Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

Summary

Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.

Abstract

De pulmonaire metastase assay (PuMA) is een ex vivo Long explant en gesloten celcultuur waarmee onderzoekers om te bestuderen van de biologie van longkanker kolonisatie in Osteosarcoom (OS) door fluorescentie microscopie. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van het protocol, en voorbeelden van het verkrijgen van afbeeldingsgegevens op metastatische groei met widefield of confocal fluorescentie microscopie platformen. De flexibiliteit van het model van de PuMA toelaat onderzoekers bestuderen van niet alleen de groei van OS cellen in de longen-communicatie, maar ook voor het beoordelen van de effecten van anti-metastatische therapeutics na verloop van tijd. Confocale microscopie zorgt voor ongekende, high-resolution beeldvorming van OS cel interacties met de Long parenchym. Bovendien, wanneer de PuMA model wordt gecombineerd met fluorescente kleurstoffen of TL proteïne genetische verslaggevers, onderzoekers kunnen bestuderen de Long-communicatie, cellulaire en subcellular structuren, genfunctie en promotor activiteit in uitgezaaide cellen van het OS. De PuMA-model biedt een nieuw hulpmiddel voor Osteosarcoom onderzoekers om te ontdekken van nieuwe metastase biologie en de activiteiten beoordelen van nieuwe anti-gemetastaseerd, gerichte therapieën.

Introduction

Verbeterde resultaten voor pediatrische patiënten met metastatische Osteosarcoom (OS) blijft een kritische unmet klinische behoefte ¹. Dit onderstreept het belang van de ontwikkeling van nieuwe moleculair-gerichte therapieën. Conventionele chemotherapeutica dat doel tumor celproliferatie hebben niet bewezen effectief bij de behandeling van uitgezaaide ziekte, en zo nieuwe strategieën moeten richten op het metastatische proces zelf ². Het huidige artikel behandelt de praktische aspecten van een relatief nieuw soort ex vivo Long metastase model, de pulmonaire metastase assay (PuMA) ontwikkeld door Mendoza en collega's³, waarmee een nuttig instrument in het ontdekken van nieuwe moleculaire bestuurders in Long metastase progressie in OS ^4,5. Voordat u verdergaat, echter, zou het verstandig zijn kort ingaan op de verschillende huidige modellen van metastase, en hoe de PuMA model biedt diverse voordelen ten opzichte van conventionele in vitro testen.

Meest experimentele modellen gebruikt bij het bestuderen van metastase bestaan uit in vitro en in vivo systemen die een specifieke handeling of verschillende stappen van de metastatische cascade recapituleren. Deze stappen omvatten: 1) de tumorcellen migreren uit de buurt van de primaire tumor, 2) intravasation in nabijgelegen vaartuigen (bloed- of lymfestelsel) en doorvoer in omloop, 3) arresteren op het secundaire site, de 4) extravasation en de overleving op de secundaire site, 5) vorming micrometastasen, en 6) groei in gevacuoliseerd metastasen (Figuur 1). In vitro modellen van metastase 2-dimensionale (2D) migratie kunnen opnemen en 3-dimensionale (3D) Matrigel invasie testen die zijn herzien in detail elders ⁶. Voor in vivo modellen, de twee meest gebruikte modelsystemen omvatten: 1) de spontane metastase model is waarbij een tumorcellen orthotopically geïnjecteerd in een specifieke weefseltype te vormen van een lokale tumor die spontaan uitgezaaide cellen werpt naar verre locaties; 2) het experimentele metastase model is waar tumorcellen worden ingespoten in het bloedvat stroomopwaarts van de doel-orgel. Bijvoorbeeld, een staart veneuze injectie van tumor cellen leidt tot de ontwikkeling Long metastasen^5,7,8. Andere experimentele metastase modellen zijn injectie van tumorcellen in de milt of lymfklieren ader wat in de ontwikkeling van lever metastasen^{9,10 resulteert}. Praktische overwegingen van deze in vivo modellen worden in detail besproken door Welch ¹¹. Een andere in vivo model gebruikt bij het bestuderen van metastase in pediatrische sarcomen is het renale nier subcapsular tumor implantatie model, wat in de vorming van lokale tumor en spontane metastase voor de longen ^{12,13 resulteert}. Een meer technisch veeleisende techniek zoals intravital videomicroscopy kan direct visualiseren, in real-time, interacties tussen metastatische kankercellen en de microvasculature van een metastatische site (dwz. longen of lever) zoals beschreven door MacDonald¹⁴ en Entenberg¹⁵, of kanker cel extravasation in het chorion membraan zoals beschreven door Kim, ¹⁶.

