Methodenartikel

Juiste positionering en terughoudendheid van een Rat Hind-Limb voor gerichte hoge resolutie beeldvorming van bot met behulp van de Micro-architectuur In Vivo Micro-berekend tomografie

DOI:

10.3791/56346

⸱

22 november 2017

 ,  , 
1Department of Kinesiology, Faculty of Applied Health Sciences, Brock University, 2Department of Health Sciences, Faculty of Applied Health Sciences, Brock University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit document leest de gebruikers van in vivo de scanners van de micro-berekend tomografie (µCT) hoe anesthetize, correct positie en de hind-limb van een rat voor minimale bewegingen beperken tijdens hoge resolutie beeldvorming van het scheenbeen. Het resultaat is een hoge kwaliteitsbeelden dat kunnen worden verwerkt om te bot-microarchitectuur nauwkeurig te kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van in vivo micro-berekend tomografie (µCT) is een krachtig hulpmiddel waarbij de niet-destructieve beeldvorming van interne structuren bij hoge resoluties in levende dierlijke modellen. Dit zorgt voor herhaalde beeldvorming van het dezelfde knaagdier na verloop van tijd. Deze functie niet alleen het totale aantal van knaagdieren die zijn vereist in een experimenteel ontwerp vermindert en daarmee vermindert de Inter onderworpen variatie die zich kan voordoen, maar ook staat onderzoekers te beoordelen longitudinale of levenslang reacties op een interventie. Afbeeldingen van hoge kwaliteit die kunnen worden verwerkt en geanalyseerd om te kwantificeren nauwkeuriger resultaten van bot-microarchitectuur moeten, gebruikers van in vivo µCT scanners goed anesthetize van de rat, en positie en beperken de hind-limb. Om dit te doen, is het noodzakelijk dat de rat tot een niveau van volledige ontspanning worden verdoofd, en dat pedaal reflexen zijn verloren. Deze richtlijnen kunnen worden gewijzigd voor elke individuele rat, zoals het tarief van Isofluraan metabolisme afhankelijk van de grootte van de spanning en het lichaam variëren kan. Juiste techniek voor in vivo µCT Beeldacquisitie kunt nauwkeurige en consistente meting van bot-microarchitectuur binnen en tussen studies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van in vivo micro-berekend tomografie (µCT) is een krachtig hulpmiddel waarbij de niet-destructieve beeldvorming van interne structuren op hoge resoluties met behulp van knaagdier modellen. De niet-destructieve aard van in vivo µCT maakt het mogelijk voor herhaalde beeldvorming van het dezelfde knaagdier na verloop van tijd. Deze functie niet alleen het totale aantal van knaagdieren die zijn vereist in een experimenteel ontwerp vermindert en daarmee vermindert de Inter onderworpen variatie die zich kan voordoen, maar ook staat onderzoekers te begrijpen op de lange termijn reacties op een interventie. Met het gebruik van herhaalde in vivo µCT, hebben experimenten in muizen en ratten toegelicht developmental wijzigingen om te bot-microarchitectuur en bot mineraal dichtheid (BMD) gedurende de periodes van de levensduur 1,2,3 ,4,5,6,7,8 , alsook de reactie van bot gezondheid op interventies zoals dieet 9,10, ovariotomie 7,11 en12,13van de 8,van de farmacologische agenten. BMD en bot-microarchitectuur op specifieke skelet sites, namelijk het proximale tibia, bovenbeen en lendenwervels, zijn indicatief voor de algemene gezondheid van het been en de risico's van het behoud van een fractuur en zo zijn de primaire maatregelen wanneer het kwantificeren van de reacties op een interventie.

