Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne

8.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56325

⸱

12 oktober 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een fluorimetrische cel-vrije biochemische bepaling voor bepaling van de HDL-lipide peroxidatie. Deze snelle en reproduceerbare kwantitatieve analyse kan worden gebruikt om te bepalen van HDL functie in grootschalige studies en kan bijdragen aan ons begrip van HDL functie in ziekten bij de mens.

Samenvatting

Lage high-density lipoproteïne (HDL-C) cholesterolgehalte zijn een van de meest krachtige onafhankelijke negatieve voorspellers van atherosclerotische cardiovasculaire ziekte (CVD). De structuur en functie van HDL in plaats van HDL-C kunnen nauwkeuriger voorspellen atherosclerose. Verschillende HDL eiwitten en lipiden compositorische wijzigingen die afbreuk doen aan HDL functie optreden in inflammatoire toestanden zoals atherosclerose. HDL functie wordt meestal bepaald door cellen gebaseerde testen zoals cholesterol efflux assay maar deze testen hebben talrijke nadelen gebrek aan standaardisatie. Cel-gratis testen kunnen krachtiger maatregelen van HDL functie ten opzichte van cel-gebaseerde testen geven. HDL oxidatie schaadt HDL functie. HDL is een belangrijke rol in de peroxide lipidentransport en hoge hoeveelheid lipide-peroxiden is gerelateerd aan de abnormale functie van de HDL. Lipide-sonde interacties moeten worden beschouwd wanneer het interpreteren van de resultaten van de niet-enzymatische fluorescentie testen voor het meten van de lipide oxidatieve staat. Dit motiveerde ons een cel-vrije biochemische enzymatische methode voor de beoordeling van HDL lipide peroxidegehalte (HDLox) dat aan HDL dysfunctie bijdraagt te ontwikkelen. Deze methode is gebaseerd op het enzym horseradish peroxidase (HRP) en de fluorescerende Amplex rood dat (zonder cholesterol oxidase) de lipide peroxidegehalte per mg HDL-C. kwantificeren kan Hier is een protocol describedfor bepaling van de HDL-lipide peroxidatie waarbij de fluorescerende reagens gebruikt. Assay variabiliteit kan worden verminderd door strikte standaardisatie van experimentele omstandigheden. Hogere HDLox waarden worden geassocieerd met verlaagde HDL anti-oxidant functie. De uitlezing van deze bepaling wordt geassocieerd met uitlezingen van gevalideerde cel-gebaseerde tests, surrogaat maatregelen van hart-en vaatziekten, systemische ontstekingen, immuun disfunctie en bijbehorende risico van cardiovasculaire en metabole fenotypen. Deze technische aanpak is een robuuste methode te beoordelen van HDL functie in ziekten bij de mens waar systemische ontstekingen en oxidatieve stress geoxideerde vetten een belangrijke rol (zoals atherosclerose hebben).

Inleiding

Atherosclerotische cardiovasculaire ziekte (CVD) is de belangrijkste oorzaak voor overlijden wereldwijd1,2. Epidemiologische studies hebben aangetoond dat lage niveaus van high-density lipoproteïne (HDL) cholesterol over het algemeen omgekeerd geassocieerd met het risico voor de ontwikkeling van atherosclerose1,2 zijn. Hoewel verscheidene studies een atheroprotective rol voor HDL1,2 ondersteunen, is het mechanisme waarmee HDL de initiatie en de vooruitgang van atherosclerose verzwakt complexe 3,4. Dus is er gesuggereerd dat de complexe structuur en functie van HDL in plaats van absolute niveau atherosclerose 5,6,7,8nauwkeuriger kunnen voorspellen. Verschillende HDL eiwitten en lipiden compositorische wijzigingen die afbreuk doen aan HDL functie optreden in inflammatoire toestanden zoals atherosclerose. Deze i) verminderen de cholesterol efflux potentiële 9, ii) afname van de anti-inflammatoire en verhoging van de HDL-geassocieerde pro-inflammatoire eiwitten 6,7, iii) daling antioxidant factor niveaus en activiteit en HDLs mogelijkheid voor de remming van de oxidatie van Low Density lipoproteïne (LDLox)10 en iv) verhogen lipide butylhydroperoxide inhoud en redox activiteit (HDLox)9,11. Robuuste testen die evalueren van de functies van de pleotropic van HDL (zoals cholesterol efflux, antioxidant functie) kunnen aanvulling bepaling van HDL-HDL-C in de kliniek.

