Methodenartikel

Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie

DOI:

10.3791/56333

⸱

23 november 2017

 , 
1Division of Hematology, Oncology and Blood and Marrow Transplantation, Department of Pediatrics, University of Southern California, 2The Saban Research Institute of Children's Hospital Los Angeles, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Southern California

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol fungeert als een regeling voor de oprichting van een functioneel Tet-ON systeem in cellijnen van kanker en het latere gebruik ervan, in het bijzonder voor de studie van de rol van tumor cel afkomstige eiwitten in de aanwerving van monocyten/macrofagen aan de communicatie van de tumor.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

siRNA en shRNA-gemedieerde knock down (KD) methoden van regulering van de expressie van genen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het begrijpen van de gen- en eiwit functie. Echter, in het geval dat de KD van de proteïne van belang een dodelijk effect op cellen is of het verwachte effect van de KD tijdafhankelijke, onvoorwaardelijke KD methoden zijn niet geschikt. Voorwaardelijke systemen zijn meer geschikt in deze gevallen en het onderwerp van veel belang zijn geweest. Deze omvatten Ecdysone-afleidbare overexpressie systemen, Cytochrome P-450 inductie systeem1, en de tetracycline geregeld gen expressiesystemen.

Tetracycline geregeld Enumeration gen expressie omkeerbare controle over eiwit expressie door inductie van shRNA expressie in aanwezigheid van tetracycline. In dit protocol presenteren wij een experimenteel ontwerp met behulp van functionele Tet-ON systeem in menselijke kanker cellijnen voor voorwaardelijke regulering van de genexpressie. Vervolgens tonen wij het gebruik van dit systeem in de studie van tumor cel-monocyt interactie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumor verbonden macrofagen (TAMs) bijdragen aan tumor ontwikkeling door bevordering van tumorgroei metastase en regulering van de immuunrespons2. Kanker cellen werven inflammatoire monocyten, die infiltreren tumor en differentiëren in pro-tumorigene TAMs3. Infiltratie van de tumor met TAMs correleert met slechte klinische resultaten en is gekoppeld aan de immunosuppressieve rol van macrofagen4,5. Echter, de mechanismen van de aanwerving van de macrofagen aan de tumor niet goed zijn onderzocht en een beter begrip van de betrokken trajecten is van cruciaal belang voor verdere vooruitgang van het veld en beloftevolle therapieën. Een van de uitdagingen bij het bestuderen van de interacties tussen de tumorcellen en de normale cellen in de tumor communicatie (TME) is de complexiteit van de mechanismen en de cellen die de betrokken zijn, waarbij in vitro benaderingen waarmee dissectie van de overspraak. Hier presenteren we een veelzijdige methodologie die kan worden toegepast om te studeren het paracrine effect van een kanker cel-afgeleide, secreted eiwit op migratie van andere celtypes zoals macrofagen, in vitro. Met behulp van een systeem waar de uitdrukking van de shRNA tegen een kanker cel afkomstige eiwitten die betrokken zijn bij de aanwerving van monocyten is onder de controle van de tetracycline afleidbare promotor, is het effect van de paracrine van de secreted eiwit op monocyten quantitated. In dit protocol, klonen van shRNA sequenties in de tetracycline gereglementeerde vector wordt gepresenteerd gevolgd door generatie van stabiele kanker cellijnen. Verder, de zuivering van primaire menselijke monocyten en een Boyden kamer assay worden gebruikt om te analyseren het effect van de paracrine van een kankercel afkomstig eiwit op migratie van monocyten.

Downregulatie van eiwit codering genen wordt het vaak toegepast met siRNA en shRNA technieken, hoewel niet zonder beperkingen in het gebruik ervan. De lange termijn knock-down (KD) van genen kan secundaire adaptieve reacties van cellen die met de experimentele resultaten interfereren uitlokken. Ontbreken van temporele controle over genexpressie maakt het uitdagend om te bestuderen van de dynamische rol van een proteïne in tijd of in de rol van een eiwit dat van cruciaal belang voor de overleving van de cel. Deze kwestie is vooral belangrijk in in-vivo -instellingen, waar de rol van een proteïne in de ontwikkeling van de tumor en progressie wellicht Downregulatie van de uitdrukking van de proteïne van belang alleen nadat de tumor is ingesteld. Voorwaardelijke KD heeft het voordeel van het voorkomen van een te vroeg dodelijk effect van de KD op cellen en om analyse van de rol van de proteïne in de verschillende stadia van tumorgroei, terwijl onvoorwaardelijke KD kan leiden tot gebrek aan ontwikkeling van de tumor.