In vivo µCT Beeldacquisitie omvat twee-dimensionale röntgenfoto projecties wordt verworven onder meerdere hoeken, zoals de X-ray bron en detector rond het dier onder onderzoek 14,15 draaien. De kwaliteit van de resulterende afbeelding is afhankelijk van vele factoren, met inbegrip van maar niet beperkt tot: geselecteerd overname parameters (d.w.z.ruimtelijke resolutie, X-ray spanning, stroomsterkte, rotatie stap, toegepaste filter, belichtingstijd), beperkingen van de µCT scanner (d.w.z., scanner gebaseerde artefacten zoals ring artefacten of stof die strepen of gedeeltelijke volume effecten veroorzaken) en juiste positionering en terughoudendheid van het dier. De voormalige twee van deze factoren kan worden gemanipuleerd tot op zekere hoogte door de gebruiker, afhankelijk van de specifieke aftastenmachine, doelstellingen van de studie en de correcties die nodig zijn om te optimaliseren de functie van de scanner of de verwerking van verworven beelden. De laatste van deze factoren, de juiste positionering van het knaagdier vóór het scannen, kan worden bereikt ongeacht de scanner gebaseerde beperkingen of de acquisitie-parameters die zijn geselecteerd om een specifieke studie doelstelling te verwezenlijken. Terwijl vele publicaties waarbij in vivo imaging zijn gepubliceerd in de literatuur 14,15,16,17, klassieke manuscript stijl is zo groot dat gedetailleerde "how to" informatie kan niet worden opgenomen. Daarom is het doel van dit artikel en een video-gids om deze leegte te vullen. Hier willen we gebruikers van in vivo µCT scanners instrueren hoe anesthetize van een rat, en positie en beperken de hind-limb te produceren afbeeldingen van hoge kwaliteit die kunnen worden geanalyseerd om te kwantificeren nauwkeuriger resultaten van bot-microarchitectuur.

Te voorkomen dat belemmeringen van de x-ray lichtbundel door objecten dan de hind-limb zijn noodzakelijk voor het kwantificeren van de nauwkeurigste BMD en bot-microarchitectuur waarden. Als de x-stralen objecten en weefsels van verschillende dikte en dichtheid passeren, zijn enkele van de x-stralen (d.w.z. verzwakt) geabsorbeerd door de materialen die ze passeren. Aangezien de gemeten massa-dichtheid van een monster wordt beïnvloed door de dikte, en de aanwezigheid en de diktes van de omringende weefsels, is het noodzakelijk dat de kalibratie phantoms gebruikt om te bepalen van BMD op dezelfde wijze worden gescand. Daarom, als de X-ray-balk objecten (dat wil zeggen, de staart) passeren vóór of na het passeren van de regio van belang is, deze objecten zal absorberen een deel van de X-ray energieën en zal interfereren met de afbeelding van de transmissie verworven. Bovendien zou deze scans zeer moeilijk te simuleren bij het scannen van de spoken dat op monster scans lijken moeten. Dientengevolge, leiden deze demping verschillen tot onnauwkeurigheid in de evaluatie van BMD metingen van het bot. Dus, voor gemak en nauwkeurigheid, het is best om het aantal obstakels tussen de x-ray-bron, regio van belang en x-stralen detector te beperken.

Longitudinale beoordeling van de botstructuur van een interventie in pre-klinische modellen betrekken de herhaalde verdoving voor het dier te beperken hun beweging tijdens het scannen van protocollen. Verschillende methoden van narcose bestaan om te bedwingen de dieren ondergaan een scan van de µCT, met inbegrip van injecteerbare en inhalant anesthesie 1,2,4,5,6, 12. in tegenstelling tot inhalant anesthetica zoals Isofluraan, herhaalde narcose met behulp van injecteerbare anesthetica leiden tot een vermindering in lichaamsgewicht, chirurgische tolerantie en significante wijzigingen in andere fysiologische parameters in knaagdieren, specifiek ratten en cavia's, suggereren belangrijke contra-indicaties voor herhaald gebruik 18,19,20. Terwijl Isofluraan zeer vluchtige is en voor snelle inductie en herstel zorgt, injecteerbare verdoving agenten produceren verschillende niveaus van anesthesie en tijd onder verdoving is afhankelijk van de spanning, seks, lichaamssamenstelling, snelste staat en circadiane cyclus van de dier. Injecteerbare anesthetica vormen ook extra belemmeringen voor het gebruik ervan, zoals zij zijn zeer geregeld bij de nationale bestuursorganen. Inademing verdoving gaat echter de directe levering in de luchtwegen; Deze methode zorgt voor sneller inductie en herstel tijd en beter controle over de lengte en diepte van anesthesie19,20. Beperkingen aan de inademing verdoving methode betrekken haar eis voor gespecialiseerde verdampen apparatuur en enkele wijzigingen aan de hartslag en bloeddruk tijdens inductie, onderhoud en herstel 18,19.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de Animal Care Comité van Brock University en uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren die zijn vastgelegd door de Canadese Raad van Animal Care 21.