HDL functie wordt meestal beoordeeld door cel-gebaseerde methoden zoals de cholesterol efflux assay8,12,13,14. Deze methoden hebben grote beperkingen, met inbegrip van aanzienlijke heterogeniteit met betrekking tot de soorten cellen gebruikt, soort uitlezing gemeld, gebrek aan standaardisatie en storende effecten van triglyceriden 7,15. Deze nadelen opleveren moeilijkheden voor grote klinische studies16. Cel-gratis testen kunnen krachtiger maatregelen van HDL functie ten opzichte van cel-gebaseerde testen geven. De cholesterol efflux is een van de belangrijkste functies van HDL hebt, maar het kan alleen worden bepaald door de cel-gebaseerde testen. Andere benaderingen om HDL functie zoals proteomics17,18,19,20,21,22,23, 24 en cel-gebaseerde monocyt chemotaxis vitrotests van HDL functie 17,22,25 niet zijn gestandaardiseerd en kan niet worden gebruikt in grootschalige menselijke studies.

HDL is een belangrijke antioxidant atheroprotective effect5,6,7,8. De antioxidant functie van HDL is in aanwezigheid van LDL in vorige cel gratis fluorimetrische analyses 26vastgesteld. Deze biochemische fluorimetrische methoden van HDL anti-oxidant functie werden oorspronkelijk ontwikkeld door Mohamad Navab en Alan Fogelman en hun collega's-26. Hoewel veel menselijke studies deze methoden gebruikt hebben om te bepalen van HDL functie 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipide (HDL)-lipide (LDL) en lipide-fluorescerende interacties kunnen reproduceerbaarheid van deze cel gratis niet-enzymatische biochemische tests van HDL functie27,28beperken.

Recente interesse heeft gericht op de functionele gevolgen van HDL oxidatie die is het resultaat van oxidatie van lipiden en eiwitten binnen HDL 27,29,30. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat oxidatie van HDL schaadt HDL functie 27,29,30. HDL is een belangrijke rol in de peroxide lipidentransport en hoge hoeveelheid lipide-peroxiden is gerelateerd aan de abnormale functie van de HDL. Dus kan HDL lipide peroxidegehalte worden gebruikt om te bepalen van HDL functie 9,17,20,31 en gezien de bekende beperkingen van voorafgaande tests van HDL functie7, 15,27,32, ontwikkelden we een alternatieve fluorimetrische methode HDL lipide peroxidegehalte (HDLox) 32 kwantificeert. Deze methode is gebaseerd op het enzym horseradish peroxidase (HRP) en de fluorescerende Amplex rood dat de lipide peroxidegehalte per HDL-C 32mg (zonder cholesterol oxidase) kunnen kwantificeren. De biochemische principe van de test is afgebeeld in Figuur 1. We hebben aangetoond dat deze fluorescentie gebaseerde benadering niet over de beperkingen van de voorafgaande HDL functie tests27,28 beschikt. Deze bepaling is verder verfijnd en gestandaardiseerd in ons laboratorium, zodat het op betrouwbare wijze kan worden gebruikt in grootschalige menselijke studies zelfs met cryopreserved plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. de uitlezing van deze bepaling wordt geassocieerd met uitlezingen van gevalideerde cel-gebaseerde tests, surrogaat maatregelen van hart-en vaatziekten, systemische ontsteking, immuun disfunctie en bijbehorende risico van cardiovasculaire en metabole fenotypes 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. hier, beschrijven we deze eenvoudige, maar robuuste methode voor het meten van HDL lipide peroxidegehalte (HDLox). Deze test kan worden gebruikt als een instrument om belangrijke onderzoeksvragen met betrekking tot de rol van HDL functie in ziekten bij de mens te beantwoorden waar systemische ontstekingen en oxidatieve stress geoxideerde vetten hebben een belangrijke rol (zoals atherosclerose)32.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

alle experimenten met behulp van de menselijke biologische monsters werden uitgevoerd met goedkeuring van de ethiek aan de Universiteit van California Los Angeles, Los Angeles en het Comité van de menselijke ethiek van Alfred Hospital, Melbourne.

