Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis

Summary

We presenteren een protocol om te ontleden slijmachtige klieren en bereiden van hypofyse coronale secties van het ontwikkelen van muizen.

Abstract

De hypofyse of hypophysis is een belangrijk endocriene orgaan afscheidende hormonen essentieel voor homeostase. Het bestaat uit twee klieren met aparte embryonale oorsprong en functies — de neurohypophysis en de adenohypophysis. De ontwikkelende muis hypofyse is klein en delicaat met een langgerekte ovale vorm. Bij voorkeur wordt een coronale sectie weer te geven van zowel de adenohypophysis als de neurohypophysis in een enkel sneetje van de hypofyse muis.

Het doel van dit protocol is te bereiken van de juiste hypofyse coronale secties met goed bewaarde weefsel architecturen van het ontwikkelen van muizen. In dit protocol beschrijven we in detail hoe te ontleden en te verwerken van de slijmachtige klieren goed van de ontwikkeling van muizen. Eerst, muizen door transcardial perfusie van formaldehyde vóór dissectie worden opgelost. Vervolgens worden drie verschillende ontleden technieken toegepast om het verkrijgen intact slijmachtige klieren afhankelijk van de leeftijd van muizen. Voor foetale muizen van embryonale dagen (E) 17,5-18,5 en pasgeborenen jaar omhoog tot 4 dagen, worden de regio van de gehele sella's waaronder het wiggenbeen, klier en trigeminus zenuwen ontleed. Voor pups worden leeftijd postnatale dagen (P) 5-14, de slijmachtige klieren verbonden met trigeminal zenuwen ontleed als een geheel. Voor muizen meer dan 3 weken oud, worden de slijmachtige klieren zorgvuldig ontleed gratis uit de omliggende weefsels. We tonen ook hoe de slijmachtige klieren insluiten in een goede richting met behulp van de omliggende weefsels als monumenten te verkrijgen die voldoen aan de coronale secties. Deze methoden zijn handig bij het analyseren van de histologische en ontwikkelingsproblemen functies van slijmachtige klieren bij de ontwikkeling van muizen.

Introduction

De hypofyse of hypophysis is een belangrijk endocriene orgaan afscheidende hormonen essentieel voor homeostase^1,2. De hypofyse is anatomisch, een '' two-in-one'' structuur bestaande uit de neurohypophysis en de adenohypophysis. Die onderdelen moeten verschillende embryonale oorsprong en functie zeer verschillend. De neurohypophysis is afgeleid van de neurale ectoderm en scheidt van oxytocine en veel hormoon. De adenohypophysis is afkomstig uit de zak van Rathke en is verantwoordelijk voor het vrijkomen van hormonen waaronder groei-hormoon prolactine, schildklier - stimulerend hormoon, follikelstimulerend hormoon, luteïniserend hormoon, adrenocorticotropic hormoon, en Melanocyt - stimulerend hormoon^3,4,5.

De hypofyse berust op het dorsale oppervlak van het wiggenbeen (sella turcica) van de schedel van de muis en aan de verdieping van de hersenen is gekoppeld door een fragiele stengel. Lateraal is omgeven door trigeminal zenuwen en anteriorly de optic opticum^6,7. De klier heeft een langwerpige ovale vorm met haar lange as loodrecht staat op die van het hoofd. Op het dorsale oppervlak, kunnen de neurohypophysis en de adenohypophysis gemakkelijk worden afgebakend, met de voormalige bezetten de dorsale mediale regio en de laatste uitbreiding lateraal en ventrally. Tijdens de postnatale ontwikkeling, neemt de grootte van hypofyse toe snel in de eerste maand na de geboorte^8,9. De hypofyse muis is echter nog steeds zeer klein in grootte met een gemiddeld gewicht van 1.9 mg en een lange-as diameter van ~ 3 mm in volwassen¹⁰, een lange-as diameter van 2-2,5 mm op postnatale dag 21 (P21), en slechts 1-1,5 mm bij P0.

