De Organoid reconstitutie Assay (ORA) voor de functionele analyse van intestinale stam en Niche cellen

Samenvatting

Intestinale organoid culturen van hele crypten gevestigd zijn en laat niet de analyse van zelf-vernieuwing en differentiatie in een cel-specifieke mode. Dit protocol beschrijft reconstitutie van gesorteerde stengel (Lgr5⁺) en niche (Paneth) cellen, die aanleiding tot organoids geven terwijl het toelaten van hun voorafgaande biochemische en genetische modificatie en de functionaalanalyse.

Samenvatting

Het intestinaal epitheel wordt gekenmerkt door een zeer snelle Verwerkingsfrequentie. Bij zoogdieren, wordt de gehele epitheliale bekleding vernieuwd binnen 4-5 dagen. Volwassen intestinale stamcellen bevinden zich aan de onderkant van de crypten van Lieberkühn, door de expressie van het Lgr5 -gen zijn bestemd en homeostase via hun karakteristieke proliferatieve hoog¹behouden. In de dunne darm, Lgr5⁺ stamcellen zijn vermengd met gespecialiseerde secretoire cellen genaamd Paneth cellen. Paneth cellen afscheiden van antibacteriële stoffen (d.w.z., lysozym en cryptdins/defensinen) en het uitoefenen van een controlerende rol op de darmflora. Meer onlangs, is een nieuwe functie voor Paneth cellen, namelijk hun capaciteit niche steun bieden aan de cellen van de stam van Lgr5⁺ door middel van verschillende belangrijke liganden zoals Wnt3, EGF en Dll1²ontdekt.

Als ex vivo geïsoleerd en in aanwezigheid van bepaalde groeifactoren en componenten van de extracellulaire matrix gekweekt, hele intestinale crypten aanleiding geven tot langlevende en zelf vernieuwen 3D structuren genoemd organoids die sterk lijken op de crypt-villosités epitheliale architectuur van de volwassen dunne darm³. Organoid culturen, als tot stand gebracht van hele crypten, toestaan dat de studie van zelf-vernieuwing en differentiatie van de intestinale stamcel niche, maar zonder een aanpak van de bijdrage van de afzonderlijke onderdelen, namelijk de Lgr5⁺ en Paneth cellen.

Hier beschrijven we een nieuwe benadering voor de organoid-bepaling die van de mogelijkheid van Paneth profiteert en Lgr5⁺ cellen vormen van organoids te koppelen wanneer mede gekweekt. Deze aanpak, aangeduid als de "organoid reconstitutie assay" (ORA), kan de genetische en biochemische wijziging van Paneth of Lgr5⁺ stamcellen, gevolgd door reconstitutie in organoids. Als zodanig, maakt het de functionele analyse van de twee belangrijkste componenten van de intestinale stamcel niche.

Inleiding

Het intestinaal epitheel is is het snelst zichzelf vernieuwende weefsel in het lichaam van zoogdieren en, als zodanig, het object van een overvloed aan studies gericht op de identificatie en functionele karakterisering van de volwassen stamcellen, wonende aan de onderkant van de crypte van Lieberkühn, gereserveerde door expressie van het Lgr5 -gen en afhankelijk van de canonieke Wnt signalen¹. Met name zijn de cellen van de stam van de Lgr5⁺ geflankeerd en ondersteund door gespecialiseerde niche cellen, d.w.z. de Paneth cellen, die ook afhankelijk zijn van de Wnt signalering voor hun rijping². Samen, deze twee celtypes ten grondslag liggen aan de zelf-vernieuwing van de epitheliale darmwand en het dagelijkse homeostatische evenwicht bewaren: Lgr5⁺ stamcellen snel verdelen en aanleiding geven tot voorlopercellen en meer gespecialiseerde intestinale epithelial cellen; Paneth cellen essentiële niche factoren (bijvoorbeeld, Dll1, Wnt3, EGF) geven Lgr5^{+ 2}van de cellen van de stam. De capaciteit van intestinale crypten wanneer vergulde ex vivo vormen van georganiseerde en zichzelf vernieuwend structuren organoids, of "mini-guts", genoemd als een experimenteel hulpmiddel om inzicht in processen zoals zelf-vernieuwing is benut en differentiatie in normale en pathologische omstandigheden waaronder kanker⁴. Organoid culturen zijn verschillende weefsel, met inbegrip van de darm, de alvleesklier, de lever, en de nier, zowel muis als menselijke specimens⁴vastgesteld. De extractiemethode en de groeifactoren werkzaam te ontwikkelen deze organoid culturen zijn weefsel-specifieke en ontworpen om te rijden meerdere lineage differentiatie en bootsen zo dicht mogelijk de oorspronkelijke cel van de stam-niche in vivo. Organoids wellicht potentiële toepassingen met inbegrip van de behandeling van genetische ziekten, de beoordeling van de therapeutische werking in kanker, de analyse van de drug toxiciteit of de studie van de organogenese in vitro⁵.

