Kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (DHM)

Summary

Digitale holografische microscopie (DHM) is een volumetrische techniek waarmee imaging monsters die 50-100 X dikker dan helderveld microscopie bij vergelijkbare resolutie, met scherpstellen uitgevoerd na verwerking. Hier DHM wordt gebruikt voor het identificeren, tellen, en bijhouden van micro-organismen bij zeer lage dichtheden en vergeleken met metingen van de optische dichtheid, kiemgetal, en directe.

Abstract

Nauwkeurig detecteren en tellen sparse bacteriële monsters kent vele toepassingen in de voedingsmiddelen, dranken en farmaceutische verwerkingsindustrie, in de medische diagnostiek, en voor de detectie van het leven door robotic missies naar andere planeten en manen van het zonnestelsel. Momenteel worden schaars bacteriële monsters geteld door cultuur beplating of epifluorescence microscopie. Cultuur platen vereisen lange incubatie tijd (dagen tot weken), en epifluorescence microscopie vereist uitgebreide kleuring en concentratie van het monster. Hier laten we zien hoe off-axis digitale holografische microscopie (DHM) te gebruiken bij het inventariseren van bacteriën in zeer verdunde culturen (100-10⁴ cellen/mL). Eerst, de bouw van de aangepaste DHM is besproken, samen met gedetailleerde instructies voor het bouwen van een low cost-instrument. De beginselen van holografie worden besproken, en een statistisch model is gebruikt om te schatten hoe lang video's moeten worden om op te sporen cellen, op basis van de kenmerken van de optische prestaties van het instrument en de concentratie van de bacteriële oplossing (tabel 2) . Video detectie van cellen op 10⁵, 10⁴, 10³, en 100 cellen/mL wordt gedemonstreerd in real time via un-gereconstrueerde hologrammen. Wederopbouw van amplitude en fase beelden is aangetoond door middel van een open-source softwarepakket.

Introduction

Bepaling van nauwkeurige bacteriële graven in zeer verdunde monsters is van cruciaal belang in vele toepassingen: een paar voorbeelden zijn water en voedsel kwaliteit analyse^1,2,3; opsporing van ziekteverwekkers in het bloed, cerebrospinaal vocht of sputum^4,5; productie van farmaceutische producten, met inbegrip van steriel water⁶; en milieu Gemeenschap analyse in oligotrofe omgevingen zoals de open oceaan en sedimenten^7,8,

Protocol

1. groei en opsomming van bacteriën

Opmerking: Dit geldt voor bijna elke bacteriële stam geteeld in de passende middellange ³⁶. In ons voorbeeld gebruiken we drie stammen: Serratia marcescens als een gemeenschappelijk, eenvoudig identificeerbare lab stam; en een kleinere, zeer motile milieu stam, Shewanella oneidensis heer-1. Als u wilt vergelijken detectie van motile vs. niet-sporenvormende cellen, niet-sporenvormende Shewanella mutant, Δ FlgM, wordt ook gebruikt voor vergelijking ³⁷. Alle stammen worden gekweekt in lysogenie Bouillon (LB).

1. Voorbereide....

Results

De resultaten dienen de mogelijkheid om te detecteren van levende en dode bacteriën op een zeer laag niveau door DHM op te geven. Het aantal bacteriën geteld moeten in overeenstemming zijn met de resultaten die zijn verkregen met behulp van de Petroff-Hauser tellen kamer en plaat graven. Standaard statistische methoden geven informatie over de nauwkeurigheid van de verschillende detectiemethoden bij verschillende bacteriële concentraties.

Discussion

Numerieke wederopbouw van hologrammen: voor de numerieke wederopbouw van hologrammen, de hoekige spectrum methode (ASM) wordt gebruikt. Het gaat hierbij om de convolutie van het hologram met de Greense functie voor de DHM. De complexe wavefront van de afbeelding op een bepaalde brandvlak kan worden berekend door gebruik te maken van de Fourier convolutie stelling als volgt:

(1)

Waar

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Yeast	BD Biosciences	212750
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7710	Many options for purchase
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
10 cm Petri dishes	VWR	10053-704
15 mL culture tubes	Falcon (Corning Life Sciences)	352002	Loose-capped
Petroff-Hauser chamber	Electron Microscopy Sciences	3920
10 mL syringes	BD Biosciences	309604	Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting	McMaster-Carr	51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow	Nalgene	8000-0004	Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000
Sample Chamber	Custom	n/a	See Materials Section
Holographic Microscope	Custom	n/a	See Wallace et al.
Open-source software	Custom	https://github.com/bmorris3/shampoo