Massa isolatie en In Vitro kweek van Intramolluscan stadia van de menselijke bloed Fluke Schistosoma Mansoni

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een protocol voor de grootschalige een isolatie en verzameling van vrijzwemmende miracidia van de menselijk bloed fluke Schistosoma mansoni en hun verdere verwerking voor in vitro cultuur binnenbrengen.

Samenvatting

Menselijk bloed staartvinnen, Schistosoma spp., hebben een complexe levenscyclus met ongeslachtelijke en seksuele ontwikkeling fasen binnen een slak intermediaire en zoogdieren definitieve gastheer, respectievelijk. De mogelijkheid om te isoleren en in stand houden van de fasen van de levenscyclus van de verschillende omstandigheden in vitro cultuur heeft sterk vergemakkelijkt onderzoek naar de cellulaire, biochemische en moleculaire mechanismen tot regeling van de parasiet groei, ontwikkeling en gastheer interacties. Transmissie van schistosomiasis vereist ongeslachtelijke voortplanting en ontwikkeling van meerdere larvale stadia binnen de slak host; vanuit de infectieuze miracidium, door middel van primaire en secundaire sporocysts, naar de eindfase van de cercarial is dat besmettelijk voor de mens. In deze paper presenteren we een stapsgewijze protocol voor massale broedeieren en isolatie van Schistosoma mansoni miracidia van eieren die zijn verkregen uit de lever van geïnfecteerde muizen en hun latere invoering in in vitro cultuur. Verwacht wordt dat het gedetailleerde protocol nieuwe onderzoekers deelnemen en verbreden van dit belangrijke terrein van Schistosoma onderzoek zal bevorderen.

Inleiding

Het menselijk bloed staartvinnen Schistosoma spp., zijn de causatieve agenten van schistosomiasis, een verwaarloosde tropische ziekten teistert een geschatte 230 miljoen mensen wereldwijd¹. De meest voorkomende soort, Schistosoma mansoni, is geografisch verdeeld in Zuid-Amerika, de Caribische archipel, het Midden-Oosten en sub-Saharisch Afrika². De levenscyclus van S. mansonien andere schistosomes, is complex, waarbij een zoogdieren definitieve host en zoetwater slakken van het geslacht Biology die als obligate intermediaire gastheer dienen.

S. mansoni mannelijke en vrouwelijke volwassen worm paren leven in de achterste mesenterische aders van de zoogdieren host reproduceren, resulterend in de release van bebroede eieren (ova) die worden ingediend in de kleine venules van de intestinale mucosa. Eieren vervolgens breekt door de muren van het vaartuig, migreren door mucosal weefsels, en uiteindelijk Voer de intestinale lumen waar zij met de uitwerpselen zijn ongeldig. Wanneer eicellen zoetwater en vrijzwemmende larven (miracidia) broedsel invoert, moeten in korte orde, vinden ze een geschikte Biology slak te infecteren om voort te zetten van de levenscyclus. Deze infectie-proces omvat miracidial gehechtheid aan de slakkengang buiten lichaamsoppervlak gevolgd door actieve penetratie en vermelding van de larve in de gastheer. Kort na binnenkomst begint het miracidium te werpen haar ciliated epidermale Buitenlamellen zoals het vormt een syncytium die als de nieuwe buitenoppervlak (vlies) van de volgende larvale stadium, de primaire of moeder sporocyst fungeren zal. Door middel van ongeslachtelijke voortplanting, elke primaire sporocyst produceert en een tweede generatie van sporocysts, het zogenaamde secundaire of dochter sporocysts, die op zijn beurt, genereren en vrijgeven van grote aantallen van de laatste fase van de intramolluscan, de cercaria³ releases . Bij ontsnappen uit de slak host zijn vrijzwemmende cercariae geschikt voor het aansluiten en direct het penetreren van de huid van een mens of andere geschikte zoogdieren gastheer. Bij binnenkomst in hun nieuwe host, cercariae transformeren naar de parasitaire schistosomula fase en het vasculaire systeem binnen te dringen. Zij, beurtelings, migreren naar de longen en vervolgens naar de hepatische ader waar ze rijpen tot volwassen wormen, mannelijke en vrouwelijke paren vormen en reizen naar de mesenterische aderen te voltooien hun levenscyclus.