Een aantal voorwaardelijke KD systemen zijn ontwikkeld om de beperkingen van stabiele KD. De voorwaardelijke gene expressiesystemen Ecdysone-afleidbare overexpressie systemen, de cytochroom P-450 inductie systeem1, omvatten en tetracycline geregeld gen expressiesystemen. De tetracycline-gereglementeerde gene expressiesystemen toestaan controle over de expressie van de shRNA na toevoeging van de antibiotica tetracycline (of zijn stabieler analoge - doxycycline). In Tet-ON systemen, de uitdrukking van shRNA wordt geïnduceerd in aanwezigheid van tetracycline/doxycycline resulterend in een genexpressie KD, terwijl in de Tet-OFF systemen, de uitdrukking van shRNA wordt onderdrukt in het bijzijn van tetracycline resulterend in genexpressie. Een nadeel van tetracycline-afleidbare systeem is eerder gerapporteerde lage niveaus van meningsuiting shRNA bij gebrek aan doxycycline - zogenaamde leakiness6,7. In de Tet-ON beschreven systeem hier, op de administratie van tetracycline, de binding van constitutively uitgedrukt tetracycline onderdrukker (TetR) eiwit aan de Tet-responsief element (TRE) reeks binnen de H1 promotor regio van de shRNA van belang is onderdrukt. Dit resulteert in expressie van shRNA en remming van de vertaling van de proteïne van belang in een tetracycline-afhankelijke manier8,9.

Andere beschikbare Tet-ON systemen omvatten gelijktijdige knock-in van de reeks tussen TATA vak en proximale reeks element (PSE) en tussen TATA vak en transcriptie pas site ontwikkeld door Chan et al.TetO. 10 dit systeem vereist minder dan toxische doses van tetracycline te reguleren shRNA expressie, echter onder een niet-geïnduceerde staat, lage niveaus van shRNA worden uitgedrukt. De Krüppel-geassocieerde vak (KRAB) gebaseerd Tet-ON systeem11 bevat een KRAB, een zink-vinger-eiwit, dat onderwerpen genen binnen een bereik van 3 kb van de KRAB bindende site transcriptionele onderdrukking gelegen. Het chimeer eiwit tTRKRAB kan binden aan TetO, en als gevolg van het grote aantal DNA regelbare capaciteit, TetO niet nodig te beperken tussen de transcriptie start van de site en de promotor en lage impact hebben op de activiteit van de promotor. Onder de niet-geïnduceerde staat, werd deze beheersbare RNA interferentie systeem gemeld om te laten zien van een lager niveau van gelekte expressie van shRNA11,12; het vereist echter een sequentiële, twee-vector benadering van klonen. In vergelijking met eerder ontwikkelde voorwaardelijke KD systemen zoals het Ecdysone-afleidbare overexpressie systeem of cytochroom P-450 inductie systeem, het tetracycline-gereguleerde systeem heeft het voordeel van de robuustheid en de omkeerbaarheid, en is daarom de meest gebruikte routinematig systeem13. Het systeem gebruikt in dit protocol heeft het voordeel ten opzichte van de dubbele TetO knock-in systeem en KRAB Tet-ON systeem als het vereist ongecompliceerd, enkele vector kloont, waardoor snelle rendering van meerdere klonen, en het vertoont zeer lage niveaus van leakiness in de het ontbreken van doxycycline.