De PuMA-model is een ex vivo, Long weefsel explant, gesloten cultuur systeem waar de groei van fluorescerende tumorcellen lengterichting waarneembaar via fluorescentie microscopie gedurende een periode van een maand (Zie figuur 2A). Dit model recapituleert de aanvankelijke stadia van longkanker kolonisatie (stappen 3 tot en met 5) in de gemetastaseerde cascade. Enkele belangrijke voordelen van de PuMA model ten opzichte van conventionele in vitro modellen zijn: 1) het biedt een kans om de lengterichting meten metastatische kanker-celgroei in een 3D communicatie die heeft veel kenmerken van de Long communicatie behouden vivo ³; 2) puMA kan de onderzoeker om te beoordelen of het knockdown van een kandidaat-gen of drug behandeling anti-metastatische activiteit in het kader van een 3D Long communicatie heeft; 3) de PuMA model is flexibel met vele soorten fluorescentie microscopie platforms (figuur 2B) zoals widefield fluorescentie microscopie of laser-scanning confocal microscopie, worden voorbeelden van elk weergegeven in figuur 2C & O, respectievelijk. Dit artikel zal bespreken hoe de PuMA model kunt verkrijgen van longitudinale imaging gegevens over de metastatische groei van verbeterde groen fluorescent proteïne (eGFP)-uiten, menselijke hoge en lage metastatische Osteosarcoom cellen (cellen met MNNG en HOS, respectievelijk) met behulp van lage-vergroting widefield fluorescentie. Voorbeelden van imaging een fluorescente kleurstof waarmee de Long parenchym de labels, en een rood-fluorescerende eiwit genetische verslaggever waarmee labels mitochondriën in OS cellen in het model van de PuMA met behulp van confocale laser scanning microscopie worden ook besproken.

Protocol

Alle dierlijke protocollen waaruit imaging gegevens werden verkregen werden uitgevoerd met goedkeuring van de Animal Care en gebruik van het Comité van het National Cancer Institute, National Institutes of Health. Alle dierlijke protocollen besproken en afgebeeld in het artikel video zijn door de University of British Columbia dierlijke zorg Comité goedgekeurd.

1. voorbereiding van tumorcellen injectie en materialen voor het model van PuMA

Opmerking: Het bedrag van oplossingen en cellen worden genoeg voor 1 muis. Schaal omhoog als dit nodig is als er meer muizen worden gebruikt in de studie. Voor media recepten, verwijzen naar de tabel 1 en tabel 2.