Een coronale sectie heeft de voorkeur om zowel adenohypophysis als neurohypophysis in een enkel sneetje van de hypofyse muis weer te geven. Echter, sommige technische vaardigheden worden vereist om te verkrijgen die voldoen aan de coronale secties van de slijmachtige klieren van het ontwikkelen van muizen vanwege zijn uitzonderlijk kleine formaat en verschillende anatomie. In dit artikel video laten we zien hoe ontleden muis slijmachtige klieren en hypofyse coronale secties voor te bereiden op de verschillende ontwikkelingsstadia.

Protocol

C57BL/6 muizen worden gefokt in omstandigheden van specifieke pathogenen vrije. Alle dierlijke experimentele methoden zijn in overeenstemming met de richtsnoeren die zijn goedgekeurd door de Animal Care en de ethische Commissie op tweede militaire Medizinische Universität.

1. dissectie van postnatale ontwikkeling hypofyse

1. uitvoeren anesthesie: neonatale muizen (P0 - P5) plaats op crushed ijs voor het opwekken van hypothermie. Voor muizen die ouder zijn dan 5 dagen oud, injecteren 5% urethaan (30 µL/g lichaamsgewicht) intraperitoneally om te induceren van anesthesie. Reacties op staart/teen snuifjes beoordelen. Gaan pas na de muis niet reageert op de schadelijke stimuli.
2. Beveiligen van de muis in de liggende positie (liggend op de rug met het gezicht naar boven) door het voorzichtig taping van de forepaws en hindpaws aan de werkoppervlakte van een dat kan worden gespeld (d.w.z., piepschuim) binnen een chemische zuurkast.
3. Uitvoeren transcardial perfusie.
   1. De muis ribbenkast snijd met een chirurgische schaar bloot het hart (en andere thoracale organen).
   2. Beveiligen het kloppend hart met een botte Tang en invoegen van een naald 26G (0,45 mm) in het linkerventrikel. De naald is verbonden met een 10 mL spuit gevuld met EDTA fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; aangevuld met 5 mg/mL natriumnitriet en 10 U/mL heparine, pH 7.4, warm tot 37 ° C vóór gebruik). Onmiddellijk de juiste atrium snijd met een fijn schaar en beginnen te perfuse van het lichaam met de warme PBS, totdat de vloeistof de juiste atrium verlaten duidelijk.
      Opmerking: Bij benadering 5-10 mL PBS is nodig voor de neonatale muizen en 10-20 mL PBS voor volwassen muizen.
   3. De naald op zijn plaats houden en omzetten in een ander spuit gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7.4). Perfuse 10 mL en 20 mL fixeer voor Neonatale en P21 muis, respectievelijk.
      Let op: PFA is giftig. Huid en respiratoire irritaties en oog schade kan veroorzaken. Draag handschoenen en werken onder een chemische motorkap.
4. De PFA-vaste muis decapitate en opengesneden met een schaar van het bot van de schedel.
   1. Til voorzichtig het hindbrain van de basis van de schedel met een kleine Tang. Bij het eerste teken van de sella turcica cut stop tillen maar houd de hindbrain, de hypofyse stengel en zenuwvezels die aansluiten op de basis van de hersenen met een fijne schaar. Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de hypofyse is niet weg met de hersenen opgeheven.
   2. Dan de hersenen houden opheffen en verwijderen van de hele hersenen om de hypofyse volledig bloot te stellen. Snijd de hele sella regio met inbegrip van de hypofyse, laterale trigeminal zenuwen, en de onder wiggenbeen met een schaar (ongeveer 3 x 5 mm ²).
5. De ontleed weefsel gestoken met een 35 mm-schotel of een putje van een 6-well plaat met 2 mL koude 4% PFA (pH 7.4). Fix het weefsel bij 4 ° C voor 40 min voor P0 - P7 pituitaries, 1 h voor P14 pituitaries, 1,5 h voor P21 - P28 pituitaries en 3 h voor volwassen pituitaries.
6. Verdere dissociatie van hypofyse
   1. wassen het vaste weefsel met 10 mL PBS, 5 wijzigingen, elke 15 min. De neonatale hypofyse samen met zijn omliggende weefsels en onder wiggenbeen rechtstreeks aan uitdroging kan worden verwerkt. Echter de slijmachtige klieren van muizen die ouder zijn dan 5 dagen moet worden losgekoppeld verder onder een stereomicroscoop.
   2. Zet het vaste weefsel in een 35 mm-schotel met 1 mL PBS. Voor P5 - P14 pituitaries, verwijdert u de bindweefsel membranen tussen de zenuwen en het bot met fijne Tang en schaar en zorgvuldig het isoleren van de hypofyse samen met laterale trigeminal zenuwen als geheel maar verlaten de sella turcica. De geïsoleerde klier en de zenuwen zijn verbonden door bindweefsel membranen met een " H "-graag uiterlijk ( figuur 1B).
   3. Voor P21 en volwassen pituitaries, verwijderen van de zenuwen en het bindweefsel van de vliezen rond de hypofyse en gratis de klier uit de omliggende weefsels. Wikkel de hypofyse weefsel met lens reiniging papieren zakdoekje en zet het in een insluiten cassette.
      Opmerking: De kleine hypofyse inwikkeling met lens reiniging papieren zakdoekje helpt ter voorkoming van potentiële schade van specimens en behoud van weefsel integriteit in de volgende procedure voor het insluiten van paraffine. Het kan niet nodig te laten teruglopen van de hypofyse als het is verwerkt in een klein flesje in de procedure cryo-insluiting.