TME is cruciaal voor de ontwikkeling van kanker. Om de tumorgroei, werven kankercellen inflammatoire monocyten door afscheidende Chemotactische eiwitten. Aangeworven monocyten infiltreren van de tumor en onderscheid maken in pro-tumorigene TAMs die aan de tumorgroei en uitzaaiing bijdragen. In vitro studies van de immuun cel aanwerving gebruiken migratie testen, met Boyden kamer assay wordt wijd gebruikt14,15,16,17. In deze test, is de eiwitbron chemoattractant, bijvoorbeeld, kankercellen, of een gezuiverde eiwit, in de onderste zaal geplaatst. Immuuncellen worden geplaatst in de bovenste kamer gescheiden met poreuze membraan van de onderste compartiment. Cellen migreren naar de toenemende helling van chemoattractant, en die gevonden aan de lagere kant van het membraan zijn gekleurd en geteld onder de Microscoop. Hier testen we de functie van de chemoattractant van het Plasminogen Activator Inhibitor-1 (PAI-1) op monocyten door het genereren van stabiele, afleidbare kanker cellijnen waar uitdrukking van PAI-1 wordt gereguleerd door doxycycline toevoeging. We gebruiken menselijke primaire monocyten in de Boyden assay voor de migratie van de kamer om de rol van PAI-1 in monocyt migratie beoordelen. Verschillen tussen menselijke primaire monocyten en gebruikte monocytic cellijnen als THP1 zijn gemeld en bevatten verschillende cytokine-expressie patronen18; bijvoorbeeld 5-10-voudige toename in de niveaus van TNF-α expressie door THP1 cellen ten opzichte van menselijke monocyten19. THP1 cellen zijn afgeleid van menselijke leukemie monocytic cellen, zijn gemakkelijk te onderhouden en te vermenigvuldigen met een gemiddelde tijd van 19-50 h20te verdubbelen. Integendeel, worden menselijke monocyten gekenmerkt door een korte levensduur in de afwezigheid van groeifactoren. Aangezien monocyten zijn gezuiverd uit bloed van donoren, een behoorlijke hoeveelheid variabiliteit vindt plaats tussen de individuen en afhankelijk van de methode van de zuivering, kan besmetting met andere celtypes optreden. Niettemin, primaire monocyten relevant zijn en het is aanbevolen om te gebruiken of bevestiging van de resultaten verkregen met de cellijnen van de monocytic met behulp van primaire monocyten in biologisch onderzoek19. Hier beschrijven we een protocol voor zuivering van menselijke primaire monocyten uit perifere bloed. Alternatieve methoden van monocyt zuivering omvatten dichtheid verloop en hechting van de protocollen en twee stap procedure met enkele hellingen van densiteitgradiënt-Hypaque, gevolgd door een Percoll verloop21. De zuiverheid van de bevolking van de monocyt verkregen door deze methoden varieert tussen 70-90%. De hier beschreven methode gebruikt een dichtheid verloop gevolgd door een negatieve immuun selectie22 en maakt de zuivering van menselijke monocyten zonder direct contact met de antilichamen, waardoor het vermijden van hun toevallige activering en resulterend in een > 95% pure bevolking van monocyten.

Het hier gepresenteerde protocol wordt gebruikt voor het instellen van een functionele Tet-ON systeem voor genexpressie KD in menselijke kanker cellijnen om te studeren het chemoattractant effect van het kanker-afgeleide secreted eiwit PAI-1 op monocyten. PAI-1 door een scala aan tumoren is overexpressie en haar expressie paradoxaal genoeg correleert met slechte klinische resultaten23,24. De pro-tumorigene rol van PAI-1 is een gevolg van de pro-angiogenic en anti-apoptotic functioneert25,26. PAI-1 heeft aangetoond bij te dragen tot ontsteking door het bevorderen van de aanwerving van macrofagen op de site van ontsteking27. PAI-1 werd getoond ter bevordering van de gladde spieren cellmigration28,29 en deel te nemen aan de Mac-1 afhankelijk macrophage migration30. PAI-1 overexpressie is ook aangetoond dat een aanzienlijke verbetering van de aanwerving van rauwe 264.7 macrofagen in B16F10 melanoom tumoren31. De rol van PAI-1 TAM migratie is echter niet in detail onderzocht. We beschreven protocol gebruiken om het antwoord op de vraag voor of de PAI-1 monocyten tot kankercellen trekt. Deze methode kan dissectie van de Overspraak tussen tumor en TME door het monddood maken van de secreted eiwitten in kankercellen en analyseren van de componenten van de TME.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De sectie van protocol die gebruikmaakt van menselijke monocyten verkregen uit gezonde vrijwilligers volgt de richtsnoeren van het Children's Hospital Los Angeles menselijke onderzoek ethisch comité en is goedgekeurd door de institutionele Review Board onder de menselijk materiaal Protocol nummer: CCI 08-00208.

1. bereiding van kanker cellijnen met Tetracycline-gereglementeerde shRNA expressie

