Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Samenvatting

Biochemische en structurele analyses van geglycosyleerde eiwitten vereist relatief grote hoeveelheden van homogene monsters. Hier presenteren we een efficiënte chemische methode voor site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten gezuiverd van bacteriën door zich te richten van reactieve Cys thiolen.

Samenvatting

Stromale interactie molecuul-1 (STIM1) is een type-ik transmembraan eiwit gelegen aan het endoplasmatisch reticulum (ER) en plasma membranen (PM). ER-ingezeten STIM1 regelt de activiteit van PM Orai1 kanalen in een proces dat bekend staat als bediende calcium (Ca^{2 +})-vermelding die is het belangrijkste Ca^{2 +} signalering proces dat de immuunrespons drijft opslaan. STIM1 ondergaat posttranslationele N- glycosylation op twee luminal Asn sites binnen het Ca^{2 +} sensing domein van het molecuul. Echter de biochemische, biofysische, en de biologische effecten van de structuur van N- geglycosyleerde STIM1 waren slecht begrepen totdat onlangs als gevolg van een onvermogen om gemakkelijk verkrijgen van hoge niveaus van homogene N- geglycosyleerde proteïne. Hier beschrijven we de uitvoering van een in vitro chemische aanpak die glucose wordt naar specifieke proteïne sites die van toepassing zijn hecht voor het begrip van de onderliggende effecten van N- glycosylation op eiwitstructuur en mechanisme. Met behulp van de oplossing nucleaire magnetische resonantie spectroscopie beoordelen we beide efficiëntie van de wijziging alsook de structurele gevolgen van de bijlage van de glucose met een enkelvoudige steekproef. Deze aanpak kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van de talloze geglycosyleerde eiwitten in de natuur aangetroffen.

Inleiding

Opslaan van bediende calcium (Ca^{2 +}) post (SOCE) is de grote pad waarop immuuncellen Ca^{2 +} van de extracellulaire ruimte in het cytosol duren. In T lymfocyten binding T-cel-receptoren gelegen op het plasma-membraan (PM) antigenen die eiwit tyrosine kinases activeren (herzien in ^1,2,3). Een cascade van fosforylering leidt tot de activering van fosfolipase-γ (PLCγ) die vervolgens doorgeeft van de hydrolyse van membraan phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP₂) in diacylglycerol en inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-₃ ). IP-₃ ....

Protocol

1. polymerase-kettingreactie (PCR)-gemedieerde plaats-geleide mutagenese voor de opneming van Cys in een vector van de expressie bacteriële huisdier-28a.

1. Bepaal de concentratie van het huisdier-28a vector (d.w.z. dubbele gestrande DNA) met behulp van ultraviolet (UV) uitsterven coëfficiënt 0.020 (μg/mL) cm ^-1 op 260 nm.
2. Synthetiseren een paar aanvullende mutagene inleidingen voor elke Cys mutatie die ik) Er dienen minimaal 15 nucleotiden ter aanvulling van de sjabloon voorafgaand aan de eerste honk mismatch en 15 nucleotiden ter aanvulling van de sjabloon na het definitieve basis mismatch, ii) primer van de totale leng....

Resultaten

De eerste stap van deze aanpak vereist de mutagenese van de kandidaat-glycosylation residuen Cys residuen die kunnen worden gewijzigd met behulp van de EFSAM glucose-5-MTS. heeft geen endogene Cys residuen, dus geen speciale overwegingen moeten worden gemaakt voorafgaand aan de mutagenese. Native Cys residuen moeten echter worden gemuteerd naar niet-wijzigbare residuen vóór het uitvoeren van de beschreven chemie. Om minimaal de inheemse structuur in te voeren, is het raadzaam voor het uit.......

Discussie

Eiwit glycosylatie is een posttranslationele wijziging waar suikers covalent aan polypeptiden voornamelijk door middel van banden met aminozuur zijketens zijn gekoppeld. Maar liefst 50% van de zoogdieren eiwitten zijn geglycosyleerde ⁵⁴, waar de geglycosyleerde eiwitten kunnen vervolgens hebben een breed scala aan effecten wijzigen biomoleculaire bindende affiniteit, beïnvloeden van eiwit vouwen, veranderen van kanaal activiteit, gericht op moleculen voor afbraak en mobiele handel, een paar (herzi.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Phusion DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F530S	Gebruik in stap 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	FERSM1163	Gebruik in stap 1.6.
DpnI Restriction Enzyme	New England Biolabs, Inc.	R0176	Gebruik in stap 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit	GeneAid, Inc.	PDH300	Gebruik in stap 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli	Agilent Technologies, Inc.	230280	Gebruik in stap 2.1.
DH5a E. coli	Invitrogen, Inc.	18265017	Gebruik in stap 1.9.
0.22 mm Syringe Filter	Millipore, Inc.	SLGV033RS	Gebruik in stap 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin	Thermo Fisher Scientific	88221	Gebruik in stap 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing	BioDesign, Inc.	D306	Gebruik in stap 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 en 4.6.
Bovine Thrombin	BioPharm Laboratories, Inc.	SKU91-055	Gebruik in stap 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column	GE Healthcare, Inc.	17-5156-01	Gebruik in stap 3.11.
Glucose-5-MTS	Toronto Research Chemicals, Inc.	G441000	Gebruik in stap 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators	Sartorius, Inc.	VS2001	Gebruik in stap 3.11, 4.2, 4.5 en 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26630	Gebruik in stap 3.7, 3.10 en 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column	GE Healthcare, Inc.	17-5053-01	Gebruik in stap 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System	GE Healthcare, Inc.	29018224	Gebruik in stap 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer	Agilent Technologies, Inc.		Gebruik in stap 5.2 en 5.5.