudden bij groeien ~ 190 rpm.
  3. Op dezelfde dag als stap 2.2, bereiden M9 medium voor 15 N-geëtiketteerden eiwituitdrukking in autoclaaf 1 L van M9 buffer zouten (d.w.z. 42 mM nb 2 HPO 4, 22 mM KH 2 PO 4, 8.6 mM NaCl, pH 7.4) in een conische kolf van 4 L. Zodra cool, filtreer een mengsel van 20% (m/v) D-glucose, 1 M CaCl 2, 1 M thiamine, 1 M MgSO 4, 1 mg/mL Biotine en 0,2 g/mL 15 N-NH 4 Cl door een 0.2 micrometer steriele injectiespuit filter in de 1 L steriele M9 zout oplossing zodat de eindconcentraties van deze onderdelen zijn 0,2% (m/v) D-glucose, 100 μM CaCl 2, 50 μM thiamine, 1 mM MgSO 4, 1 μg/mL Biotine en 1 mg/mL 15 N-NH 4 Cl.
  4. De volgende dag, Pipetteer aseptisch de 20 mL overnachting vloeibare starter cultuur in een steriele conische tube van 50 mL en centrifuge bij 2400 × g gedurende 15 min naar de cellen pellet.
  5. Na het LB-medium decanteren, resuspendeer de resulterende cel pellet in 10 mL van de M9 minimaal medium en breng het mengsel van de geresuspendeerde pellet in 1 L van M9 minimaal medium met antibioticum (dat wil zeggen 60 μg/mL kanamycine).
  6. Groeien de 1 liter minimaal medium M9 met de cultuur van de bacteriële starter bij 37 ° C en ~ 190 rpm-constante die schudden tot de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) bereikt ~0.6-0.8.
  7. Wanneer het specfified OD600 bereik is bereikt, voeg toe 200 μM van isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) voor het opwekken van eiwit expressie.
  8. Na IPTG de toevoeging, blijven het broeden van de cellen voor eiwit expressie bij kamertemperatuur met constante schudden bij ~ 190 t/min voor ~ 16 h (dat wil zeggen 's nachts).
  9. De volgende dag, oogst de bacteriën door centrifugeren ~ 10.000 × g 4 ° C gedurende 30 minuten
  10. Giet de LB en breng de pellet cel in een conische tube van 50 mL. Bewaren van de pellet-80 ° c tot zuivering.

3. Zuivering van recombinante eiwitten van E. coli.

Opmerking: verschillende recombinante eiwitten vereisen verschillende zuiveringsprocedures. Het volgende is het protocol voor 6 & #215; Zijne-gelabeld EFSAM zuivering van instanties van de opneming van het huisdier-28a construct uitgedrukt.