  1. Klonen van shRNA PAI-1 in Tet-pLKO-puro vector 8 , 9
    1. Ontwerp shRNA oligomeren die leeftijdik en EcoRI decolleté op de 5'-eind, de volgorde van de zin, een 6 nucleotide-lus en de antisense volgorde website bevatten.
      Opmerking: Typische oligonucleotides zijn ontworpen als volgt: Forward oligo: 5' CCGG - 19-21 bp zin - CTCGAG - 19-21 bp antisense - TTTTT, Reverse oligo: 5' AATTAAAAA-19-21 bp zin - CTCGAG - 19-21 bp antisense 3'. Gedetailleerd protocol voor het oligomeren ontwerp kan worden gevonden in 8. In deze studie werden 3 shRNA sequenties tegen PAI-1 getest voor de sterkste silencing effect: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333en gecodeerde33 zijn opgenomen in tabel 1.
    2. Anneal de shRNA oligomeren en krabbelde shRNA oligomeren.
      1. Reconstrueren oligonucleotides aan 100 µM in water en meng 1 µL voorste oligonucleotide, 1 µL Reverse oligonucleotide en 8 µL H2O.
      2. Om te ontharden de oligonucleotides, meng het volgende: 1 µL oligonucleotide mengsel, 5 µL buffer 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 mM natriumchloride (NaCl), 10 mM magnesiumchloride (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) en 44 µL H 2 O.
      3. Incubeer het mengsel in een polymerase kettingreactie (PCR) thermische cycler bij 95 ° C gedurende 5 min, uitschakelen van het instrument, en wacht tot kamertemperatuur (RT) is bereikt.
    3. Overhaaste ontharde oligonucleotides door toevoeging van 5 µL 3 M Natriumacetaat pH 5.2 tot en met 50 µL gegloeid oligonucleotides.
      1. Voeg 100 µL koude 100% ethanol (EtOH) en incubeer gedurende 30 minuten bij-80 ° C. Centrifugeer in een benchtop centrifuge op maximale snelheid gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
      2. Verwijder de bovendrijvende substantie, voeg 500 µL koude 70% EtOH, centrifuge voor 30 min, verwijder supernatant, en los van de pellet in 20 µL H2O.
      3. De concentratie van de ontharde oligonucleotides beoordelen door spectrofotometrie, het meten van de absorptie bij 260 nm. Verdunde oligonucleotides voor de uiteindelijke concentratie van 1 ng/µL.
    4. Bereiden Luria Bertani (LB) medium en LB agar platen.
      1. Voor LB medium, Los 10 g trypton, 5 g gistextract, 10 g NaCl in 1 L water. Breng de pH van het medium op pH 7,0 met 1 N NaOH en autoclaaf.
      2. Voor LB agar platen, voeg toe 15 g/L agar in LB medium. Autoclaaf en laat afkoelen tot ongeveer 50 ° C. Toevoegen van antibioticum en giet de platen.
    5. Strijk bacteriën getransduceerde met Tet-pLKO-puro vector (Zie de Tabel van materialen) op LB agarplaat aangevuld met 100 µg/mL ampicilline en na een nacht bebroeden (O/N) bij 37 ° C.
    6. Inoculeer 100 mL LB medium aangevuld met 100 µg/mL ampicilline (LB/ampicilline) met 1 kolonie van de plaat en O/N groeien met schudden bij 37 ° C.
    7. IsolateTet-pLKO-puro van 100 mL bacteriële cultuur met behulp van een plasmide isolatie kit.
    8. De reactie van de beperking voor de Tet-pLKO-puro vector met EcoRI en AgeI enzymen van de beperking als volgt voorbereiden: 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL 10 x buffer, 1 µL plasmide DNA (1 µg), 42 µL H2O. Incubeer 1 uur bij 37 ° C. Voorbereiden om te krijgen genoeg van gekloofd vector, maximaal 5 x 50 µL reacties.
    9. Gebruik 1% agarose gel te zuiveren gekloofd vector van het agarose gel met behulp van een DNA zuivering kit. Het vergroten van het rendement van DNA, het minimaliseren van de agarose DNA/ratio in de gel met behulp van een agarose gel kam voor grote putten en door het zorgvuldig verwijderen van allermeest naar de agarose uit de band met behulp van een scalpel.
    10. De afbinding reactie mix als volgt voorbereiden: 1 ng gegloeid oligonucleotides, 50 ng gekloofd vector 2 µL 10 x ligase buffer, 1 µL ligase en water tot 20 µL. Ligate de vector met ontharde shRNA oligonucleotides bij 16 ° C O/N.