1. Vooraf warm 5 mL voor A-Media in een conische tube van 15 mL in een waterbad 37 ^oC.
2. Smelt de 1,2% lage smeltende agarose oplossing (in steriel water) met behulp van de lab-magnetron.
3. Pipetteer 5 mL van de gesmolten agarose in een conische tube van 15 mL, en houd warm in een waterbad 37 ^oC. Zorg ervoor de gesmolten agarose op 37 ^oC en vloeibaar voorafgaand aan de Long toediening stap.
4. Vooraf chill 30 mL van celkweek rang PBS aangevuld met 1 X pen/strep in een ijsemmer.
5. In een put van een 6-well plaat, week vooraf een spons van de gelatine in 1,5 mL voor B-media. De spons zullen het anker van de steun voor de Long-segmenten.
6. Controleer de OS cellen ongeveer 70-90% confluente op de dag van de procedure. Gebruik geen cellen die overmatige heuvels of als de media oranje is naar geel omdat de cellen meestal onderstreept zijn en levensvatbaarheid op dit punt zijn afgenomen. Voor de Osteosarcoom cellijnen, MNNG en HOS, zal 5 x 10,⁵ in een volume van 100 μl worden gebruikt om te injecteren in de ader van de staart van 1 muis. Upscale dienovereenkomstig indien meer muizen worden gebruikt voor de studie.
7. Het oogsten van de tumorcellen met behulp van 0,25% trypsine-EDTA (3 mL voor een T75 kolf of 2 mL in een 10 cm cultuur schotel). Wanneer cellen beginnen te heffen uit de plaat, neutraliseren de trypsine-EDTA met volledige media. Spin down cellen en spoel eenmaal met celkweek rang PBS. Resuspendeer de pellet in 5 mL PBS.
8. Het uitvoeren van een telling van de cel door standaardmethoden. Het is het beste te maken van meer celsuspensie dan eigenlijk nodig is aangezien het verlies van celsuspensie vaak optreedt tijdens naald draw-up en mislukte pogingen van de injectie.
9. Een Trypan-blauw uitsluiting Assay uit te voeren op een steekproef van de celsuspensie te beoordelen van de levensvatbaarheid van de cellen. Ga verder alleen als de cel Toon levensvatbaarheid van 90% of hoger.
10. 5 x 10⁵ cellen in een volume van 100 μl injecteren. Ter voorbereiding van een overmaat van 2 X van dit bedrag, 1 x 10⁶ cellen moeten worden gesponnen beneden en geresuspendeerde in 0,2 mL HBSS.
11. Plaats celsuspensie in een ijsemmer bij de voorbereiding van de muizen voor injectie.

2. de staart van veneuze injectie en longkanker toediening

Opmerking: Het bedrag van oplossingen en cellen in deze sectie worden genoeg voor 1 muis. Schaal omhoog als dit nodig is als er meer muizen worden gebruikt in de studie. Voor een lijst van de apparatuur, de materialen en de chirurgische instrumenten gebruikt in de volgende stappen, verwijzen naar de tabel 3 en tabel 4.