2. Paraffine insluiten en Sectioning

1. de specimens in cassettes met 50%, 65%, 75% en 95% ethanol oplossingen voor elke 15 min te embedding uitdrogen. Vervolgens uitdrogen met 3 wijzigingen van zuiver ethanol, 3 min voor P0 - P4 klieren, elke 4 min voor P5 - P14 klieren, en elke 5 min voor P21 en oudere klieren. Duidelijk met xyleen, 3 verandert, 3 min voor P0 - P4 klieren, elke 4 min voor P5 - P14 klieren, en elke 5 min voor P21 en oudere klieren. Infiltreren met gesmolten paraffine, 3 veranderingen, elke 7 min voor P0 - P4 klieren, en 8 min tweemaal gevolgd door 6 min eenmaal voor P5 en oudere klieren.
   Opmerking: De optimale parameters voor verwerking van het weefsel kunnen worden empirisch aangepast. Voor het verkrijgen van hoge kwaliteit secties, moet onvoldoende of over uitdroging worden vermeden. Hetzelfde geldt voor het ontruimen van het weefsel met behulp van xyleen.
2. Oriëntatie bij het insluiten van
   1. op een weefsel insluiten console systeem, verwijderen van het model van de cassette en plaats deze in een basis mal half gevuld met gesmolten paraffine. Juiste stand van de insluiten hypofyse is essentieel voor het voldoen aan van coronale secties.
   2. Voor P21 en volwassene slijmachtige klieren, plaatst u de hypofyse met de korte as loodrecht op het oppervlak van de bodem van een base mal (het sectievlak). Gebruik wiggenbeen beenderen en trigeminus zenuwen als anatomische bezienswaardigheden voor P0 - P4 en P5 - P14 pituitaries, respectievelijk. Exemplaren met hun trigeminal zenuwen of transversale lamina van wiggenbeen botten loodrecht op het oppervlak van de bodem van een base mal oriënteren.
   3. Houd zachtjes het weefsel in de gewenste positie met verwarmde fijne pincet totdat de wax semi-solide op de plaat in een koeling wordt. De matrijs met gesmolten paraffine herladen. Toestaan van het blok van de paraffine afkoelen totdat de wax is volledig verhard.
      Opmerking: De hypofyse ten embryonale dage 18,5 (E18.5) kan worden behandeld op dezelfde wijze als de neonatale hypofyse. Maar de pituitaries (Rathke ' s zakjes) jonger dan E16.5 moet worden ingesloten met de gehele kop en met de Sagittaal as (van mond naar achterhoofd) loodrecht op de onderkant van een base mal gericht.
3. Chill de paraffine blok bij-20 ° C gedurende 10-20 minuten en dan snijd het in dunne plakjes (4 µm dikte heeft de voorkeur) met een microtoom. Als u op bevredigende coronale secties, fine-tunen van de positie van de paraffineblokken tijdens segmenteren. Mount de plakjes weefsel in polylysine-gecoat glas dia's om te voorkomen dat detachement van segmenten in de volgende procedures.
   Opmerking: Als alternatief, exemplaren kunnen worden gedehydrateerde in 15%, 30% (G/V) oplossingen van de sucrose (in PBS) bij 4 ° C totdat ze naar de bodem zinken, ingesloten in cryo-insluiting samengestelde gebruikend de zelfde methode van oriëntatie en snel bevroren op droog ijs. Vervolgens snijd het bevroren weefsel blokken in reepjes van 8-10 µm met behulp van een cryostaat. De morfologie van cryo-secties, is echter vaak inferieur aan secties paraffine.