      1. Bereiden bovendien een reactie van de negatieve controle zonder oligonucleotides ter verantwoording voor zichzelf ligaturen, uncleaved en gedeeltelijk gekloofd vector die leiden valse positieve kolonies tot zal.
    11. Met behulp van standaard transformatie technieken, transformeren afbinding mengsels in chemisch bevoegde bacteriecellen ter voorkoming van homologe recombinatie van lentivirale vectoren met directe herhalingen.
    12. Groeien bacteriën op platen met ampicilline O/N bij 37 ° C.
      Opmerking: Als groei van satelliet kolonies optreedt, herhaalt u de transformatie en groeien bacteriën bij 30 ° C te vertragen de groei en daarmee te voorkomen dat de satelliet kolonies.
    13. Om te controleren of de succesvolle afbinding, kiezen tussen 10-20 enkele kolonies, inoculating 2 mL LB/ampicilline culturen en een ampicilline plaat als een voorraad plaat (te gebruiken als een positieve kloon later). Groeien van vloeibare culturen met O/N schudden bij 37 ° C. Incubeer de plaat O/N bij 37 ° C.
    14. Afdichting van de plaat met parafilm en winkel op 6 ° C.
    15. Isoleren plasmide DNA uit vloeibare culturen met behulp van een plasmide isolatie kit.
    16. Beperking analyses van plasmide DNA geïsoleerd van ampicilline-resistente kolonies met behulp van XhoI enzym uit te voeren. Voor elke kloon, voorbereiding van de volgende mix: 0,5 µL XhoI, 2.5 µL 10 x buffer, 1 µL plasmide DNA (0,5 µg), en 21 µL H2O. Incubate gedurende 1 uur bij 37 ° C. Het resultaat van de beperking reactie analyseren door het uitvoeren van de reactie op een 1% agarose gel.
      Opmerking: Beperking analyse van de WT vector gekloofd door XhoI zal het genereren van 3 fragmenten: 8,447, 1800 en 200 bp. De volgorde van de stuffer in Tet-pLKO-puro vector van 1.800 bp is niet aanwezig in positieve klonen met shRNA-PAI-1 en de XhoI digest zal resulteren in DNA-fragmenten van de grootte: 8,447, 190 en 130 bp. Zoals aangegeven in Figuur 1, het 2.000 bp fragment niet wordt gevonden in DNA geïsoleerd van ampicilline resistente kolonies nummer: 3, 8 en 11. Afhankelijk van het ontwerp van oligonucleotides, kunnen de lengte en het aantal verkregen fragmenten in DNA van positieve kolonies variëren.
    17. Controleer of de juiste invoeging van de shRNA sequenties in de Tet-pLKO-puro vector door sequentiebepaling8,9.
    18. 100 mL LB/ampicilline cultuur inoculeren met de kolonie met de juiste kloon en O/N groeien bij 37 ° C.
    19. Isoleren plasmide DNA met behulp van een plasmide isolatie kit.
  2. Generatie van lentivirus deeltjes.
    1. Jas van een 15 cm weefselkweek schotel met Poly-L-Lysine door die betrekking hebben op het oppervlak van de schotel met steriel water oplossing van 0,01% Poly-L-Lysine en broeden op RT voor 15 min. verwijderen de oplossing door aspiratie en drogen van de gerechten.
    2. Zaad 5 x 106 menselijke embryonale 293 van de nier cellen (HEK293) cellen in de Poly-L-Lysine-coated 15 cm schotel en cultuur in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine mix (Pen/Strep) bij 37 ° C, 5% CO 2 totdat zij 70% confluentie bereiken.
    3. Transfect voor de productie van virale deeltjes, HEK293 cellen met 25 µg pLKO-Tet-op-shRNA, 25 µg psPAX, (verpakking plasmide), en 5 µg pMD2.G plasmiden (envelop waarin plasmide) met behulp van transfectiereagens.
      Opmerking: psPAX en pMD2.G plasmiden zijn een geschenk van de Didier Trono-lab (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Zwitserland).
    4. Induceren HEK293 cellen de volgende dag door het medium te DMEM aangevuld met 10 mM natrium butyraat en 20 mM HEPES pH 7,2 en kweken voor 8u wijzigen.