1. Warm een vrouwelijke muis (leeftijd 6-8 weken) onder een lamp verwarming voor 5 min zodat hun staart ader duidelijker herkenbaar. Gebruik voor lymfkliertest K7M2 of K12 cellen, Balb/c muizen; gebruik voor menselijke MG63.3, MG63, MNNG en HOS cellen, strenge gecombineerde immunodeficiency muizen.
2. Zorg ervoor dat de celsuspensie is uniform door zachtjes schudden van de buis. Zorgvuldig opstellen van de celsuspensie in de 1 mL spuit zonder de naald. GLB de spuit met een 27 meter naald. Zorg ervoor dat de naald schuine kant aan dezelfde kant als de volume-markeringen op de naald.
3. Plaatst u de muisaanwijzer in de afdekking en wisser de staart met een alcohol doekje.
4. Ga verder met het uitvoeren van een staart veneuze injectie en injecteren de 100 μl van de celsuspensie. 5 minuten na de injectie, plaatst u de muisaanwijzer in een zaal van CO₂ en beginnen de euthanasie standaard gebruiksprocedure (als omtrek door uw Commissie institutionele dierenverzorgers). Cervicale dislocatie moet niet worden gebruikt als een middel van euthanasie, omdat de procedure aan de luchtpijp schade zal.
5. Zodra de muis is euthanized, beginnen de voorbereiding van de laminaire flow kap voor toediening van de longen van de muis met de agarose/A-media oplossing. Binnen de laminaire flow kap, opgezet een werkgebied met uw steriele zeem. Op dit pad plaatst u uw gesteriliseerde instrumenten, IV-katheter IV verlengset en zwaartekracht perfusie apparaat (Zie aanvullende figuur 1).
6. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in de dorsale recumbancy. Met een steriele kleine schaar, zorgvuldig uit het borstbeen naar de borstholte bloot te ontleden. Zorg niet doorprikken van de Long, aangezien een agarose/A-media oplossing zal worden gebruikt om te insufflate van de Long.
7. Wanneer de ontrafeling van het borstbeen, ontleden voorbij de thoracale inlaat aan beide zijden de luchtpijp. Bloot in de luchtpijp door het ontleden weg de omliggende weke delen.
8. Cannulate van de luchtpijp met een 20 gauge IV-katheter. Losjes legt een chirurgische knoop met steriel catgut hechtdraad rond de gecanuleerde luchtpijp.
9. Bevestig een IV extensieset uit de catheterized luchtpijp aan de 10 mL spuit van de zwaartekracht perfusie apparatuur.
10. Combineer de voorverwarmde 37 ^oC agarose (5 mL) en A-media (5 mL) in een 1:1-mengsel. Giet het vloeibare agarose/A-media oplossing in de 10 mL spuit van de zwaartekracht perfusie apparaat. Voorafgaand aan de toediening van de longen met agarose/A-media oplossing, zorgen dat de gehele lengte van de extensieset heeft zijn gevuld met agarose/A-media, waardoor de ontkenning van onbedoelde toediening van monsters van de longen met lucht.
11. Vul de Long de agarose/A-media oplossing totdat de Long is volledig insufflated.
12. Zodra de Long is volledig insufflated, verwijder de canule en stevig uit de chirurgische knoop om te voorkomen lekkage van de agarase/A-media oplossing via de luchtpijp binden.
13. Gaan ontleden uit de plukken (luchtpijp, hart en longen) van de borstholte. Zorg om geen lekke band of het oppervlak van de longen beschadigen.
14. Plaats de plukken (in geen bepaalde richting) in het vooraf gekoeld 30 mL PBS aangevuld met 1 X pen/strep, en laat de agarose/A-media te stollen voor 20 min.
15. Met behulp van fijn schaar en pincet, snijden van kleine stukjes van de longen (3 x 1.5 mm), zoals aangegeven in figuur 1A. Kleinere segmenten van de longen kunnen gemakkelijk worden beeld met behulp van een 2,5 X doelstelling. Meerdere segmenten kunnen worden gesneden per experimentele voorwaarde, meestal 4-10 plakjes per groep.
    Opmerking: Voor elke experimentele groep, plaatst u de segmenten van de Long in een aparte put (6-well-plate) met een 2 x 2 cm gelatine spons vooraf gedrenkt in B-media. De hoeveelheid media per putje wordt 1,5 mL. De media elke 2-3 dagen wijzigen. Voor studies van de drug is de frequentie van het veranderen van de media/drug gebruiker bepaald.

3. Widefield fluorescentie beeldvorming van longkanker segmenten en analyse

Opmerking: Widefield fluorescentie imaging, kleinere segmenten zijn verminderd (3 x 1,5 x 1 mm) om te passen van het gedeelte van de Long in 1 beeld met behulp van een 2,5 X doelstelling.

Beeldacquisitie op een widefield fluorescentie Microscoop:

1. Long segmenten zijn typisch beeld op 0, 3, 7 en 14 dagen na injectie. In de steriele omgeving van het biologische kabinet, zorgvuldig overbrengen de Long segmenten van de gelatine sponzen op een steriele 35 mm glas-bodem ronde schotel. Take care schar uit het overtollige vocht uit het lung-segment, zoals het overtollige vocht zal als een spiegel fungeren en TL-licht afkomstig van de tumorcellen weerspiegelen.
2. Schik de plakjes van de longen op een vergelijkbare manier afgebeeld in figuur 1A. Elke kolom zou vertegenwoordigen een andere experimentele voorwaarde. Zorg niet cross-besmetten de longen met de pincet. Spoel met 70% ethanol en droog zijn voor de behandeling van longkanker segmenten uit een andere experimentele groep.
3. Optimaliseren van de imaging parameters (dwz. winst, offset, blootstelling tijd, weggooien) die zorgt voor het beste contrast tussen de fluorescerende tumorcellen en achtergrond longweefsel in het besturingselement (voertuig onbehandeld) groep. Gebruik dezelfde parameters uit de controlegroep om het imago van de experimentele groepen. Opslaan als TIFF-beeldformaat.
4. Neem een digitaal beeld van een micrometer op hetzelfde doel voor een verwijzing naar een schaal.
5. Aangezien Long auto-fluorescentie na verloop van tijd verandert, moeten de imaging parameters worden aangepast aan de longen controle elke imaging sessie. De imaging parameters voor één sessie per se mogelijk niet optimaal voor latere imaging sessies.