1. met behulp van Isofluraan Gas anesthesie

  1. Vul vooraf het acrylglas incubatie kamer met kwalitatief hoogwaardige O2 in een continue stroom tempo van ongeveer 1-2 L/min vanaf een verdoving machine (aanvullende figuur 1).
  2. De rat overbrengen naar de incubatie kamer staart eerst en het deksel dicht doet incubatie kamer om te maken een luchtdichte zegel.
  3. Begin met het vullen van de incubatie-zaal met veterinaire-grade Isofluraan op 3-4% v/v ontbonden in O2 op een continu debiet van 1-2 L/min (aanvullende figuur 1).
    Let op: Afval verdoving gassen kunnen handlers nadelig beïnvloeden. Een straatveger systeem (dat wil zeggen, een houtskool filter of uitlaat rechtstreeks in een zuurkast) moet altijd op zijn plaats.
  4. Wanneer de rat niet langer kunnen staan is, de rat overbrengen met een gezichtsmasker of een neus kegel ontvangst van 1-3% Isofluraan ontbonden in O2 op een debiet van 1-2 L/min. ratten voornamelijk ademen door hun neus en zo, zolang de neus wordt gedekt door de gezichtsmasker of neus cone, zal er voldoende verdoving levering.
  5. Ophthalmic smering van toepassing op de gevoelige membranen van de ogen te beschermen tegen eventuele ontsnapte Isofluraan gas.
    Opmerking: Zorg ervoor dat ophthalmic smering zonder antibioticum is, als dit van invloed zou kan zijn op de resultaten van een interventie.
  6. Meten van ooglidreflex (oog knippert reactie op zachte stimulatie van ooglidreflex opening) en pedaal (intrekking van hind ledematen in reactie op het knijpen) reflexen; met de toenemende diepte van anesthesie, zal ooglidreflex reflex worden afwezig voordat pedaal reflexen (aanvullende figuur 2).
  7. Wanneer u een passend niveau van de verdoving wordt bereikt en de rat heeft verloren zowel ooglidreflex en pedaal reflexen, bewaren de rat op 0,5-2% Isofluraan ontbonden in O2 op een debiet van 1-2 L/min.
  8. Voortdurend volgen de ademhalingstarief van de rat gedurende de hele procedure een constante visuele door op te houden de rat direct een intern controlesysteem, hetzij via de live-video feed (aanvullende figuur 3).

2. plaatsing en terughoudendheid van de Rat Hind-Limb

  1. Leg de rat in de liggende positie op de koolstof-vezel scanner bed (aanvullende figuur 4).
  2. Beperken van de rechtervoet in een kneedbare, buis, schuim met de tenen uitbreiden uit het uiteinde van de buis. Toepassing tandheelkundige wax om te houden van de voet strak binnen het schuim en band van de buis goed gesloten. Zorg ervoor dat de diameter van de buis houdt de voet genoeg om te passen stevig in de kunststof buis.
  3. Schuif de plastic buis in het X-ray scanner bed (aanvullende figuur 5).
  4. De rat hind-limb uitbreiden totdat het strak. Doen niet te veel uit te breiden het been dat geen schade toebrengen aan de rat (aanvullende figuur 5) omdat dit leiden onvrijwillige beweging in de ledematen als gevolg van de moeizame ademhaling tot kan.
  5. Trek de linker been (niet-gescande hind-limb) samen met de staart uit het gezichtsveld van de scanning en de richting van de romp, uit de buurt van het langere been te scannen.
  6. Beveilig het linkerbeen (niet-gescande hind-limb) en de staart in positie met behulp van plakband. Gebruik geen meer of minder sticky (d.w.z., duct tape of schilder tape) omdat deze materialen de rat of schaden zal wanneer ze zijn verwijderd (plakband) of niet zorgen voor een sterk genoeg greep (schilder tape) (aanvullende figuur 6).
  7. Beveilig de rat lichaam in positie bij de heupen, schouders en hoofd met de plakband. Beveiliging van het gezichtsmasker of neus aan de rat (aanvullende figuur 6).
    Opmerking: DEP de klevende kant naar het plakband om haar vermogen te houden aan de vacht van de rat. DEP de uiteinden van de plakband niet zodat het stevig kan worden bevestigd aan het scannen bed.
  8. Wikkel de rat in dierenartsomslag te beperken van warmteverlies (aanvullende figuur 6).
    Opmerking: Wanneer onder narcose, ratten verliezen warmte snel als gevolg van hun grote oppervlak tot lichaam gewicht verhouding 19,20.
  9. Voortdurend volgen de ademhalingstarief van de rat gedurende de hele procedure een constante visuele door op te houden de rat (hetzij rechtstreeks, hetzij via een live-video feed).
    Opmerking: Hier instellen duurt 5 min, scan overname is overname afhankelijk van de instelling en hersteltijd is 60 minuten.
  10. Ga verder met het verwerven van de beelden van de µCT.
    Opmerking: De exacte specificaties voor scan overname zijn specifiek voor elke scanner type, softwaresysteem en de specifieke onderzoeksvraag, echter verscheidene methodologische publicaties bestaan in de literatuur 1,2 , 9.