Geslaagd intramolluscan of "slak fase" ontwikkeling van larvale schistosomes is essentieel voor de voortzetting van de cyclus van menselijke host-naar-host-transmissie. Is de periode van de volgende vermelding van de vrijzwemmende miracidium in de slak host en haar vroege transformatie tot het stadium van de primaire sporocyst van cruciaal belang. Afhankelijk van de fysiologische en immunologische compatibiliteit tussen host en parasiet is het in deze fase van larvale ontwikkeling dat eerste succes of falen om infecties is vastbesloten^4,5,6 . Verdere ontwikkeling van de primaire sporocysts geschikt voor het produceren aardlingen secundaire sporocysts, die vervolgens mens-infectieuze cercariae genereren, verder vereisen een tolerante fysiologische hostomgeving dat voorziet in alle van de parasiet groei en reproductieve moet.

Tot op heden, is weinig bekend over de onderliggende fysiologische, biochemische en moleculaire processen controleren Schistosoma-slak interacties, met name de moleculen en de trajecten betrokken bij larvale ontwikkeling en voortplanting reguleren of modulerende de immuunrespons van de gastheer. Eenvoudige toegang tot grote aantallen van deze larvale stadia omstandigheden in vitro cultuur waarmee experimentele manipulatie zou aanzienlijk vergemakkelijken de ontdekking van ontwikkelings trajecten en onderliggende mechanismen van celgroei, differentiatie en reproductie. Kritische parasiet trajecten of mechanismen, vastgesteld door middel van in vitro experimenten, kunnen vervolgens worden gebruikt larvale groei/reproductie in de slak host verstoren, of identificeren van slak host immuun mechanismen die betrokken zijn bij de erkenning en de eliminatie van de stadia van miracidial of sporocyst.

In dit artikel en een video presentatie, wij bieden een gedetailleerde beschrijving van een methode voor het isoleren van grote aantallen vrijzwemmende S. mansoni miracidia voor in vitro cultuur die vervolgens kan worden onderworpen aan follow-up experimentele binnenbrengen manipulatie (Zie Figuur 1 voor een schematisch overzicht van de werkstroom protocol). Hoewel soortgelijke procedures zijn beschreven eerder^7,8,9, vonden we dat een gedetailleerd protocol nuttig voor onderzoekers die tewerkstellen van dit model aan te pakken nog steeds onbeantwoorde vragen met betrekking zijn zou willen tot intramolluscan larval ontwikkeling, cellulaire proliferatie en Schistosoma-slak immuun-interacties. Bovendien, zou kunnen deze aanpak gemakkelijk worden aangepast voor isolatie van eieren uit andere medisch belangrijke darm zoals blaas-woning S. haematobium, staartvinnen lever of Long staartvinnen.

Protocol

Alle dierenverzorgers en experimentele procedures werden goedgekeurd door het dier zorginstellingen en gebruik Comité van de Universiteit van Wisconsin-Madison onder Protocol geen. V005717. Het volgende protocol betekent werken in een Biosafety Level 2 (BSL2)-faciliteit voor menselijke pathogenen, hoewel geen van de stadia van de Schistosoma afgebeeld in dit protocol besmettelijk voor mens of andere zoogdieren zijn. Volg institutioneel beleid voor de verwerking van risico groep 2 (RG2) menselijke pathogenen.

Opmerking: We gebruiken vrouwelijke Swiss-Webster muizen (6 - week oud) als gevolg van hun hogere gevoeligheid voor infectie¹⁰, waardoor grotere ei lasten oplevert. Tucker et al. beschrijven de slak en muis infectie-protocollen die worden gebruikt in dit systeem model¹¹. De Tabel van materialen staan alle specifieke uitrusting, materialen, reagentia en dierlijke bronnen die nodig zijn voor het uitvoeren van deze experimentele protocol.