Opmerking: er zijn vele variaties van de fluorescerende HDL functie Assay (zie discussie) 32. Hieronder beschrijven we het protocol dat de meest consistente en reproduceerbare resultaten oplevert. Een overzicht van de bepaling is afgebeeld in Figuur 2.

1. verwerking van het specimen

  1. Gebruik verse, niet-hemolyzed serum (kan worden geïnd in serum scheidingsteken buizen) of citraat plasma verkregen na 12-14 uur vasten. Als met behulp van cryopreserved monsters, omvatten passende controlemaatregelen zoals beschreven in dit Protocol.

2. Dag 0-voorbereiding voor de assay

  1. voorbereiden werken lay-out van het experiment met de juiste besturingselementen, monsters en repliceert. Elk monster ten minste in triplicates uitgevoerd. Een lay-out goed vertegenwoordiger 96 is afgebeeld in Figuur 3.
  2. Berekenen alle volumes van de reagentia die zal worden gebruikt voor de bepaling op basis van aantal monsters en replicaten.
    Opmerking: Een extra 10% volumes opnemen in elk bestand werkend om ervoor te zorgen dat er genoeg volume voor elke reagens voor de specifieke experiment is.
  3. Alle benodigde buizen voor alle verschillende stappen van de assay BV voor de scheiding van HDL, meting van de HDL-C (optioneel) en het fluorochromeassay label.

3. Dag 1-voorbereiding van de controles

  1. voorbereiding van studie-specifieke gegroepeerde besturingselement
    1. maken een controlemonster van gebundelde plasma of serum van alle studie monsters. Als 20 voorbeelden uitvoeren in elke plaat in drievoud, combineren 10 µL van elk monster in een besturingselement 200 µL gebundeld. Een aparte hoeveelheid van deze gebundelde controle geven het klinisch laboratorium de HDL-C waarde van dit besturingselement te bepalen.
      Opmerking: Gebruik deze gebundelde controle om de bepaling te standaardiseren en rekening voor alle mogelijke bekende (b.v. type matrix serum versus plasma, cycli bevriezen-ontdooien, cryopreservatie) en onbekende verstrengeling die invloed kunnen hebben op de experimentele variabiliteit 27 , 28.
  2. Voorbereiding van de controle van de kwaliteit van de laboratorium-specifieke (QCs)
    1. bereiden een grote voorraad van HDL in elk laboratorium (bijvoorbeeld HDL geïsoleerd van 5 mL plasma van 10 gezonde donoren) en verschillende hoeveelheden van dit cryopreserve voorraad te minimaliseren cycli bevriezen-ontdooien.
    2. Gebruik ten minste 10 verschillende repliceert uit deze voorraad om te bepalen van de gemiddelde waarde van HDLox. Een acceptabel bereik liggen van de gemeten HDLox waarden voor elk monster van de QC opgenomen in elke bepaling is binnen < 15% van de variatiecoëfficiënt van deze gemiddelde waarde.
    3. Geven een aparte hoeveelheid van deze gebundelde controle aan het klinisch laboratorium om te bepalen van de HDL-C waarde van dit besturingselement (bijvoorbeeld 40 mg/dL).
      Opmerking: Een gedetailleerde aanpak van het gebruik van bloed van bloedbanken om deze besturingselementen te maken eerder geweest beschreven 27 , 28 , 32. Gebruik extra QCs zo nodig (bv ene een gezonde donor bekend dat normale HDL-functie en een van een donor bekend dat grotendeels abnormale functie van de HDL.
  3. Optimalisatie van achtergrond signaal en lege waarden (optioneel)
    1. te minimaliseren achtergrond, voeg de juiste hoeveelheid katalase (1-4 U/mL) in het incubatie-medium voor het snel verwijderen van het gevormde H 2 O 2 als gevolg van spontane lucht oxidatie van de buffers.
      Opmerking: Aangezien de waarden uit de lege putten (geen HDL) zijn wordt afgetrokken van de waarden van de HDL-monsters en de resultaten worden gerapporteerd ten opzichte van een gebundelde controle (die is opgenomen in de dezelfde 96 goed plaat), we hebben gevonden dat deze stap niet praktisch bren doet t de resultaten. Dus, optimalisatie van het signaal van de achtergrond met katalase kan worden weggelaten, indien nodig.