  1. Handmatig Meng de bevroren bacteriële cel pellet in 6 M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) en 5 mM β-mercaptoethanol met behulp van een precisiepipet gemotoriseerde 10 mL overdracht. Voeg ongeveer 40 mL guanidine-HCl per 5 mL van natte cel pellet voor deze stap.
  2. Volgende een 90 min incubatie bij kamertemperatuur met constante rotatie in een oven van hybridisatie, Centrifugeer het mengsel bij ~ 15.000 × g, 8 ° C gedurende 40 minuten te scheiden van het onoplosbare cel puin (d.w.z. pellet) van de oplosbare proteïne mengsel (d.w.z. supernatant).
  3. Toevoegen 750 µL van een 50% (v/v) Ni 2 +-nitrilotriacetic zuur agarose bead drijfmest aan de geklaarde lysate en incubeer gedurende een ander 90 minuten bij kamertemperatuur met inversie in een oven van hybridisatie.
  4. Vangen vervolgens de 6 × zijn-gelabeld eiwit gebonden aan de Ni 2 + door het verzamelen van de agarose kralen in een gravity stroom eiwit zuivering kolom. Toestaan dat de lysate stromen door de kolom volledig vóór het verplaatsen naar stap 3.5.
  5. Wassen de verzamelde kralen driemaal met 10 mL 6 M ureum, 20 mM Tris-HCl pH 8 en 5 mM β-mercaptoethanol. Zorgen dat de gehele 10 mL passeert aan de kolom vóór elke latere 10 mL wash.
  6. Elueer de eiwitten in een serie van 2 mL fracties met behulp van 6 M ureum, 20 mM Tris-HCl pH 8, imidazool 300 mM en 5 mM β-mercaptoethanol met een 90 s incubatietijd tussen de fracties. Zorgen dat de gehele 2 mL aan de kolom vóór elke latere elutie stap passeert.
  7. In dit stadium, bevestigen de proteïne van belang is aanwezig in de eluted breuken door Coomassie blue gebeitste elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-PAGE) met behulp van de methode van Laemmli 47. Beoordelen van de grootte van de proteïne, hoeveelheid en zuiverheid in vergelijking tegen standaard molecuulgewicht marker bands, die beide minder dan of groter dan de verwachte molecuulgewicht van de proteïne van belang.
  8. De geëlueerd eiwitfracties bundelen in een membraan van de dialyse met een 3500 Da moleculair gewicht cutoff en incubeer in 1 L uiteinde buffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM CaCl 2, pH 8) bij 4 ° C's nachts terwijl de buffer wordt worden geroerd door een magneti c roerder.
  9. Na ~ 16 h uiteinde tijd, voeg ~ 1 U van trombine per mg eiwit rechtstreeks aan de tas van de dialyse en Incubeer bij 4 ° C voor een extra ~ 24 h.
  10. Controleren zijn label decollete of de omvang van de 6 × door Coomassie-blauw kleuring van ~ 15 μL eiwit aliquots genomen uit de zak van de dialyse vóór en na incubatie met trombine die zijn electrophoresed op de denaturering van polyacrylamide gels (SDS-PAGE) met behulp van de methode van Laemmli 47. Als een ~ 2 kDa verschuiving in de migratie wordt waargenomen overeenkomt met het molecuulgewicht van de gekloofd 6 × zijn label, gaat u verder naar stap 3.11; Als een fractie van onverteerde eiwitten blijft dat is aantoonbaar door Coomassie-blauw kleuring, ~0.2 U van trombine per mg eiwit rechtstreeks toevoegen aan de dialyse-zak en Incubeer bij 4 ° C voor een extra ~ 24 h.
  11. Gebruik grootte uitsluiting of ionenwisseling chromatografie verder zuiveren het eiwit. Voor anion uitwisseling chromatografie van EFSAM, de eiwit-oplossing te verwijderen uit de zak van de dialyse en concentraat ~ 10-fold met behulp van een centrifugaal concentrator van ultrafiltratie met een 10.000 Da moleculair gewicht cutoff. Daarna Verdun opnieuw de oplossing ~ 20-fold in een buffer van NaCl-vrij (20 mM Tris, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8).
  12. Equilibreer een voorverpakte anion wisselingskolom met 10 kolom volumes van de NaCl-vrije buffer beschreven in stap 3.11. Equilibreer gebruik van buffer geladen in een spuit van de luer-lock geen luchtbellen bevattende de oplossing door de kolom te duwen in een dropwise wijze en vermijden spuit druk waardoor gestage stromen van oplossing verlaten van de kolom. Gebruik een sterke anionenwisselaar (bijvoorbeeld kruisverwijzende agarose met quaternaire ammoniumzouten functionele groepen).
  13. Laden van de eiwit-oplossing verdund in NaCl-vrije buffer (stap 3.11) op de kolom zoals beschreven in stap 3.12.
  14. Elueer de eiwitten in een verloop [d.w.z. 0 - 60% (v/v)] van de toenemende NaCl buffer (20 mM Tris, 1 M NaCl, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8) met behulp van een twee-pomp snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) systeem. Instellen van het systeem van de FPLC ~1-1.5 mL breuken verzamelen en controleren van het eiwit elutie profiel met behulp van de absorptie van UV-280 nm en een stroom tarief 0,5 mL/min.
  15. Identificeren de elutie pieken en breuken met de proteïne van belang evenals eiwit zuiverheid door Coomassie blue gebeitste SDS-PAGE gels met behulp van de methode van Laemmli 47.
  16. Zwembad breuken tonen > 95% (dwz genomen als breuken die slechts een enkele eiwit band Toon op Coomassie-blauw gekleurd gels) in een zak van de dialyse en uitwisseling in experimentele buffer van belang door dialyse zoals beschreven in stap 3.8.