1. de verwerking van besmette levers

1. Euthanaseren muizen, 6-7 weken na infectie, door CO₂ verstikking (snelheid van 10-30% van het volume van de kamer per minuut). Monitor muizen voor beëindiging van de ademhaling en hartslag.
   Opmerking: Doorgaans tot 20 muizen mogen worden verwerkt op een bepaald moment.
2. Na het overbrengen van euthanized muizen een kabinet bioveiligheid, plaats van muizen op hun rug en hun ventrale oppervlak spuiten met 70% ethanol. Laat weken voor 1 min.
3. Knijpen en optrekken van de huid van de onderbuik en dwars door de basis van de beknelde huid zich het dichtst bij de buik met een steriele chirurgische schaar. Trek de gesneden huid anteriorly (dat wil zeggen, naar het hoofd) te onthullen van de lever. Merk op dat de lever moet worden vergroot en als gevolg van een ei-geïnduceerde granulomateuze reactie (figuur 2A gevlekt).
4. Verwijderen van de lever en plaats deze in een bekerglas van 200 mL steriele 1,2% NaCl oplossing met pen/strep.
5. Herhaal stap 1.3 en 1.4 met resterende muizen.
   Opmerking: Twintig muizen worden meestal verwerkt in een één oogst.
6. Plaats de lever in een steriele petrischaal en verwijder niet-lever vet/bindweefsel met steriel pincet.
7. Bijgesneden/schoongemaakt levers overbrengen in een fles van de steriele 250 mL centrifuge met ~ 200 mL steriele 1,2% NaCl-oplossing met pen/strep.
8. Krachtig schudden van de fles met de lever en met behulp van een steriele Wegwerp pipet, het verwijderen van de overtollige oppervlak schuim/zwevend puin. Langzaam uit de resterende zoutoplossing giet in een container of wastafel met 1% bleekwater (ontsmettingsmiddel).
9. ~ 200 mL verse zoutoplossing aan de levers toevoegen en herhaalt u stap 1.8 drie keer.

2. lever extractie en miracidial isolatie

1. Plaats de lever in een kleine steriele roestvrij stalen blender beker en voeg ~ 2 mL van 1.2% NaCl-oplossing (figuur 2B).
2. Dekking van de cup met folie en een petrischaal ter voorkoming van lekkages, en mix voor 1 min door afwisselend hoge en lage snelheid (20 s lage snelheid/10 s hoge snelheid; herhaling) (figuur 2C).
3. Verdeel de blended lever schorsing in steriele 250 mL centrifuge flessen (voor 20 levers gebruik 4 flessen).
4. Steriele zoutoplossing met antibiotica aan ~ 200 mL totale volume/fles toevoegen. Weeg-/ balans flessen vóór centrifugeren.
5. Centrifuge de blended levers bij 290 x g gedurende 15 min bij 4 ^oC. zachtjes af supernatant in een container met bleekmiddel vóór de teruggooi giet.
6. Herhaal stap 2.4-2.5 keer. Zorg ervoor dat grondig resuspendeer lever sediment vóór centrifugeren.
7. Na het verwijderen van de laatste saline wassen (stap 2.6), 200 mL steriele vijverwater met pen/strep toevoegen aan de Ingehuld leverweefsel, schudden om resuspendeer sediment, en spoel de suspensie met een gesteriliseerde maatkolf van de 1-L dat volledig met aluminium bedekt is folie, met uitzondering van de bovenkant 3 cm van de hals (figuur 2D).
   Opmerking: Gebruik twee flessen (= 10 levers) per 1-L-kolf. Vijverwater simuleert de natuurlijke zoetwater omgeving nodig ter stimulering van miracidial uitbroeden van de eieren.
8. Met behulp van steriele vijverwater, vullen opwaarts naar de kolf tot ongeveer 3 cm boven de folie die betrekking hebben op de nek. Dan, zonder vertraging (zoals miracidia binnenkort beginnen om uit te komen), verwijderen van de resterende schuim en leverweefsel drijvend aan de oppervlakte door snel pipetteren tot ~ 12 mL vijverwater met puin en teruggooi het in een aparte buis negeren. Vervangen door nieuwe steriele vijverwater.
9. Herhaal schoonmaak stap 2.8, drie keer, controleren op aanwezigheid van miracidia in de buis van de teruggooi. Niet langer de herhaling van de reiniging van stap als miracidia in de wash-oplossing verschijnen.
10. Na de laatste wash, Voeg langzaam ~ 12 mL warme steriele vijverwater (vooraf opgewarmd tot 30 ^oC) een temperatuur om verloop te maken met schone, steriele warm water bovenop.
    Opmerking: Dit is het beste gerealiseerd door langzaam ontladen water langs de kant van de hals van de kolf te mengen.
11. Plaats een kleine petrischaal cover over de opening van de kolf en een helder licht schijnen over de bovenkant van de kolf boven de folie cover voor het verlichten van de hogere oppervlakte van water.
    Opmerking: Meestal binnen 5-10 min, zwemmen miracidia, aangetrokken door het licht, zal concentreren in groten getale binnen de eerste 2-3 cm voor vijverwater (figuur 3A).

