Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

Summary

Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.

Abstract

De pulmonaire metastase assay (PuMA) is een ex vivo Long explant en gesloten celcultuur waarmee onderzoekers om te bestuderen van de biologie van longkanker kolonisatie in Osteosarcoom (OS) door fluorescentie microscopie. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van het protocol, en voorbeelden van het verkrijgen van afbeeldingsgegevens op metastatische groei met widefield of confocal fluorescentie microscopie platformen. De flexibiliteit van het model van de PuMA toelaat onderzoekers bestuderen van niet alleen de groei van OS cellen in de longen-communicatie, maar ook voor het beoordelen van de effecten van anti-metastatische therapeutics na verloop van tijd. Confocale microscopie zorgt voor ongekende, high-resolution beeldvorming van OS cel interacties met de Long parenchym. Bovendien, wanneer de PuMA model wordt gecombineerd met fluorescente kleurstoffen of TL proteïne genetische verslaggevers, onderzoekers kunnen bestuderen de Long-communicatie, cellulaire en subcellular structuren, genfunctie en promotor activiteit in uitgezaaide cellen van het OS. De PuMA-model biedt een nieuw hulpmiddel voor Osteosarcoom onderzoekers om te ontdekken van nieuwe metastase biologie en de activiteiten beoordelen van nieuwe anti-gemetastaseerd, gerichte therapieën.

Introduction

Verbeterde resultaten voor pediatrische patiënten met metastatische Osteosarcoom (OS) blijft een kritische unmet klinische behoefte ¹. Dit onderstreept het belang van de ontwikkeling van nieuwe moleculair-gerichte therapieën. Conventionele chemotherapeutica dat doel tumor celproliferatie hebben niet bewezen effectief bij de behandeling van uitgezaaide ziekte, en zo nieuwe strategieën moeten richten op het metastatische proces zelf ². Het huidige artikel behandelt de praktische aspecten van een relatief nieuw soort ex vivo Long metastase model, de pulmonaire metastase assay (PuMA) ontwikkeld door Mendoza en colle....

Protocol

Alle dierlijke protocollen waaruit imaging gegevens werden verkregen werden uitgevoerd met goedkeuring van de Animal Care en gebruik van het Comité van het National Cancer Institute, National Institutes of Health. Alle dierlijke protocollen besproken en afgebeeld in het artikel video zijn door de University of British Columbia dierlijke zorg Comité goedgekeurd.

1. voorbereiding van tumorcellen injectie en materialen voor het model van PuMA

Opmerking: Het bedrag van oplossingen en cellen worden genoeg voor 1 muis. Schaal omhoog als dit nodig is als er meer muizen worden gebruikt in de studie. Voor media recepten, ve....

Results

Low-vergroting widefield fluorescentie microscopie

Voor widefield fluorescentie microscopie van PuMA Long segmenten, worden representatieve beelden en kwantificering gegevens weergegeven in figuur 2C, en figuur 4A en B. De metastatische neigingen voor hoge en lage metastatische cellijnen zijn visueel herkenbaar over progressiev.......

Discussion

Het volgende technische artikel beschrijft enkele praktische aspecten van het model van de PuMA in het bestuderen van de Long kolonisatie in OS. Sommige kritische stappen in het protocol waar onderzoekers extra zorg moeten omvatten het volgende:

a) cannulation van de luchtpijp. De luchtpijp kan gemakkelijk worden beschadigd tijdens het ontleden van de omliggende spier- en bindweefsel. De naald van de katheter kan bovendien eenvoudig worden geduwd door de luchtpijp. Aandacht besteden aan hoe de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2
Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	highly metastatic OS cell line
HOS	ATCC	CRL-1543	poorly metastatic OS cell line
MG63.3	Amy LeBlanc Laboratory (NCI)	N/A	highly metastatic OS cell line
MG63	ATCC	CRL-1427	poorly metastatic OS cell line
10X M199 media	Thermofisher	11825015	Base media for A-media and B-media
Distilled Water (sterilized)	Thermofisher	15230-147	Component of A-media & B-media
7.5% sodium bicarbonate solution	Thermofisher	25080094	Component of A-media & B-media
Hydrocortizone	Sigma-Alrich	H6909	Component of A-media & B-media
Retinol acetate-water soluable	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Component of A-media & B-media
Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution	Thermofisher	15140122	Component of A-media & B-media, complete media.
Bovine insulin solution (10mg/ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Component of A-media & B-media
DMEM, high glucose	Thermofisher	11965092	Base media of Complete Media
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher	25030081	Component of Complete Media
Fetal Bovine Serum	Thermofisher	16000044	Component of Complete Media
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Thermofisher	14190144	Used in cell culture.
Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red	Thermofisher	14175095	Used to resuspend cell pellet prior to injection
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermofisher	25200114	Used in cell culture.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Used to label lung parenchyma.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Inverted LSM confocal microscope
SCID mice	Charles River	N/A	NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Used as a support for lung tissue sections.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Used during insufflation of the lung.
1 ml syringe with 27 gauge needle	Fisherscientific	14-826-87	Used for tail vein injection.
10 ml syringe	BD	309604	Used for insufflation of the lung.
20 gauge catheter	Terumo	SR-OX2032CA	Used during insufflation of the lung.
Abbott IV extension set (30", Sterile)	Medisca	8342	Used during insufflation of the lung.
Alcohol swabs	BD	326895	For wiping tail vein before injection
Sterile surgical gloves	Fisherscientific	Varies with size	Asceptic handing of mouse lungs
30 cm ruler	Staples		Used for insufflation of the lung.
Support stand for ruler	Pipette.com	HS29022A	Used for insufflation of the lung.
35 mm glass-bottomed culture dish	Ibidi	81158	Used during imaging of lung slices
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014	Used to line the sterile work area in the biological hood.
Catgut Plain Absorbable Suture	Braun	N/A	Used to tie off cannulated trachea.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 4
Surgical instruments for PuMA
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	For cutting lung sections
4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip	Roboz	RS-5132	For manipulating/holding lung sections.
4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip	Roboz	RS5135	For manipulating/holding lung sections.
Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width	Roboz	RS-8120	For general dissection.
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width	Roboz	RS-8100	For general dissection.
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade	Roboz	RS-5880	For general dissection.
Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length	Roboz	RS-5960	For general dissection.