4. Dag 1-scheiding van HDL Cholesterol HDL neerslag met

Opmerking: gebruik van een commercieel beschikbare gestandaardiseerde HDL Cholesterol neerslagmiddel reagens te isoleren van apoB uitgeput serum volgens de fabrikant ' s instructies. Deze reagentia worden veel gebruikt in colorimetrische testen om te bepalen van de HDL-cholesterolgehalte.

  1. Plasma of serum monster vers gebruiken (of ontdooien).
  2. Meng gelijke delen (bijvoorbeeld 80 µL) van plasma en HDL Cholesterol Precipiterend reagens (20% w/v polyethyleenglycol in glycine buffer met een pH van 10.0 (25 ° C)).
  3. Mix goed door omhoog en omlaag pipetteren.
  4. Centrifugeer bij 1000-2000 x g gedurende 10 minuten
  5. Gecombineerd het supernatant (HDL-Fractie).
  6. Idealiter gebruik onmiddellijk de geïsoleerde HDL voor de fluorochromeassay van HDL lipide peroxidatie. Echter als verschillende monsters worden uitgevoerd in dezelfde dag en andere stappen, zoals meting van de concentratie van HDL-cholesterol ook worden uitgevoerd, dan slaan de geïsoleerde HDL bij 4 ° C en de volgende dag gebruiken voor de functie van fluorochromeHDL Assay.

5. Dag 1-Determination of HDL-C in geïsoleerde HDL

Opmerking: dit is optioneel als de waarde van de HDL-C van het klinisch laboratorium door HDL-C bedrag wordt gebruikt om te normaliseren HDLox.

  1. Quantify de HDL-cholesterol uit plasma, met behulp van standaard colorimetrische 27 testen. Voeg 50 µL van Cholesterol reagens in elk putje en bepalen de cholesterol concentratie met behulp van een colorimetrische afleesapparaat en een cholesterol standaard voorzien in elke kit.

6. Dag 2-bereiding van reagentia

  1. HRP bereiden en cholesterol oplossingen van HRP 5 U/mL oplossing (Range 1-10 U/mL).
  2. Bereiden 20 mM fluorescerende (bijvoorbeeld Amplex rood) oplossingen: een flacon van fluorescerende reagens en DMSO op kamertemperatuur ontdooien. Vóór gebruik, ontbinden fluorescerende reagens (1 mg) in 200 µL van DMSO. Opslaan van de stockoplossing bevroren op ≤-20 ° C, beschermd tegen licht.
  3. Bereiden van positieve en negatieve controles: gebruik 1 X ' reactie buffer ' zonder cholesterol en 20 mM H 2 O 2 werkoplossing als een negatieve en positieve controles, respectievelijk.

7. Dag 2-fluorescerende Assay

  1. toevoegen 50 µL van 1 x reactie buffer als blanco (negatieve controle).
  2. Optioneel: 20 mM werkende oplossing van H 2 O 2 toevoegen als positieve controle in elke plaat.
  3. Minimaliseren van experimentele variabiliteit en ervoor zorgen dat toevoeging van reagentia en monsters consequent zijn gedaan en in een tijdig, het uitvoeren van alle toevoegingen voor samples in een afzonderlijke 96 goed ronde onderkant, zuivere, polystyreen of polypropyleen plaat (plaat 1). Gebruik vervolgens een meerkanaalspipet overbrengen van bepaalde volumes naar 3 96-wells-platen (2-4 platen: polypropyleen, platte botTom, zwart) (die hebben dezelfde lay-out) ( Figuur 2, Figuur 3).
    1. Bijvoorbeeld eerst het toevoegen van 160 µL van geïsoleerde HDL in elk goed/monster van plaat 1 en vervolgens met behulp van een meerkanaalspipet Breng 50 µL van HDL-cholesterol van elk goed/monster in de zwarte 96-wells-platen. Tips tussen elke rij/kolom wijzigen niet gefiltreerd geboden tips te gebruiken voor alle overdrachten.
  4. Verlaten monsters in de putjes. Gooi niet. Er zijn geen wassen stappen tussen toevoeging van reagentia.
  5. Toevoegen 50 µL van HRP oplossing 5 U/mL (0,25 U) aan elk putje.
    NB: Gebruik HRP vóór de toevoeging van het fluorescerende reagens.
  6. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Gooi niet monsters na incubatie (geen wassen stappen tussen toevoegingen van reagentia).
  7. Toevoegen 50 µL van fluorochromereagent voor een eindconcentratie van 300 µM. Op dit punt, de totale reactie volume is 150 µL. Meng goed en beschermen tegen licht.
  8. Beoordelen de fluorescerende uitlezing (in het donker) elke minuut meer dan 120 minuten bij 37 ° C met een fluorescerende afleesapparaat (530/590 nm filters).
    Opmerking: Gebruik een korter interval van 60 minuten met verse monsters. We hebben gevonden dat 120 minuten durende test geeft meer reproduceerbare gegevens met het gebruik van cryopreserved monsters.
  9. Opnemen van gegevens met behulp van geschikte software.