Beeldanalyse:
Opmerking: De volgende beeld processing stappen zijn gedaan met ImageJ 1,51 h software pakket ¹⁷.

1. Open een afbeeldingsbestand in ImageJ (figuur 3A).
2. Aftrekken van de achtergrond: proces > aftrekken achtergrond > Rolling ball straal (begin met 50 pixels), uncheck "Background Light" (figuur 3B).
3. Afbeelding omzetten in 8-bits indeling: afbeelding > Type > 8 - bits (Figuur 3 c).
4. Eenheden instellen op pixels: afbeelding > Enter "Pixels" eenheid van lengte, Voer 1 in "pixelbreedte", "Pixel hoogte", "Voxel diepte". Selectievakje "Global" toe te passen op latere beelden.
5. Met behulp van het gereedschap Veelhoek, de vorm van de gehele Long-segment en bepalen het gebied (pixel²) van het totale Long-segment. Deze waarde zal worden gebruikt voor de berekening van het percentage tumor last van de longen.
6. Drempel afbeelding: afbeelding > aanpassen > drempel > markeren "Default" en "B & W" > gebruik de schuifregelaar drempel de afbeelding zodanig dat de meerderheid van de tumorcellen zijn nauwkeurig aangaf. Druk op "Apply" zal resulteren in een zwart-wit beeld waar de Long is alles zwart en de fluorescerende laesies zijn wit (figuur 3D). Druk op "Apply" een tweede keer zal het omkeren van de afbeelding waar alle fluorescerende structuren nu zwarte vormen (figuur 3E zijn).
7. Kwantificering van het aantal en vorm van letsels:
   Analyseren > instellen van metingen > controleren "Ruimte". Schakel alle andere selectievakjes.
   Analyseren van deeltjes > grootte (pixel²): 0-infinity vertegenwoordigt het vormenbereik dat ImageJ zal opsommen. Empirisch bepalen de kleinste laesie, die wordt geacht een cel één tumor in dag 0 voertuig beelden. Gebruik het gebied van deze cel één tumor als de ondergrens voor de resterende afbeeldingen in de gegevensset. Voor het werk in deze paper gepresenteerd, is 11 pixel² ingesteld als de ondergrens. Voor het werk gepresenteerd in de video met een voorbeeld, is 24 pixel² ingesteld als de ondergrens. Laat "Cirkelvormigheid" bereik 0-1. "Toon" kunnen worden ingesteld op "Nothing". U kunt ook als "Show" en "Overzichten" is geselecteerd, wordt een tekening van alle overzicht vormen gegenereerd. Controleren "Display resultaten" voor een afzonderlijk venster van metingen opduiken. Eventueel zal met "Add to manager" doos gecontroleerd alle vormen gekwantificeerd aan een ROI-manager, die kan worden opgeslagen voor toekomstig gebruik opslaan. Na het indrukken van OK, verschijnt een venster "Resultaten" met alle opgesomde vormen en gebied metingen (figuur 3F).
8. Kopieer en plak de gegevens uit het venster "Resultaten" in een werkblad. De wiskundige som-functie in Microsoft Excel gebruikt voor het optellen van alle gebieden van de metastatische laesies voor dat bepaalde Long-segment. Om te beoordelen de percentage Long tumor last van longkanker segment, de som van de gebieden van metastatische letsels door de totale oppervlakte van het Long-segment te verdelen. Deze parameter is ook bekend als gebied breuk (een_A) die wordt beschreven door Underwood ¹⁸.
   Long tumor last = som van metastatische laesie gebieden/totaal gebied van longkanker segment
9. Bereken de Long tumor last voor de rest van de Long-secties in de controlegroep en de resterende groepen. Plot de gemiddelde longen tumor lasten per groep 0, 3, 7 en 14 dagen. Vertegenwoordiger widefield fluorescerende foto's van hoge en lage metastatische menselijke OS cellen groeien in het model van de PuMA op progressieve tijdstippen worden weergegeven (figuur 4A). Een lijngrafiek met de vouw-verandering (op dag 0 genormaliseerd) in percentage uitgezaaide tumor last na verloop van tijd wordt weergegeven (figuur 4B).