    5. Spoel de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 25 mL van de verse DMEM medium met 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) pH 7,2. Na incubatie bij 37 ° C gedurende 48 h, zorgvuldig verzamelen medium virus-bevattende door pipetteren; Vermijd morsen van vloeistoffen.
    6. Het verzamelde medium wordt gefiltreerd door een 0,45 µM spuit filter te verwijderen van de HEK293 cellen. Het medium met virale deeltjes kan onmiddellijk gebruikt of opgeslagen bij-80 ° C voor later gebruik.
  3. Generatie van stabiel transfected cellijnen
    1. Zaad van HCT116 dikke darm kankercellen en MDA-MB-231 borstkankercellen op 50.000 cellen per putje in DMEM medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% Pen/Strep in een 12-well-plate. Incubeer bij 37 ° C bij 5% CO2 tot cellen 60-70% heuvels zijn.
    2. Wassen van cellen met PBS en voeg 1 mL virus-bevattende middellange tot kanker cellen en O/N Incubeer bij 37 ° C bij 5% CO2. Als een besturingselement, voeg 1 mL van verse DMEM medium aangevuld met 10% FBS en 1% Pen/Strep 2 putjes met kankercellen.
    3. Verwijder voorzichtig medium virus-bevattende door aspiratie. Wassen van de cellen met PBS en omzetten in het medium DMEM met 10% (v/v) tetracycline-vrije FBS (Tet-vrij) en 1% Pen/Strep.
    4. Na 72 uur wassen cellen met PBS en omzetten in het medium DMEM 10% Tet-vrije FBS 1% Pen/Strep, 1 µg/mL puromycin voor selectie van virus-transfected cellen.
      1. Afhankelijk van de gebruikte cellijn, de concentratie van de puromycin voor optimale selectie aanpassen door het testen van het bereik van puromycin concentraties (0.1, 0.5, 1, 2 en 5 µg/mL) in niet-getransduceerde cellen en de laagste concentratie waar geen controle cellen overleven te kiezen na 3 dagen van cultuur.
    5. Selecteer de cellen die virus-getransduceerde door het kweken van cellen in aanwezigheid van de puromycin voor 3-14 dagen. Als de besturingselementen, voorbereiden voor twee extra putjes met niet-getransduceerde cellen, één met medium dat puromycin en zonder puromycin. Observeren gedeeltelijke doden van de cellen door puromycin in de put met virus-getransduceerde cellen ten opzichte van controleputjes.
      Opmerking: Niet-getransduceerde cellen zal niet groeien in aanwezigheid van puromycin.
    6. Controleer of de efficiëntie van de voorwaardelijke KD in de puromycin-resistente HCT116 darmkanker en MDA-MB-231 borstkankercellen.
      Opmerking: De effectieve concentratie van doxycycline zal variëren met de cellijn gebruikt en moet worden getitreerd (meestal vanaf 100 ng/mL tot 2 µg/mL).
      1. Bepaal de concentratie van doxycycline dat is niet giftig voor de cellen, maar effectief in downregulating de uitdrukking van de proteïne van belang. In dit protocol werd 1 µg/mL met succes gebruikt in vitro.
      2. Cultuur de cellen gedurende 72 uur in de aanwezigheid en de afwezigheid van 0.1, 1 en 2 µg/mL doxycycline. Controleer of het niveau van expressie van het eiwit werden (hier, PAI-1) in de cel lysate door Western analyse van de vlek. HCT116 en MDA-MB-231 cellen voorwaardelijk uiten shRNA met gecodeerde cellen vergelijken.
  4. Bereiding van geconditioneerde medium
    1. Zaad 1 x 106 cellen stabiel transfected met doxycycline geregeld pLKO-shRNA met lentivirussen in 10 cm schotels.
    2. Groeien cellijnen in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium met 10% Tet-vrije FBS en 1% Pen/Strep in de afwezigheid en aanwezigheid van 1 µg/mL doxycycline gedurende 72 uur bij 37 ° C bij 5% CO2, vers doxycycline dagelijks toevoegen.
      Opmerking: RPMI medium is compatibel met de kweekomstandigheden van monocyten. Doxycycline is een licht gevoelige verbinding. De celculturen beschermen tegen licht door bekleding met aluminiumfolie en Vermijd werken onder directe blootstelling aan licht.
    3. Verzamelen van het medium door pipetteren, filtreer door 0,45 µm filter en bevriezen bij-80 ° C in porties.