4. Chemische bevestiging van glucose-5-MTS aan eiwitten door de dialyse.

  1. Voorbereiden een 55 mM stockoplossing van N-(β-D-glucopyranosyl)-N '-[2-methanethiosulfonyl) ethyl] ureum (glucose-5-MTS) door het oplossen van 10 mg van de stof in 500 μl van 100% (v/v) DMSO. Opslaan van ongebruikte glucose-5-MTS ontbindend in DMSO bij -20 ° C.
  2. Voorbereiden de eiwitSteekproef voor wijziging door dialyzing 1,5 mL ~ 60 μM eiwit in 1 L van wijziging buffer samengesteld uit MOPS van 20 mM, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 en 0.1 mM TCEP, pH 8.3. Gebruik een dialyse membraan molecuulgewicht cutoff die kleiner is dan de grootte van de proteïne worden gewijzigd (bijvoorbeeld het gebruik van een 3500 Da cutoff voor de ~ 17.500 Da EFSAM).
  3. Na 24 uur bij 4 ° C, breng het monster uit de zak van de dialyse in een microcentrifuge buis. De DMSO-ontbindend glucose-5-MTS toevoegen aan een definitieve concentratie van 2 mM.
  4. Incubeer het monster in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gedurende de incubatieperiode van 1 h, meng de oplossing door zacht te onttrekken van de buis elke 10 min.
  5. Wisselen vervolgens opnieuw de proteïne in de definitieve experimentele buffer die geen reductiemiddel door dialyse bij 4 ° C bevatten, zoals beschreven in stap 4.2 of door centrifugaal ultrafiltratie. Voor de procedure van ultrafiltratie, concentreren de ~1.5 mL eiwitSteekproef te < 0,5 mL en vervolgens verdund in de dezelfde concentrator met de experimentele buffer. Herhaal deze concentratie-verdunning stap extra tweemaal zodat de totale exchange een minimum van 30 × 30 × 30 is = 27,000-fold. Gebruik voor EFSAM, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH 7.5 als de experimentele buffer.
  6. Voorbereiden op het monster electrospray ionisatie massaspectrometrie door dialyse of ultrafiltratie uitwisseling zoals wordt beschreven in stap 4.2 en 4.5, respectievelijk naar Ammoniumbicarbonaat 25 mM of 25 mM ammoniumacetaat. Als dialyse gebruikt, controleert u wisselen ten minste driemaal te verwijderen van alle resterende NaCl en CaCl 2 zouten.
  7. Bepalen de nauwkeurige massa (d.w.z. ± 1 Da) van de proteïne van belang met behulp van electrospray ionisatie massa spectrometrie 48 , 49. Verwachten van elke covalente glucose toevoeging aan een Cys thiol via de methanethiosulfonate-chemische 281.3 Da toevoegen aan het eiwit massa (d.w.z. 360.4 Da voor de glucose-5-MTS toevoegen en aftrekken 79.1 Da voor de CH-3 dus 2 verlaten groep tijdens covalente bijlage).