3. herstel van anesthesie

  1. Na in vivo µCT scannen voltooid is, de stroom van Isofluraan aan de rat stoppen maar handhaven van een 1-2 L/min-stroom O2.
  2. Wanneer de rat herwint motorische controle (1-2 min), verwijderen uit de respirator en laat ze herstellen individueel in een kooi geplaatst gedeeltelijk op een algemene verwarming pad op laag vuur. Ratten zijn bekend om hun lichaamstemperatuur met 1 ° C wanneer onder algemene verdoving19. Laat niet de rat zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen.
    Opmerking: Anekdotisch bewijs van onze onderzoeksgroep meldt dat direct na terugwinning van Isofluraan anesthesie, ratten beginnen te eten en het is dus belangrijk te hebben van hun voedsel en water tot hun beschikking tijdens het herstel. Hoewel we dit gedrag hebben waargenomen, veroorzaakt herhaalde algemene anesthesie geen een aanzienlijke stijging in voedsel inname of lichaam gewicht 1,9.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode van anesthesie voor de rat, en de positionering en de terughoudendheid van de hind-limb beelden voor in vivo µCT imaging de verwerving van hoge kwaliteit vergemakkelijkt geschikt zijn voor de analyse van tibia-microarchitectuur. Juiste positionering van de rat hind-limb impliceert het been volledig uitgeschoven worden en de gehele voet en enkel op schuim (figuur 1A) wat resulteert in een verworven foto van voldoende kwaliteit voor analyse van de trabecular en corticale micro-architectuur (gefixeerd Figuur 1B). Onvoldoende plaatsing en terughoudendheid van de hind-limb (Figuur 1 c) kunnen leiden tot beelden met bewegingsartefacten (Figuur 1 d), terwijl een staart die niet volledig verwijderd uit het scannen gezichtsveld (figuur 1E) met X-ray interfereren zal demping door de gescande monsters (figuur 1F) en het veranderen van BMD en weefsel mineraal dichtheid (TMD) metingen. Deze plaatsing berichten zal resulteren in een slechte kwaliteit scannen die niet verder moet worden geanalyseerd. Bereiken afbeeldingen van slechte kwaliteit zal veranderen de kwantificering van de fijn trabecular netwerk en corticale structuur van de hind-limb en zal produceren ongepaste of twijfelachtige gegevens14.

figure-results-1
Figuur 1. Representatieve beelden van plaatsing van de rat hind-limb en bijbehorende verworven beelden van de proximale tibia in doorsnede.
(A) juiste plaatsing van de rat hind-limb met de enkel volledig gefixeerd in schuim, been uitgebreid en staart getrokken uit de buurt van de tibia biedt voldoende beeldkwaliteit in (B) de doorsnede van het scheenbeen en trabecular en corticale micro-architectuur. (C) onjuiste plaatsing van de rat hind-limb met het been niet volledig uitgeschoven en enkel niet volledig gefixeerd in schuim kan leiden tot (D) bewegingsartefacten, gezien als strepen in doorsnede. (E) objecten verstoren van het gezichtsveld, zoals de staart niet trok uit de buurt van de tibia (F) interfereert met x-ray demping van het onderbeen en kan resulteren in gewijzigde BMD en TMD metingen, hoewel niet visueel duidelijk. De linker onderhoek in deelvenster F toont een deel van de staart in het gezichtsveld, die bemoeid met de x-ray-balk die vervolgens door middel van het scheenbeen doorgegeven. De doorsnede gepresenteerd op de juiste panelen worden aangegeven door rode stippellijn in de linker panelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1. Isofluraan verdoving apparaat Isofluraan verdoving eenheid opgezet om 3-4% Isofluraan ontbonden in O2 op een continu debiet van 1-2 L/min voor de inductie van de narcose. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.