De belangrijkste beperking van organoid culturen als van weefselmonsters tot stand gebracht is over het algemeen een gebrek cel-specificiteit. Bijvoorbeeld, intestinale organoids vastgesteld van hele intestinale crypten niet toestaan de analyse van individuele cellulaire componenten omvatte binnen de bron van het weefsel (bvhele crypten bevatten Lgr5⁺, Paneth, en voorlopercellen).

Hier beschrijven we een nieuwe methode, hierna aangeduid als ORA, die de voordelen van intestinale organoid culturen met de functionele analyse van de meest fundamentele onderdelen, namelijk stam (Lgr5⁺) en niche (Paneth) cellen combineert. Dit wordt bereikt door het unieke vermogen van Paneth en Lgr5⁺ cellen om fysiek te koppelen aan elkaar wanneer mede geïncubeerd en aanleiding tot organoids^{2,6,10 geven}. Wij maakte gebruik van deze functie en vooraf behandeld de twee celtypes individueel alvorens deze te reconstrueren organoids. Daarbij elk onderdeel van de cel kan worden blootgesteld aan bepaalde drug, groeifactor, biochemische remmer, genetische modificatie, of chemische behandeling voorafgaand aan de reconstructie en de vorming van de organoid. Met behulp van de ORA bepaling staat dan ook toe de bepaling van de vraag of een specifieke medicamenteuze behandeling of genetische modificatie een bepaald effect op de cellen van de stam of de wederpartij van hun niche heeft.

Protocol

Alle procedures werden gedaan volgens lokale dierenwelzijn wetten en richtlijnen.

1. voorbereiding van de instrumenten, cultuurmedia en gerechten

1. Autoclaaf 1 set van intestinale schaar, normale schaar en pincet in een steriele container.
2. Plaats een 96-Wells (platte bodem) schotel in een incubator bij 37 ° C.
3. 10 mL van volledige voedingsbodem voor te bereiden met de reagentia die zijn vermeld in tabel van materialen.
4. Incubeer het volledige medium bij 37 ° C in een waterbad.
5. Ontdooi gereconstitueerde kelder membraan door deze te plaatsen in een ijsemmer. De gereconstitueerde kelder membraan wordt vloeibaar bij 4 ° C zijn.
6. Vul de 4 petrischalen met koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing of afgekort PBS (4 ° C).

2. isolatie van kleine intestinale crypten

1. Offeren bij CO₂ inademing een muis - eGFP-IRES-CreER^t2 Lgr5op een C57BL6/J-achtergrond. Ontleden van het buikvlies lengterichting met een schaar.
2. Houd de maag met de pincet en snijd het textielgedeelte in tweeën.
3. Met behulp van de intestinale schaar van nu af aan, trek de darm en plaatst u deze in een petrischaal met PBS.
   Opmerking: Intestinale schaar hebben een scherpe en een botte tip. Het botte uiteinde van deze schaar is bedoeld om de crypt-villosités architectuur niet te beschadigen tijdens het openen van de darm.
4. Start door het plaatsen van het botte uiteinde in de maag en duw het voorzichtig door de pylorus. Ga door met de schaar af te snijden en trekken met de pincet.
5. Zodra de hele dunne darm lengterichting wordt geopend, het wassen in koud PBS positie houden met de pincet en spoel het zachtjes in de PBS-oplossing met U-vormige bewegingen.
6. Zodra alle restanten van de ontlasting zijn uitgeschakeld, gaat u verder met het afvlakken van de darm op een snijplank, luminal kant naar boven. De luminal kant is gemakkelijk te herkennen door het ontbreken van bloedvaten en door zijn bleke verschijning in vergelijking met het buitenste gedeelte.
7. Met een glasplaatje, zachtjes de villi door schrapen de afgevlakte darm te verwijderen. Voer deze stap tweemaal over de gehele lengte van het weefsel.
8. Snijd de dunne darm met een steriele chirurgische mes in stukken van 2-5 mm.
9. Plaats de kleine intestinale fragmenten in een tube van 50 mL met 10 mL ijs koud PBS.
10. Reinig de weefsel fragmenten, verwijderen van alle resterende onzuiverheden waarbij ze op en neer in de PBS. Vloeistof wordt weggeworpen en herhaal deze stap totdat de PBS volledig duidelijk is.
11. Voeg toe 15 mL koude PBS, om de totale eindvolume van PBS tot 25 mL. Voeg 2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en incubeer gedurende 45 minuten op een roller bij 4 ° C.
12. Gooi de PBS/EDTA.
13. Voeg 10 mL PBS en loskoppelen van de crypten hard waarbij de fragmenten van het weefsel op en neer (ten minste driemaal). De bovendrijvende vloeistof te verzamelen.
14. Herhaal stap 2.13 vier keer. Voeg kweekmedium te bereiken een eindvolume van 50 mL.
15. Pellet de cellen door middel van centrifugeren (300 x g gedurende 5 minuten).
16. Resuspendeer de pellet in 10 mL gestolde voedingsbodem- and -pellet de crypten door middel van centrifugeren (80 x g gedurende 3 minuten).