3. H & E kleuring en labelen van immunofluorescentie

1. Warm de dia's op een hitte blokkeren bij 55 ° C en dewax met xyleen, 2 wijzigingen, 4 min elke. Uitdrogen van de monsters met tweemaal de ethanol van 95% en 75% ethanol tweemaal, 3 minuten elk. Wassen van de dia's met gedestilleerd water gedurende 5 minuten in een roteerapparaat.
2. Voor H & E vlekken, vlek de secties in aluin Haematoxyline oplossing voor 6 min, spoel in runnhet water van de kraan van de ING gedurende 2 minuten, onderscheiden met 0,2% ammoniak water voor 45 s, en het opnieuw spoelen in stromend water gedurende 2 minuten. Vervolgens het uitdrogen van de secties met 95% ethanol voor 1 min en vlek met eosine 2 min. sequentieel uitdrogen, duidelijk, en mount.
De secties behandelen
3. immunofluorescentie labeling
   1. met methanol met 3% H ₂ O ₂ en 0,01% NaN ₃ gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te inactivering van endogene Peroxidasen. Ophalen van antigenen door koken secties in de ophalen buffer (1 mM EDTA en 1 mM Tris-HCl, pH 7.4) in een snelkookpan voor 2 min. Incubate de secties met een blokkeerbuffer (5% geit serum in PBS) gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
   2. Broeden secties met konijn anti-groeihormoon (GH) antilichaam (1:2, 000) of konijn anti-gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) antilichaam (1:2, 000) verdund in blokkeerbuffer 's nachts bij 4 ° C.
   3. Secties met secundair antilichaam (geit anti-konijn IgG-HRP, 1:300 in de blokkeerbuffer) Incubeer gedurende 35 minuten bij 37 ° C.
   4. Versterken de signalen met behulp van Biotinyl Tyramide (1:50 in Tris gebufferde zoutoplossing met 0,3% H ₂ O ₂) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en visualiseren met streptavidine-Alexa594 of 488 (1:300 in het blokkeren van de buffer, 30 min, 37 ° C).
   5. Counterstain de kernen met de DAPI (50 mg/L in PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Het kan niet noodzakelijk zijn om het signaal dat met behulp van Tyramide signaal versterking (TSA) systeem versterken. Als alternatief, een fluorescentie-geconjugeerde secundair antilichaam kan worden gebruikt voor het visualiseren van het signaal.
4. Ophaal beelden met behulp van een fluorescentie Microscoop uitgerust met DAPI, Texas Red en FITC filter sets, × 4/0.13 te × 40/0,75 doelstellingen en een 5.0 megapixelcamera. Gebruik de 360, 488 594 nm laser golflengten voor imaging DAPI Alexa 488- en Alexa 594 gebeitste secties, respectievelijk en. Optimaliseren van de kracht van de laser (0.8 werd gebruikt in het algemeen) en belichtingstijd op de gewenste niveaus voor elk kanaal. De opname onder de controle van afbeelding acquisitie software en overlay van de afbeeldingen van de fluorescentie vervolgens met behulp van beeld processing software.