2. isolatie van monocyten uit menselijk bloed

  1. Monocyten van perifere bloed te isoleren.
    Opmerking: Menselijke primaire monocyten zijn geïsoleerd van 7 mL witte bloedcellen geconcentreerd in een filter van de leukocyten van gezonde bloedplaatjes donors verlangde. Afhankelijk van de donor produceert een leukocyte filter tussen 1 x 109 en 2 x 109 van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), ongeveer 10% van die monocyten vormen.
    1. Het werkstation in de laminaire flow kabinet voor te bereiden.
    2. Steriliseren schaar en de laminaire flow kast met ultraviolet licht (UV) voor 30 min.
    3. Spray de leukocyten filter met 70% EtOH en aan binnen de laminaire flow kabinet.
    4. Snijd beide uiteinden van de leukocyten filter met een schaar en leeg van de inhoud van het filter in een tube van 50 mL.
    5. Verdun tot 90 mL door PBS, met 1% (v/v) FBS (PBS/FBS) toe te voegen.
    6. 3 x 50 mL tubes met 15 mL dichtheid kleurovergang voor te bereiden. Langzaam 30 mL PBS/FBS verdunde bloed laag over de dichtheid kleurovergang oplossing met behulp van een pipet controller op gravitationele stroom instellen om te voorkomen dat het mengen van de lagen.
    7. Centrifugeer in een schommel rotor bij 400 x g bij RT zonder remmen gedurende 25 minuten.
    8. De bovenste laag vervreemden en overdracht van de middelste laag met PBMCs tot een verse 50 mL koker.
    9. Voeg DAT PBS/FBS tot 50 mL en centrifugeer bij 120 x g bij RT gedurende 10 min. verwijderen het supernatant met bloedplaatjes. Herhaal deze stap twee meer tijden.
    10. Resuspendeer de pellet in PBS/FBS 50 mL en tellen de PBMCs met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer bij 120 x g bij RT en resuspendeer de pellet in PBS/FBS met 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (PBS/FBS/EDTA) om een eindconcentratie van 5 x 107 cellen/mL.
    11. Gebruik een negatieve selectie kit te verrijken monocyten door uitputting van niet-monocytic cellen.
      Opmerking: De negatieve selectie kit maakt gebruik van een cocktail van antilichamen (CD2, CD3 CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 en glycophorin A) tegen T cellen, NK cellen, neutrofielen, B cellen, granulocyten en erytrocyten. De antilichaamcomplexen binden aan het oppervlak van deze niet-monocytic cellen en de dextran magnetische deeltjes. Wanneer de buis in een magneet is geplaatst, de kralen vasthouden aan de muren van de buis en de niet-monocytic cellen verwijderen uit de oplossing.
      1. Voeg 50 µL het antilichaam cocktail tot 1 mL van 5 x 107 PBMCs/mL, meng met een pipet, Incubeer gedurende 10 min op RT. toevoegen 50 µL magnetische kralen aan de PBMCs met het antilichaam cocktail, meng met een pipet en incubeer gedurende een ander 10 min op RT.
      2. PBS/FBS/EDTA optellen tot 25 mL en plaats het PBMC mengsel in een magneet die geschikt is voor een tube van 50 mL. Incubeer gedurende 10 min op RT. magnetische kralen zal vasthouden aan de muren van de buis en de niet-monocytic cellen uit de oplossing sekwestreren.
    12. Met behulp van een precisiepipet 25 mL, verwijder de oplossing met monocyten uit de buis in de magneet. Wees voorzichtig om niet raken de zijkanten van de buis met de pipet.
    13. Centrifugeer de oplossing bij 250 x g bij RT, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet monocyten in RPMI medium met 10% Tet-vrije FBS en 1% met Pen/Strep.

3. Boyden kamer migratie Assay

  1. Bereid 1% (m/v) bovien serumalbumine (BSA) oplossing door ontbinding van 1 g BSA in 100 mL ultrazuiver water en filtreer door een 0,2 µm poriegrootte te steriliseren.
  2. Incubeer de poreuze membraan inserts in 1% steriele BSA oplossing O/N voor betere hechting van macrofagen naar het membraan. Gebruik voor monocyten/macrofagen, 5-8 µm porie grootte inzetstukken.
    1. Vul een steriele weefselkweek schotel met 1% BSA oplossing en plaats de inserts in de schotel. Breng 200 µL 1% BSA oplossing binnen de inserts.
  3. Wassen de inserts tweemaal door ze te plaatsen in een schotel gevuld met steriel PBS en toepassen PBS binnen het filter.
  4. Zaad van 40.000 HCT116 of MDA-MB-231 cellen in 0,5 mL RPMI medium met 10% Tet-vrije FBS en 1% Pen/Strep per putje, in een 24-well plaat, in drievoud. U kunt ook plaats 0,5 mL van eerder gegenereerde geconditioneerde medium in de put als een bron van chemoattractant.
  5. Plaat 8.000 monocyten in het voorbereide plaats in 0.3 mL volume van het medium van de RPMI met 10% Tet-vrije FBS en 1% op de volgende dag, Pen/Strep, in drievoud, en Incubeer bij 37 ° C bij 5% CO2.
  6. Verzamel de inserts na 48u.
    Opmerking: De duur van een experiment moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van de specifieke omstandigheden en de cellen die worden gebruikt, door het uitvoeren van een tijdsverloop experiment waar inzetstukken op verschillende incubatie tijdstippen worden verzameld.
    1. Het overtollige medium afschudden en juist jat de binnenzijde met een katoen-tipped applicator voor het verwijderen van cellen die niet migreren.
    2. De buitenzijde van de tussenvoegsels met behulp van de methode Wright-Giemsa vlek.
    3. Zorgvuldig monteren 3 inzetstukken/glasplaatje in een hoge viscositeit Microscoop onderdompeling olie, ervoor te zorgen dat de kant van het filter met gemigreerde macrofagen omhoog gezichten.
  7. Het imago van de dia's met behulp van een lichte Microscoop met 20 X doelstelling. Neem foto's van 9 velden/filter. Tellen gemigreerde macrofagen in 9 velden/filter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drie shRNA sequenties werden getest voor de meest efficiënte KD van PAI-1. Hiervoor werden shRNA sequenties tegen PAI-1 en roerei (tabel 1) gekloond in Tet-pLKO-puro expressie vector volgens het protocol zoals hierboven beschreven. De cellijn van de HT-1080-fibrosarcoma was stabiel transfected met gegenereerde constructies en de cellen werden behandeld met doxycycline gedurende 3 dagen. De expressie van PAI-1 werd gecontroleerd door Western blotting ()