3. eencellige voorbereiding

1. Verwijder het supernatant van de Ingehuld crypten en resuspendeer hen in 1 mL trypsine achtige-enzymen samen met 50 µL DNAse (50 µg/mL).
2. Incubeer de cellen in een waterbad bij 32 ° C gedurende 2 minuten.
3. Voeg 10 mL gestolde voedingsbodem. De crypten distantiëren in afzonderlijke cellen door hard pipetteren omhoog en omlaag minstens 5 keer.
4. Filtreer de oplossing door een zeef 40 µm (te elimineren bosjes en andere verontreinigingen)- and -pellet van de afzonderlijke cellen bij 300 x g gedurende 5 min.

4. Stroom Cytometry en beplating

1. 50 mL 1 x Henks gebufferde zoutoplossing of HBSS/2% foetale koe serum (FCS) oplossing voor te bereiden en resuspendeer de pellet in 1 mL voor elke 10⁶ cellen
2. Voeg toe aan de celsuspensie BV421 Lin^- (CD31, CD45, TER119) met een concentratie van 1:100, en CD24-APC en CD117-PE zowel bij een concentratie van 1:250 antilichamen voor 30 min.
3. Sorteren Lgr5⁺ stamcellen en Paneth cellen in aparte laag binden buizen. Voor meer informatie over het sorteren van protocollen voor Lgr5⁺ en Paneth cellen, zie Roth et al. ⁷ en Schewe et al. ⁶
   1. De gesorteerde cellen bij 300 x g gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in 100 µL medium met de onderdelen beschreven in 1.3 centrifuge (Zie de Tabel van de materialen).
4. De Paneth cellen (bijvoorbeelddoor chemische of genetische modificatie) te behandelen (n = 2000) of de cellen van de stam van de Lgr5⁺ (n = 2000).
   1. Voor de behandeling van cellen, 5 µL van liposoom-gemedieerde transfectiereagens te gebruiken in een totaal volume van 100 µL cultuurmedium en Klein Mengend RNA (siRNA) met een concentratie van 100 nM. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C voor siRNA of voor de tijd die nodig is voor de gekozen wijziging.
5. Wassen van de cellen tweemaal in 500 µL cultuurmedium.
6. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en resuspendeer de cellen in 10 µL cultuurmedium.
7. Zwembad de twee cellulaire componenten (Paneth of Lgr5⁺ cellen) in een 20 µl totale volume en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
8. Incubeer mede de Paneth en Lgr5⁺ cellen voor 10 min op RT.
9. 10 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen en laat een meniscus van vloeistof om zeker te zijn niet gecombineerd de cel-pellet.
10. Voeg 30 µL van gereconstitueerde kelder membraan naar de cellen voor een totaal volume van 40 µL en resuspendeer de cellen plaat in een voorverwarmde 96 goed bord. Na 10 min, voeg 200 µL van volledige medium (Zie de Tabel van de materialen). Verandering medium elke 48 uur.
11. Graaf organoid multipliciteit bij dag 5.

Resultaten

De bepaling van de reconstitutie organoid kunt de aparte functionele analyse van de essentiële onderdelen van de niche en cel van de stam van het intestinaal epitheel, hier gedemonstreerd door Klein Mengend RNA (siRNA) van de Apc -gen.

Dit om doel te bereiken, we eerst fluorescerende geactiveerde cell sorting (FACS) om te scheiden van 8000 Lgr5⁺ cellen en 6000 Paneth cellen van ingeteelde C57BL6/J-mu...

Discussie

De ORA kunt de verfijnde functionele analyse van de twee wezenlijke basiscomponenten van de intestinale stamcel niche, namelijk Lgr5⁺ en Paneth cellen. Deze aanpak heeft eerder gewerkt door ons en anderen met lichte wijzigingen^6,10,11. Hier presenteren we de ORA-procedure als een reproduceerbare en gestandaardiseerde laboratorium protocol. Ook wij rapporteren over de gevolgen van Apc Downregulatie in...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Eindconcentratie: 10 mM
Penicillin/streptomycin *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Eindconcentratie: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Eindconcentratie: 10 mM
Recombinant murine EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Eindconcentratie: 50 ng/ml
Recombinant murine Noggin *	Peprotech	250-38	Eindconcentratie: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Eindconcentratie: 10 µM
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Eindconcentratie: 1 µM
Recombinant murine R-spondin *	R&D systems	3474-RS-050	Eindconcentratie: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	Eindconcentratie: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend	102424
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Low binding tubes	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* De combinatie van deze reagentia vormt het volledige kweekmedium