Aanvullende figuur 2. Zorgen voor de diepte van de verdoving. Pedaal reflexen van de maatregel door te knijpen de tenen van de rat ontvangen voortdurende inademing verdoving via een gezichtsmasker of een neus kegel. De reactie van de pijn is duidelijker wanneer het been wordt iets uitgebreid. Zeer sterke snuifjes of het gebruik van pincet of klemmen kan weefselschade veroorzaken en moet daarom niet worden gebruikt. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.

Aanvullende figuur 3. Scherm vastleggen van de live-feed fysiologische monitoring cameraweergave. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.

Aanvullende figuur 4. Rat tot in de liggende positie op het bed van de scanner koolstofvezel. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.

Aanvullende figuur 5. Rechts van de voet van de rat op een kneedbaar schuim buis gefixeerd. Rechtervoet van de rat is gefixeerd in een buis kneedbaar schuim met de tenen uitbreiding uit de buis (hier niet afgebeeld). De buis met schuim op een plastic houder is gefixeerd (Zie Tabel voor specifieke materialen/apparatuur voor meer informatie). Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.

Aanvullende figuur 6. Rat beveiligd in positie met het rechterbeen uitgebreid rechtdoor. De staart en linker voet is geplakt uit de buurt van het rechterbeen (naar de romp), de heupen zijn beveiligd en de rat romp is verpakt in dierenartsomslag (blauw) te beperken van warmteverlies. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol voorziet kijkers met de eerste gedetailleerde richtsnoer goede verdoving, plaatsing en terughoudendheid van de rat tijdens in vivo µCT scannen van de hind-limb. Deze richtsnoeren kunnen gebruikers van in vivo µCT scannen systemen te verkrijgen van hoge resolutie en hoge kwaliteitsbeelden van het scheenbeen dat kan worden verwerkt voor de kwantificering van 3-dimensionale bot-microarchitectuur. Kritische stappen in het protocol nodig om ervoor te zorgen dat juiste positionering en terughoudendheid betrekken de goede verdoving van de rat, alsmede de uitbreiding van de hind-limb uit de buurt van alle andere kritische structuren totdat het strak, maar niet in een onnatuurlijke positie. Om optimale resultaten van beeldvorming is het noodzakelijk dat de rat tot een niveau van volledige ontspanning worden verdoofd, en dat de ooglidreflex en pedaal reflexen zijn verloren. Bovendien, het scannen been moet worden uitgebreid en de gehele voet en enkel moeten worden gefixeerd in schuim. De methoden die hierboven beschreven te bereiken optimale positionering van het scannen been zal ervoor zorgen dat: 1) hind ledematen van ratten binnen een studie zijn consequent georiënteerd in dezelfde richting, dus mooi de x-ray-balk te passeren van het zelfde gebied van elk been gedraaid rond het monster; 2) zowel vrijwillige en onvrijwillige beweging van de hind-limb zal niet optreden, dus het minimaliseren van het potentieel voor bewegingsartefacten te bemoeien met de kwaliteit van de beelden van het verworven; 3) obstakels van objecten (dat wil zeggen, de staart) worden voorkomen, dus het minimaliseren van de kans op gedeeltelijke volume effecten tot onnauwkeurige BMD en TMD metingen. Deze richtlijnen kunnen worden gewijzigd voor elke individuele rat, zoals de snelheid van Isofluraan metabolisme en positionering afhankelijk van de stam en lichaam grootte 22 variëren kan. De meest voorkomende in vivo scannen machines zijn ontworpen voor kleine dierlijke modellen (dat wil zeggen, muizen, ratten, konijnen, cavia's) en verwisselbare dierlijke stadia toe te staan het scannen van verschillende dierlijke grootte zal hebben. Daarom zijn ze geschikt voor een breed scala van lichaam gewichten.