Results

Dit protocol biedt een methode om te ontleden slijmachtige klieren van het ontwikkelen van muizen. Voor de neonatale muis, de hele sella regio's met de hypofyse, de trigeminus zenuwen en de onderzijde wiggenbeen werden ontleed uit vanaf de basis van de schedel. De kleine en delicate hypofyse tijdens het proces (figuur 1A) intact gebleven. Voor muizen die ouder zijn dan 5 dagen, toen de slijmachtige klieren gekoppeld aan de laterale trigeminal zenuwen waren ge...

Discussion

Voor het ontwikkelen van lymfkliertest pituitaries, is het technisch moeilijk te verkrijgen van de juiste coronale secties als gevolg van hun klein en kwetsbaar functies en unieke anatomische kenmerken^6,8. Sommige onderzoeksgroepen koos dus mid-Sagittaal secties voor het analyseren van de morfologie van embryonale en neonatale hypofyse^11,12. Hoewel de mid-Sagittaal sectie van hypofyse is ook geschikt voor...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gereedschap/Uitrusting
Chirurgische schaar-recht	JinZhong	J21010	kan worden gekocht bij andere verkopers
Fijne schaar-recht	JinZhong	WA1010	kan worden gekocht bij andere verkopers
Blunt pincet	JinZhong	JD1020	kan worden gekocht bij andere verkopers
Fijne pincet	Dumont	RS-5015	voor isolatie van de hypofyse
26G (0.45mm) naald	HongDa		voor transcardiale perfusie
Spuit (1 mL)	BD	300841	kan worden gekocht bij andere verkopers
Spuit (10 mL)	BD		kan worden gekocht bij andere verkopers
35mm schaal	Corning	430165	kan worden gekocht bij andere verkopers
Lensreinigingspapier	ShuangQuan		kan worden gekocht bij andere verkopers
Anatomisch microscoop	OLYMPUS	SZX-ILLB2-200	kan worden gekocht bij andere verkopers
Inbeddingscassette	Thermo Fisher	22-272423	kan worden gekocht bij andere verkopers
Weefselinbeddingsconsolesysteem	KEDEE	KD-BM11	kan worden gekocht bij andere verkopers
Microtoom	Thermo Fisher	HM315R	kan worden gekocht bij andere verkopers
Superfrost-Plus dia's	Thermo Fisher	22-037-246	kan worden gekocht bij andere verkopers
Dekglas	Thermo Fisher	12-543	kan worden gekocht bij andere verkopers
Fluorescentiemicroscoop	OLYMPUS	BH2-RFCA	kan worden gekocht bij andere verkopers
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia
Urethane	BBI	EB0448
NaCl	Sigma	S9625	voor PBS
KCl	Sigma	P9541	voor PBS
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	voor PBS
K2HPO4	Sigma	P2222	voor PBS
NaNO2	Sigma	237213
Heparine-natriuminjectie	SPH	H31022051	voor perfusie-zoutoplossing
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Ethanol	SCR	10009218
Xyleen	SCR	10023418
Paraffine	Thermo Fisher	8330
Hematoxyline	Sigma	H9627	voor H&E kleuring
Eosine Y	Sigma	E4009	voor H&E kleuring
konijnen anti groeihormoon (GH)	National Hormone		voor immunokleuring
antilichaam	Hypofyseprogramma
Konijn anti-muis GFAP antilichaam	Sigma	G9269	voor immunokleuring
Geiten anti-konijn IgG, HRP	Jackson	111-035-003	voor immunokleuring
TSA-systeem	NEN Life Science Products	NEL700	voor immunokleuring
Streptavidine, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	S32356	voor immunokleuring
Anti-FITC Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11090	voor immunokleuring