3. Miracidial oogsten en teelt

1. Wanneer miracidia hebben vergaard op het oppervlak na 10 min, met behulp van een steriele overdracht Pipetteer, ~ 8 mL vijverwater en overdracht aan een steriele 15 mL centrifugebuis verwijderen. Plaats de buis met miracidia op ijs.
2. Voeg terug 8 mL warme steriele vijverwater langs de binnenkant van de maatkolf en wacht een ander 10 min.
3. Met nieuwe buizen telkens, herhaal stap 3.1 en 3.2 drie keer. Na de 4^th -collectie, houden de laatste buis op ijs gedurende 10 minuten zodat de miracidia te regelen. Deze set van buizen bestaat uit de eerste oogst.
4. Centrifuge buizen met miracidia bij 290 x g gedurende 1 minuut op 4 ^oC in een vooraf gekoeld, gekoelde centrifuge.
5. Onmiddellijk verwijderen van de meeste van de bovendrijvende substantie (~ 7 mL) voorzichtig niet te verstoren, de parasiet pellet (figuur 3B).
6. Zwembad alle miracidia uit deze eerste oogst in een buis, dan spoel alle van de oorspronkelijke buisjes met ~ 1 mL steriele vijverwater en toevoegen aan de "gebundelde" buis.
7. Toestaan van parasieten te vestigen op ijs voor ~ 5 min, en nogmaals centrifugeren van de parasieten bij 290 x g gedurende 1 minuut op 4 ^oC.
8. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en voeg dat 6-8 mL steriel Chernin evenwichtig zoutoplossing (CBSS +; zie tabel van materialen) met pen/strep.
9. Zachtjes de miracidia en aliquot hen in een 24-well cultuur plaat (1 mL per putje), gevolgd door de buis te spoelen in 6-8 mL CBSS + en toevoeging van 1 mL voor rinse aan elk putje opschorten. Incubeer parasieten bij 26 ^oC onder normoxic omstandigheden. Concentraties van geïsoleerde miracidia zal variëren, maar zal meestal gemiddeld ~ 7000/mL.
10. Als parasieten nog steeds te op de lichtbron concentreren zijn, herhaalt u stappen 3.1 tot 3.9 te blijven oogsten van eind-broedeieren miracidia maar verhogen het tijdsinterval tussen collecties aan 15-20 min.
    Opmerking: Deze nieuwe reeks buizen vertegenwoordigt de tweede oogst. Echter, omdat miracidial nummers meestal lage zijn, larven van alle buizen meestal zijn gebundeld in een enkele cultuur putje met 2 mL CBSS +.
11. Op 24u na de oogst en teelt, resuspendeer zachtjes sporocysts in hun putten door pipetteren.
12. Wacht een paar minuten om parasieten te vestigen aan de onderkant van de putten. Zodra zij hebben geregeld, verwijder voorzichtig het supernatant (~1.5 mL), dat de meeste van de ciliated epidermale platen werpen door miracidia tijdens de larvale transformatie zal bevatten. Deze "transformatie" supernatant kan worden verwijderd of opgenomen in de vervolgstudies van larvale secretoire producten.
13. 1,5 mL verse CBSS + aan elke goed en voorzichtig pipet aan resuspendeer sporocysts toevoegen. Herhaal stap 3.12 desgewenst verder wassen of omzetten in een ander medium is.

Resultaten

De overgrote meerderheid van miracidia zal meestal zijn verzameld in de eerste twee "oogsten". Incubatie van geïsoleerde miracidia in CBSS + Triggert het miracidium-aan-sporocyst transformatieproces (Figuur 4A- C). Binnen het eerste uur wells volgende overdracht aan cultuur met CBSS +, de meerderheid van de miracidia staken zwemmen (figuur 4A). Om 6 uur in cultuur momenteel miracidia actief vergieten hun ciliated...