Hoewel in vivo µCT scannen vergunningen voor de rat te worden verplaatst als de beelden verkregen van de eerste scan zijn van slechte kwaliteit, gescand herhaald scannen zal blootstellen de rat aan extra doses van straling en Isofluraan anesthesie voor een langere periode van tijd. Maandelijkse herhaalde straling blootstelling van 600 mGy gericht op het scheenbeen rat meer dan vier maanden veroorzaakt geen schadelijke effecten op micro-architectuur in vergelijking met de contralaterale hind-limb 1bot, maar dit is niet de veiligheid van twee scans herhaald gaan onmiddellijke opvolging. Verdere beperkingen van de techniek beschreven omvatten de noodzaak uit te breiden de hind-limb strak met toegepast om het te houden toch krachten die op enkele wijzigingen in de botstructuur beroepen zich. Terwijl de ernst van de terughoudendheid van de hind-limb tijdens het scannen af van elke doelstelling met onderzoek hangt, resulteerde vorige onderzoek uit ons lab waarbij maandelijks herhaalde in vivo µCT beeldvorming van een hind-limb in een verschil in de corticale Micro-architectonisch parameter excentriciteit, in vergelijking met de contralaterale hind-limb die niet ondergaan herhaalde uitbreiding, stabilisatie en scannen van 1. Excentriciteit is een maatregel van de elliptische vorm van de corticaal bot en veranderingen in reactie op de dragende gewijzigd. Daarom, wanneer using zulks werkwijze voor positionering en beteugeling van de hind-limb voor herhaald in vivo µCT imaging, rekening moet worden gemaakt wanneer beoordeling en interpretatie van in lastdragend micro-architecturale parameters wijzigingen.

Terwijl de bovenstaande richtlijnen voor de beeldvorming en de analyse van botweefsel voorzien, moet lichte het protocol worden aangepast wanneer imaging weke delen van de hind-limb. In het bijzonder moet de wijze waarop de hind-limb is verlengd ten opzichte van de romp en ingetogen rekening worden gehouden, zoals de huidige procedure misshapes de oriëntatie van de weke delen (spieren, vetweefsel) in abnormale positionering voor de duur van de scan. Heeft derhalve bij het extrapoleren van dit model voor het gebruik in de beeldvorming van de weke delen van de hind-limb, enkele aanpassingen moeten worden aan de techniek van de terughoudendheid te verminderen of te elimineren van de veranderingen in de positionering van de weefsels ten opzichte van elkaar.

Bovendien, de richtsnoeren zijn opgesteld specifiek gebaseerd op de ervaringen van onze onderzoeksgroep, echter zij kunnen worden gewijzigd voor andere verkrijgbare in vivo µCT scanners. Andere voorgestelde methoden om te positioneren en beperken de hind-limb mogelijk door de fabrikant van de in vivo µCT systeem scannen. Meest commercieel beschikbaar in vivo µCT eenheden lijst polypropyleen, uitgebreide polystyreen en plastic buizen met tandheelkundige wax te houden een uitstekende voet als aanvaardbaar materialen en methoden voor de beteugeling van het scannen been. Echter de methode in dit protocol gepresenteerd bieden meer gecontroleerde en consistent positioneren en terughoudendheid van de gescande poot en consequent produceert afbeeldingen van hoge kwaliteit. De richtsnoeren gepresenteerd in de huidige methode vereist gespecialiseerde apparatuur die nodig is voor de anesthesie voor de rat, zoals een vaporizer, buizen, maskers, inductie kamers en zuurstof. Hoewel de apparatuur geassocieerd met een iets hogere kosten ten opzichte van injecteerbare anesthetica wordt, hierdoor onderzoekers de mogelijkheid om snel en nauwkeurig induceren anesthesie bij specifieke diepten van bewustzijn, die een voordeel boven alternatief biedt methoden.