5. Oplossing NMR beoordeling van redenties efficiëntie en structurele verstoringen.

  1. Zorg ervoor dat de concentratie van de gemodificeerde eiwitten is > 100 μM na de glucose gehechtheid en de uitwisseling van definitieve buffer. Voor EFSAM, schatten eiwitconcentratie met behulp van een UV uitsterven coëfficiënt op 280 nm 1,54 (mg mL --1) cm - 1.
  2. Supplement de eiwit-oplossing met 60 μM van 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic zuur (DSS) voor shimming en pulsstand kalibratie en 10% (v/v) D 2 O voor de vergrendeling van het signaal. Voor hoge signaal-ruis-gebruik 600 μL monsters in frequentie-matched 5 mm NMR buizen, ingevoegd een minimaal 600 MHz Atoomabsorptiespectrometer met een drievoudige resonantie HCN cryogene sonde.
  3. Verzamelen standaard 1 H - 15 N HSQC spectra als eerder gedetailleerde 50 ,, 51 op temperatuur, 1 H en 15 N sweep breedtes, van voorbijgaande aard en increment instellingen geschikt voor het bijzondere monster. Voor EFSAM spectra, gebruik 20 ° C, 256 1 H transiënten, 64 15 N dimensie stappen en 1 H en 15 N breedte ingesteld op 8.000 en 1800 Hz, respectievelijk vegen.
  4. Dithiothreitol (DTT) na de overname van het geglycosyleerde eiwit spectrum, toevoegen aan het NMR-monster uit een voorraad van 1 M naar een eindconcentratie van 15 mM. De DTT verwijdert de glucose deel uit het eiwit door vermindering van de bijlage bisulfide-gemedieerde.
  5. Verwerven een tweede 1 H - 15 N HSQC deze voorwaarden verminderd/ongewijzigd, bieden een referentiespectrum om te beoordelen wijziging efficiëntie en structurele verstoringen veroorzaakt door de glucose bijlage.
  6. De NMR-gegevens met behulp van NMRPipe zo gedetailleerd eerder 52 verwerken. Er zorg voor dat verwerking minimaal gegevensconversie, fasering, oplosmiddel onderdrukking, Fourier-transformatie en eerste visualisatie van de spectra.
  7. Beoordelen wijziging efficiëntie door het meten van de amide piek intensiteiten en chemische verschuiving waarden in de gewijzigde en verminderde spectra met behulp van de NEASY plugin op CARA 53. Zorg ervoor om te evalueren van de piek intensiteit van het Cys amide zowel in de glucose aangesloten en spectra verminderd. Als het Cys amide niet betrouwbaar in beide spectra worden gevonden, gebruikt u de intensiteiten van residuen grenzend aan de Cys als een uitlezing.
  8. Berekenen de efficiëntie als de intensiteit van het amide van het spectrum Cys gemodificeerde gedeeld door de intensiteit van het amide uit de Cys-verminderd (d.w.z. DTT-behandeld) spectrum, vermenigvuldigd met 100:
    figure-protocol-1, waar ik M de intensiteit van het amide in het spectrum Cys-bewerkt is en ik R de intensiteit van het amide in het spectrum Cys-verminderd is. Als alternatief, het evalueren van de gemiddelde efficiëntie over diverse amide toppen:
    figure-protocol-2, waarbij efficiëntie i het afzonderlijk bepaald rendement berekend voor elk residu, ik, en n is het totale aantal residuen in de berekening gebruikt.
  9. Berekenen chemische verschuiving verstoringen (CSP) van de chemische verschuiving verschillen tussen de twee spectra waargenomen in de 15 N en 1 H afmetingen van elke piek en normaliseren voor de grotere 15 N chemische shift bereik met behulp van de na de vergelijking:
    figure-protocol-3, waar ΔH de verandering van de ppm in de proton-dimensie is en ΔN de verandering van de ppm in de stikstof dimensie is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De eerste stap van deze aanpak vereist de mutagenese van de kandidaat-glycosylation residuen Cys residuen die kunnen worden gewijzigd met behulp van de EFSAM glucose-5-MTS. heeft geen endogene Cys residuen, dus geen speciale overwegingen moeten worden gemaakt voorafgaand aan de mutagenese. Native Cys residuen moeten echter worden gemuteerd naar niet-wijzigbare residuen vóór het uitvoeren van de beschreven chemie. Om minimaal de inheemse structuur in te voeren, is het raadzaam voor het uit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Eiwit glycosylatie is een posttranslationele wijziging waar suikers covalent aan polypeptiden voornamelijk door middel van banden met aminozuur zijketens zijn gekoppeld. Maar liefst 50% van de zoogdieren eiwitten zijn geglycosyleerde 54, waar de geglycosyleerde eiwitten kunnen vervolgens hebben een breed scala aan effecten wijzigen biomoleculaire bindende affiniteit, beïnvloeden van eiwit vouwen, veranderen van kanaal activiteit, gericht op moleculen voor afbraak en mobiele handel, een paar (herzi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gesteund door de natuurwetenschappen en de Engineering Research Council of Canada (05239 tot P.B.S.), de Canadese basis voor innovatie/Ontario onderzoeksfonds (aan P.B.S.), Prostate kanker bestrijden Foundation - Telus Ride voor Papa (aan P.B.S.) en Ontario Afgestudeerde beurs (aan Y.J.C. en N.S.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Phusion DNA PolymeraseThermo Fisher ScientificF530SGebruik in stap 1.3.
Generuler 1kb DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1163Gebruik in stap 1.6.
DpnI Restriction EnzymeNew England Biolabs, Inc.R0176Gebruik in stap 1.8.
Presto Mini Plasmid KitGeneAid, Inc.PDH300Gebruik in stap 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coliAgilent Technologies, Inc.230280Gebruik in stap 2.1.
DH5a E. coliInvitrogen, Inc.18265017Gebruik in stap 1.9.
0.22 mm Syringe FilterMillipore, Inc.SLGV033RSGebruik in stap 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose ResinThermo Fisher Scientific88221Gebruik in stap 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis TubingBioDesign, Inc.D306Gebruik in stap 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 en 4.6.
Bovine ThrombinBioPharm Laboratories, Inc.SKU91-055Gebruik in stap 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange ColumnGE Healthcare, Inc.17-5156-01Gebruik in stap 3.11.
Glucose-5-MTSToronto Research Chemicals, Inc.G441000Gebruik in stap 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal ConcentratorsSartorius, Inc.VS2001Gebruik in stap 3.11, 4.2, 4.5 en 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein LadderThermo Fisher Scientific26630Gebruik in stap 3.7, 3.10 en 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange ColumnGE Healthcare, Inc.17-5053-01Gebruik in stap 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography SystemGE Healthcare, Inc.29018224Gebruik in stap 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR SpectrometerAgilent Technologies, Inc.Gebruik in stap 5.2 en 5.5.

Referenties

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), Epub 2005 May 2002 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L. Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. Agostinis, P., Afshin, S. , Bristol-Myers Squibb. Syracuse, NY. 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Modificatie van cysteïne-thiolenin vitro glycosyleringeiwitmutagenesesolution NMR-analyseelectrospray-ionisatiemassaspectrometrieeiwitzuiveringstreptavidine-affiniteitschromatografieanionuitwisselingschromatografiestructureel biologische beoordeling
Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.