Discussie

Miracidia van S. mansoni, geïsoleerd en gemanipuleerd zoals hierin beschreven kunnen infecteren alleen de slak tussengelegen host, en dus niet vertegenwoordigen een menselijke biohazard tijdens deze fase van larvale ontwikkeling. Echter, accidentele blootstelling/om infectie te voorkomen van slakken, moet worden gewaakt voor het uitvoeren van miracidial isolatie op een andere locatie van gebieden waar ziektegevoelige Biology slak aanwezig of onderhouden kan worden. Een logeerkamer, geregistreerd als BSL...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chernin's balanced salt solution (CBSS+)			Voor 1L oplossing
2,8 g natriumchloride	Fisher Scientific	S271-3	Los zouten op, behalve calciumchloride en
0,15 g kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P5405	suikers in 800 mL ddH2O
0,07 g natriumfosfaat, dibasisch watervrij	Fisher Scientific	S374-500	Los calciumchloride apart op in 200
0,45 g magnesiumsulfaat heptahydraat	Sigma-Aldrich	M1880	mL ddH2O
0,53 g calciumchloride dihydraat	Mallinckrodt	4160	Voeg langzaam calciumsoort toe aan de zouten/suikeroplossing met
0,05 g natriumbicarbonaat	Fisher Scientific	S233-3	met constant mengen
1 g glucose	MP Biomedicals	152527	Pas aan op pH 7,2 en filter steriliseer met een
1 g trehalose	Sigma-Aldrich	T0167	0,22 µm wegwerpflesapfilter
10 mL 100X penicilline/streptomycine	Hyclone	SV30010	Voeg gefilterde penicilline en streptomycine oplossing toe  voor gebruik
Incompleet Bge  medium (Ibge)			Voor 900 mL oplossing
220 mL Schneider’s Drosophila medium gemodificeerd	Lonza	04-351Q	Meng Schneider's medium met 680 mL ddH2O
4,5 g lactoalbumine enzymatisch hydrolysaat	Sigma-Aldrich	L9010	Voeg lactoalbumine hydrolysaat en galactose toe
1,3 g galactose	Sigma-Aldrich	G0625	Pas aan op pH 7,2 en filter steriliseer met een 0,22 µm voorgesteriliseerde wegwerpflesapfilter
Compleet Bge medium (cBge)			Voor 100 mL oplossing
90 mL Incompleet Bge medium			Om FBS thermisch te inactiveren: Incubeer ontdooid FBS in
9 mL thermisch inact. foetaal bovien serum (FBS) (Optima)	Atlanta Biologicals	S12450	waterbad op 60°C gedurende 1 uur terwijl u zachtjes
1 mL 100X penicilline/streptomycine	Hyclone	SV30010	de fles elke 10 min draait Verdeel thermisch inactief FBS in 15-mL buisjes  en bewaar op -20°C.  Meng medium + FBS en filter steriliseer met een 0,22 µm voorgesteriliseerde  wegwerpflesapfilter  Voeg penicilline en streptomycine toe voor gebruik
Pond water (stamotoplossing)			1L stamotoplossing
12,5 g calciumcarbonaat	Fisher Scientific	C64-500	Meng alle zouten in 1L ddH2O
1,25 g magnesiumcarbonaat	Fisher Scientific	M27-500	Merk op dat de zouten niet volledig
1,25 g  natriumchloride	Fisher Scientific	S271-3	opgelost zullen zijn.  Schud krachtig om
0,25 g  kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P5405	zouten op te schorsen voor het maken van de werkoplossing
Pond water (werkoplossing)			1,5L oplossing
0,8 mL stamotoplossing pond water (schudden voor gebruik) in			Meng stock tot ddH2O
1500 mL ddH2O			Steriseer pond water door autoclaving (langzame cyclus)
1,5 mL van 100X penicilline/streptomycine	Hyclone	SV30010	Voeg penicilline en streptomycine toe voor gebruik
Zoutoplossing (1,2% NaCl)			1,5L oplossing
18 g natriumchloride in 1500 mL ddH2O	Fisher Scientific	S271-3	Autoclave zout oplossing om te steriliseren
1,5 mL van 100X penicilline/ streptomycine	Hyclone	SV30010	Voeg penicilline en streptomycine toe voor gebruik
Aanvullende apparatuur en materiaal:
7-L muis euthanasiekamer			Volgens goedgekeurd IACUC-protocol nr. V001551
Muizen	Taconic Biosciences		Zwitsers-Webster, vrouwelijk, 6 weken oud, muispathogeen-vrij
CO2 tank en regelaar
24-wells weefselkweekplaat	TPP	92424
1-L volumetrische kolven
Lichtbron (150W)	Chiu Tech Corp	Model F0-150
Centrifuge, gekoeld, zwenkbeker	Eppendorf	Model 5810R
Centrifugeflessen (250 mL)	Nalgene
15-mL centrifugeerbuisjes, steriel	Corning	430053
Steriele wegwerptransferpijpjes	Fisher Scientific	1371120
0,22 µm voorgesteriliseerde wegwerpflesapfilter	EMD Millipore	SCGPS05RE
Roestvrijstalen blender	Waring Commercial	Model 51BL31
Blenderbeker, 100 mL capaciteit