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samengesteld van allerlei soorten cellen, is de TME cruciaal voor de ontwikkeling van kanker. Om na te gaan van optimale groei-omstandigheden, trekken kankercellen monocyten door afscheiding van Chemotactische factoren. Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van het mechanisme van monocyt werving door tumor cellen in vitro. Voor dit doel, wordt een combinatie van afleidbare gen expressie systeem, zuivering van primaire menselijke monocyten, en als een voorbeeld van een migratie assay, de Boyden kam...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs wil erkennen Jacqueline Rosenberg voor proeflezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de ons Department of Health and Human Services/National Institutes of Health met een grant to YA DeClerck (verlenen 5R01 CA 129377) en de Stichting van de Martell TJ. MH Kubala is de ontvanger van een onderzoek carrière ontwikkeling Fellowship award van de Sabaanse Research Institute op het Children's Hospital Los Angeles.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tet-pLKO-puro lentiviral vectorAddgene21915
FBS (Tetracycline-free)Omega ScientificFB-15
HistopaqueSigma10771-500ML
EasySep Human Monocyte Enrichment KitStemCell19059
EasySep MagnetStemCell18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
Cut Smart bufferNEBB7200S
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup SystemPROMEGAA9281
psPAX vectorAddgene12260
pMD2.G vectorAddgene12259
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC737303
Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stainProtocol123-869
HEK293 cellsATCCCRL-1573
PBSCorning21-031-CV
XhoI restriction enzymeNEBR0146S
LigaseNEBM0202S
Ligase bufferNEBM0202S
EDTA 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificR1021
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
The Big Easy" EasySep MagnetStem Cell18001
0.1% Poly-L-Lysine solutionSigma-AldrichP8920
Sodium AcetateSigma-AldrichS7670
Sodium butyrateSigma-AldrichB5887
0.45 μM syringe filtersVWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Invitrogen15504-020
Sodium Chloride(NaCl)Sigma-AldrichS7653-5 kg
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-100g
dithioerythritol (DTE)Sigma-AldrichB8255-5g
ethanol (EtOH)Sigma-Aldrich792780
tryptoneAmrescoJ859-500g
yeast extractFluka70161-500g
Bacto agarBD214010
ampicillinSigma-AldrichA9393-5g
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Corning10-013-CV
phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375
puromycinSigma-AldrichP9620
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Corning10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0Thermo Fisher ScientificR1021
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET MembraneBecton Dickinson353097
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906
Cotton-Tipped Applicator MedlineMDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack Fisher Scientific Company123-869
Resolve Immersion Oil, High ViscosityRichard Allan ScientificM4004
Penicillin StreptomycinGibco15140122

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
  4. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
  7. Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
  8. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  9. Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
  10. Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
  11. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
  12. Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
  13. Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
  14. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  15. Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
  16. Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
  17. Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
  18. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972(2013).
  19. Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
  20. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  21. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  22. Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
  23. Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
  24. Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
  25. Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
  26. Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
  27. Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
  28. Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
  29. Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
  30. Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
  31. Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
  32. Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
  33. Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
  34. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
  35. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  36. Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tet ON SystemMonocyte MigrationWestern Blot AnalysisDensity Gradient CentrifugationBoyden Chamber AssayPAI 1 Protein

Gerelateerde artikelen