Met behulp van de richtsnoeren in de huidige methode video, onderzoekers met behulp van hoge resolutie in vivo µCT technologieën te onderzoeken hun interventie zal van belang zitten kundig voor goed en consequent oriënteren en beperken van een rat hind-limb voor hoge kwaliteit X-ray imaging. Dit zal bieden een continuüm op het gebied van in vivo µCT Beeldacquisitie en dienen als een stap op weg naar het optimaliseren van de consistentie en nauwkeurigheid in studies en inschakelen van vergelijkingen over studies in de literatuur. Ook kunnen deze protocollen en methoden worden uitgebreid voor gebruik in andere knaagdiersoort, waaronder muizen, hoewel sommige wijzigingen vereist 2,10 zullen. De terughoudendheid van de voet in de buis schuim kunt bijvoorbeeld het enkel om te minimaliseren de mogelijkheid van been beweging tijdens de scan. Bovendien, past de volledige voet in de houder van het schuim. Zo verlengt de tenen niet uit het einde van de houder zoals ze doen wanneer de beveiliging van de voet van een rat. Het lichaam van de muis hoeft bovendien niet de dezelfde terughoudendheid met tape als de rat. Een kleinere neus kan worden gebruikt voor het behoud van verdoving in muizen tijdens de scan. Als een kleinere neus niet beschikbaar is, kan men veilig een nitril handschoen over de beschikbare neus kegel en maak een kleine incisie in de handschoen te voorzien een ruimte die bij de neus van de muis passen kan om anesthesie met behoud van een afdichting rond de neus.

Terwijl de proximale tibia de hoofdsite van onderzoek van wijzigingen is tot bone micro-structuur in de rat, moeten richtsnoeren voor de goede en consistente plaatsing van andere skelet sites zoals het bovenbeen en de lendenwervels worden onderzocht en vastgesteld voor consistentie in de literatuur. Echter, bij de uitvoering van toekomstige onderzoek waarbij de beeldvorming van de lendenwervels, overwegingen moeten worden gemaakt als beeldvorming van de wervelkolom straling blootstelling aan de omliggende organen en weefsels biedt.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen onderzoek financiering uit een NSERC ontdekking Grant (#05573) en de Stichting van Canada voor innovatie (#222084) voor de financiering van de in vivo micro-CT. W.E. Ward is een Canada Research Chair in bot- en spierontwikkeling.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IsofluraneFresenius Kabi Animal Health108737
VerdamperDispomed990-1091-3SINEWA
Afvangst/KolenfiltersDispomed985-1005-000
Micro-CT ScannerBruker microCTSkyScan 1176
TandartswasKerr Dental Laboratory623
Schuim (Backer Rod)RonaCF120861”x10’
KunststofbuisBruker microCTSP-3010
KoolstofvezelbedBruker microCTSP-3002
Vet Wrap/BandageDura-Tech17473
Oftalmisch GelOptixCare006CLC-4256Antibioticumvrij
VerwarmingskussenSunbeam000731-500-000

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats. Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).
  2. Sacco, S. M., et al. Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice. Bonekey Rep. 6, 855(2017).
  3. Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats. J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).
  4. Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning. Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).
  5. Laperre, K., et al. Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects. Bone. 49 (4), 613-622 (2011).
  6. Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans. J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).
  7. Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats. J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).
  8. Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
  9. Longo, A. B., et al. Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats. Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).
  10. Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring. Nutrients. 9 (3), 250(2017).
  11. Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT. Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).
  12. De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring. Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).
  13. Perilli, E., et al. Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats. Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).
  14. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  15. Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details. Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).
  16. Campbell, G. M., Sophocleous, A. Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies. Bonekey Rep. 3, 564(2014).
  17. Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD. Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).
  18. Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection. Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).
  19. Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats. BMC Vet Res. 10, 198(2014).
  20. Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs. PLoS One. 11 (9), e0161258(2016).
  21. Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental animals. , Available from: http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Experimental_Animals_Vol1.pdf (1993).
  22. Stevens, W. C., et al. Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals. Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vivo micro CTpositionering van de achterpoot van rattenbeeldvorming van de proximale tibiaanesthesie en sedatieprotocolfixatie met schuimrubberen buisapplicatie van tandwaxvastzetten met maskeringstapelongitudinale beeldvormingsstudiesmonitoring van stralingsblootstelling

Gerelateerde artikelen