8. Dag 3-Data analyse

  1. fluorescentie (willekeurige eenheden) opnemen op 120 minuten na toevoeging van het fluorescerende reagens voor alle monsters met inbegrip van lege wells en alle besturingselementen.
  2. Berekening van de gemiddelde waarde van fluorescentie eenheden (op basis van ten minste triplicates) (HDL ox_sample). Neem geen uitschieters (> 2 SDs van de gemiddelde waarde) in aanmerking.
  3. Aftrekken de achtergrond fluorescentie met behulp van de volgende vergelijking:
    figure-protocol-1
  4. normalisatie voor HDL cholesterol (HDL-C): de HDLox lipide peroxidatie waarde voor elk monster (met inbegrip van het gegroepeerde besturingselement) normaliseren door de HDL-C) (mg/dl). Via de sectie voor resultaten, wordt HDL ox gepresenteerd als n (HDL-C) HDLox maatregel aan de aanpassing voor HDL-C. De volgende vergelijking gebruiken:
    figure-protocol-2
  5. standaardiseren van de expressie van HDLox lipide peroxidatie waarde van elk monster tegen de waarde van een gebundelde controle. Normaliseren de n (HDL-C) HDLox lipide peroxidatie waarde voor elk monster (gecorrigeerd voor HDL-C) door de n (HDL-C) HDLox lipide peroxidatie waarde van het gegroepeerde besturingselement. Via de sectie voor resultaten, wordt HDL ox gepresenteerd als nHDL ox maatregel aan de aanpassing voor experimentele variabiliteit en HDL-C. De volgende vergelijking gebruiken:
    figure-protocol-3
    Opmerking: deze benadering is vergelijkbaar met andere gevestigde experimentele benaderingen om experimentele variabiliteit van metingen, zoals International genormaliseerd ratio (INR) 44 , 45. Deze aanpak is gevalideerd in klinische studies 32 , 33 , 34 , 35, , 36 , 37 , 38 , 39.
  6. kwaliteitscontrole van experimentele resultaten met behulp van standaard kwaliteit controlemonsters uitvoeren. Elk laboratorium dient zijn eigen kwaliteitscontroles (QCs) vastgesteld. Ideaal is er een QC voor nHDLox uit een monster met bekende disfunctionele HDL en een QC voor nHDLox uit een monster van gezonde donoren [bv gebruik gepoolde monster van jonge volwassenen die zijn gevestigde bloedbank donoren en hebben geen bekende comorbiditeit en risicofactoren voor hart-en vaatziekten met inbegrip van rookvrije]. Het laatste besturingselement standaardiseert resultaten tussen verschillende laboratoria. De gemiddelde waarden van deze QCs zijn vastgesteld op basis van ten minste 5 wordt gerepliceerd (meestal gebruiken we 10 replicatieonderzoeken voor deze belangrijke stap).
    1. Check of gemeten QCs in elke assay hebben waarden binnen het verwachte bereik van waarden. Uitgaande van een aanvaardbare maximale experimentele variabiliteit van 15%, moeten alle gemeten experimentele waarden vallen binnen 15% van de bekende gemiddelde waarden van gevestigde QC. De volgende vergelijkingen gebruiken:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
      Opmerking: als een van de meegeleverde kwaliteitscontrole monsters () normaal versus disfunctionele HDL) geeft HDLox waarden buiten verwachte bereik (opgericht in elk laboratorium) dan herhaal het experiment.
  7. Uitvoeren van kwaliteitscontrole van experimentele resultaten met behulp van de variatiecoëfficiënt (CV) te kwantificeren van experimentele variabiliteit: Herhaal alle monsters met AVK % > 15%. De volgende vergelijking gebruiken:
    figure-protocol-6
    Opmerking: een typische intra-assay (binnen de dezelfde plaat) en de Inter assay (onder verschillende platen) experimentele variabiliteit is < 15%. 2) een typische intra-assay CV is tussen 1-7% en een typische interassay CV tussen 3-10 ligt %.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