4. confocal fluorescentie beeldvorming van het Model van PuMA

Opmerking: Voor confocal imaging, weefsel verwerking is vergelijkbaar met die in de vorige sectie behalve dat grotere Long plakjes worden gesneden (volledige dwarse secties, 1-2 mm dik) zodat meer ROIs naar zijn beeld.

Etikettering van longkanker parenchym met DAR4M:

1. Onderdompelen van longkanker sneetjes in 10 μμM DAR4M (in HBSS) gedurende 45 minuten bij 37 ° C. DAR4M etiketten reactieve stikstof soorten binnen de cellen van de longen.
2. Na 45 min van incubatie, spoel de segmenten van de longen met frisse HBSS.
3. Plaats het Long-segment in een 35 mm glas-bodem ronde schotel, en de afbeelding op de confocal microscoop.
4. De imaging parameters voor de voorbeeldafbeeldingen afgebeeld in Figuur 5 staan in tabel 5.
5. Verwerven van een Z-stapel voor een gebied van belang. Gebruik de voorgestelde Z segment dikte voor Nyquist bemonstering. Een representatieve film een 3D stapel groene fluorescerende cellen van de OS in het DAR4M-label longweefsel tonen vindt u in de film 1 en aanvullende film 1.

Voor de confocal voorbeeldafbeeldingen afgebeeld in Figuur 5wordt was de imaging sessie terminal. Als longitudinale imaging vereist is, het gebruik van een 2-foton of multi foton uitgeruste confocal LSM Microscoop voor imaging wordt geadviseerd aangezien er minder photodamage voor levende weefsels^19,20.
Imaging mito-RFP waarin MG63 cellen in de PuMA-model:

1. De PuMA-protocol als overzicht in stap 1 en 2 met cuvetten van MG63 uiting geven aan de constructie van de mito-RFP uitvoeren
2. Plaats het Long-segment in een 35 mm glas-bodem ronde schotel, en de afbeelding op de confocal microscoop.
3. De imaging parameters voor de beelden van de voorbeeld in Figuur 6 afgebeelde staan in tabel 6. Een representatieve film een 3D stapel groene fluorescerende cellen van het OS met rood fluorescerende mitochondriën wordt geleverd in Movie 2 en aanvullende Movie 2tonen.

Results

Low-vergroting widefield fluorescentie microscopie

Voor widefield fluorescentie microscopie van PuMA Long segmenten, worden representatieve beelden en kwantificering gegevens weergegeven in figuur 2C, en figuur 4A en B. De metastatische neigingen voor hoge en lage metastatische cellijnen zijn visueel herkenbaar over progressiev...

Discussion

Het volgende technische artikel beschrijft enkele praktische aspecten van het model van de PuMA in het bestuderen van de Long kolonisatie in OS. Sommige kritische stappen in het protocol waar onderzoekers extra zorg moeten omvatten het volgende:

a) cannulation van de luchtpijp. De luchtpijp kan gemakkelijk worden beschadigd tijdens het ontleden van de omliggende spier- en bindweefsel. De naald van de katheter kan bovendien eenvoudig worden geduwd door de luchtpijp. Aandacht besteden aan hoe de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabel 2
Celcultuur reagentia voor A-media, B-media en compleet media
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	hoog metastatische OS cel lijn
HOS	ATCC	CRL-1543	slecht metastatische OS cel lijn
MG63.3	Amy LeBlanc Laboratorium (NCI)	N/A	hoog metastatische OS cel lijn
MG63	ATCC	CRL-1427	slecht metastatische OS cel lijn
10X M199 media	Thermofisher	11825015	Basis media voor A-media en B-media
Gedestilleerde water (gesteriliseerd)	Thermofisher	15230-147	Component van A-media & B-media
7.5% natriumbicarbonaat oplossing	Thermofisher	25080094	Component van A-media & B-media
Hydrocortizon	Sigma-Aldrich	H6909	Component van A-media & B-media
Retinol acetaat-water oplosbaar	Sigma-Aldrich	R0635-5MG	Component van A-media & B-media
Penicilline/Streptomycine 10X geconcentreerde (10000 U/ml) oplossing	Thermofisher	15140122	Component van A-media & B-media, compleet media.
Bovine insuline oplossing (10mg/ml)	Sigma-Aldrich	I0516-5ML	Component van A-media & B-media
DMEM, hoge glucose	Thermofisher	11965092	Basis media van Compleet Media
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher	25030081	Component van Compleet Media
Fetaal bovien serum	Thermofisher	16000044	Component van Compleet Media
Dulbecco’s fosfaat gebufferde zoutoplossing	Thermofisher	14190144	Gebruikt in celcultuur.
Hank’s gebufferde zout oplossing, zonder calcium, zonder magnesium, zonder fenol rood	Thermofisher	14175095	Gebruikt om cel pellet te resuspenderen voor injectie
Trypsine-EDTA (0.25%), fenol rood	Thermofisher	25200114	Gebruikt in celcultuur.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Gebruikt om longparenchym te labelen.
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tabel 3
Materiaal voor PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Staande LSM confocale microscoop
Zeiss 780 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Omgekeerde LSM confocale microscoop
SCID muizen	Charles River	N/A	NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, vrouwelijk, leeftijd 6-8 weken
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Gebruikt als ondersteuning voor longweefselsneden.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Gebruikt tijdens insufflatie van de long.
1 ml spuit met 27 gauge naald	Fisherscientific	14-826-87	Gebruikt voor injectie in de staarsaf
10 ml spuit	BD	309604	Gebruikt voor insufflatie van de long.
20 gauge katheter	Terumo	SR-OX2032CA	Gebruikt tijdens insufflatie van de long.
Abbott IV verlengset (30", sterieel)	Medisca	8342	Gebruikt tijdens insufflatie van de long.
Alcohol doekjes	BD	326895	Voor het afvegen van de staarsaf voor injectie
Steriele chirurgische handschoenen	Fisherscientific	Varies met maat	Aseptische hantering van muizenlongen
30 cm liniaal	Staples		Gebruikt voor insufflatie van de long.
Ondersteuning standaard voor liniaal	Pipette.com	HS29022A	Gebruikt voor insufflatie van de long.
35 mm glasbodem kweekschaal	Ibidi	81158	Gebruikt tijdens beeldvorming van longsneden
Absorbeerbare onderleggers met waterdichte vochtbarrière	VWR	56617-014	Gebruikt om de steriele werkruimte in de biologische kap te bekleden.
Catgut Vlak Absorbeerbare Naadraad	Braun	N/A	Gebruikt om canuleerbare luchtpijp af te binden.
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tabel 4
Chirurgische instrumenten voor PuMA
Micro Dissectie Schaar 3.5" Recht Scherp/Scherp	Roboz	RS-5910	Voor het snijden van longsneden
4” (10 cm) Lang Gerand Recht Extra Delicaat 0.5mm Tip	Roboz	RS-5132	Voor manipulatie/houden van longsneden.
4” (10 cm) Lang Gerand Licht Gebogen 0.8mm Tip	Roboz	RS5135	Voor manipulatie/houden van longsneden.
Duim Dressing Forceps; Gerand; Delicaat; 4.5" Lengte; 1.3 mm Tip Breedte	Roboz	RS-8120	Voor algemene dissectie.
Duim Dressing Forceps 4.5" Gerand 2.2 mm Tip Breedte	Roboz	RS-8100	Voor algemene dissectie.
Extra Fijne Micro Dissectie Schaar 3.5" Recht Scherp/Scherp, 20mm blad	Roboz	RS-5880	Voor algemene dissectie.
Knapp Schaar; Recht; Scherp-Bots; 27mm Blad Lengte; 4" Totale Lengte	Roboz