50 µL van elk monster HDL worden toegevoegd aan elk putje zoals in stap 7.3. 50 µL van HRP oplossing 5 U/mL (0,25 U) zijn vervolgens toegevoegd aan elk putje zoals in stap 7.5. Monsters worden gedurende 30 minuten bij 37 ° C als in stap 7.6 geïncubeerd. 50 µL van fluorescerende reagens worden vervolgens toegevoegd in elk putje zoals in stap 7.7 (eindconcentratie van 300 µM). De fluorescerende uitlezing (in het donker) wordt vervolgens beoordeeld voor elke minuut meer dan 120 minuten bij 3...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol hier beschreven biedt een krachtige tool om belangrijke onderzoeksvragen met betrekking tot de rol van HDL functie in atherosclerose en ziekten bij de mens te beantwoorden. De assay kwantificeert de HDL lipide-peroxidegehalte per mg HDL-C met behulp van enzymatische versterking (HRP). Deze aanpak voorkomt bekende beperkingen van voorafgaande HDL functie tests (bv de cholesterol efflux assay) met inbegrip van aanzienlijke heterogeniteit met betrekking tot de soorten cellen gebruikt, soort uitlezing gemeld, ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Dit protocol en de kwantitatieve analyse zijn relevant voor de patent PCT/US2015/018147.

Dankbetuigingen

De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor het werk van Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman en Srinivasa Reddy voor hun sleutelrol in de ontwikkeling van eerdere iteraties van dit model. T.A.A. wordt ondersteund door een RMIT University Vice-kanselier van postdoctorale Fellowship. AJ en AH worden ondersteund door NHMRC projectsubsidie 1108792. TK wordt ondersteund door NIH grants NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Experimentele Reagentia
HDL PEG (Polyethyleen Glycol) Precipiterend ReagensPointe ScientificH7511
Amplex Red reagens.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Bewaar in een droge plaats
• Beschermen tegen licht
DMSO.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Bewaar in een droge plaats
• Beschermen tegen licht
Paardenradijs Peroxidase (HRP)Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Bewaar in een droge plaats
• Beschermen tegen licht
Cholesterol Esterase.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Bewaar in een droge plaats
• Beschermen tegen licht
Cholesterol ReferentiestandaardLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Bewaar in een droge plaats
• Beschermen tegen licht
Resorufin fluorescentie ReferentiestandaardLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Bewaar in een droge plaats
• Beschermen tegen licht
5x Reactie Buffer.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Bewaar in een droge plaats
• Beschermen tegen licht
HDL Cholesterol Geautomatiseerd ReagensThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.TR39601
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kunststof gereedschap
96-well platen (polypropyleen, platte bodem, helder).Sigma AldrichM0687
96-well platen (polypropyleen, platte bodem, zwart).Sigma AldrichM9936
1.5 mL Eppendorf buisjesEppendorf0030 125.150
ClipTip 200, sterielThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.14-488-058
Thermo Scientific Multikanaals Pipetten, 8-kanaals, 125 ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-387--955
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Software
Gen5 2.01 softwareBiotek, Vermont, USANA
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
Gen5 Plate readerBiotek, Vermont, USANA

Referenties

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367(2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87(2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716(2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23(2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342(1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Lipidperoxidatie assayCelvrije biochemische assayFluorometrische enzymatische methodePaardenlokraamperoxidaseAmplex Red reagensFluorescente platenlezerHDL lipidperoxidegehalteHDL functiemetingHDL oxidatieanalyse
Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.