Methodenartikel

Tweede harmonische generatie signalen in konijn Sclera als een instrument voor de beoordeling van de therapeutische weefsel dwarsbinding (TXL) voor bijziendheid

DOI:

10.3791/56385

⸱

6 januari 2018

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft technieken voor de beoordeling van de chemische cross-linking van het konijn sclera met behulp van tweede-harmonische generatie beeldvorming en differentiële scanning calorimetrie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Methoden ter versterking van weefsel door de invoering van chemische bindingen (niet-enzymatische dwarsbinding) tot structurele proteïnen (fibrillar collagens) voor therapie omvatten fotochemische dwarsbinding en weefsel (TXL) methoden dwarsbinding. Dergelijke methoden voor mechanische weefsel eigenschapswijzigingen inducerende gebruikt om het hoornvlies in hoornvlies dunner (mechanisch verzwakt) aandoeningen zoals keratoconus evenals de sclera in progressieve myopie, waar vermagering en verzwakking van de posterior Sclera optreedt en waarschijnlijk draagt bij aan de axiale rek. De eiwitten van de primaire doelgroep voor de versterking van dergelijke weefsel zijn fibrillar collagens, die de grote meerderheid van drooggewicht eiwitten in de cornea en sclera vormen. Toevalligerwijs, zijn fibrillar collagens de belangrijkste bron van tweede-harmonische generatie signalen in de extracellulaire ruimte van weefsel. Daarom, wijzigingen van de collageen-eiwitten, zoals degenen geïnduceerd door dwarsbinding therapieën, konden potentieel worden gedetecteerd en quantitated met behulp van tweede-harmonische generatie microscopie (SHGM). Bewaking SHGM signalen door het gebruik van een laser scanning microscopie systeem in combinatie met een infrarood excitatie licht bron is een spannende moderne beeldvorming methode dat is genieten van wijdverbreide gebruik in de Biomedische Wetenschappen. Dus de huidige studie werd uitgevoerd om te evalueren van het gebruik van SHGM microscopie als een middel voor het meten van geïnduceerde cross-linking effecten in ex vivo konijn sclera, na een injectie van een chemische stof dwarsbinding agent in de sub-Tenon ruimte (sT), een injectie aanpak dat is gebruikelijk voor het veroorzaken van oogbeschadigingen en/of verdoving tijdens oogheelkundig klinische procedures. De chemische stof dwarsbinding agent, is natrium hydroxymethylglycinate (SMG), van een klasse van cosmetische conserveermiddelen formaldehyde vrijgeven van agenten (FARs) genoemd. Scleral wijzigingen na reactie met SMG resulteerde in stijgingen van de SHG signalen en gecorreleerd met verschuivingen in thermische denaturatie temperatuur, een standaardmethode voor het evalueren van geïnduceerde weefsel dwarsbinding effecten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Progressieve myopie is gepostuleerd aan behandelbare door niet-enzymatische scleral dwarsbinding (fotochemische en/of chemische), wat logisch is gezien het feit dat het blokkeren van enzymatische cross-linking van collageen experimentele vorm ontbering (FD verhogen kan)-geïnduceerde bijziendheid1. Sheikh en Phillips2 onlangs gesproken over de haalbaarheid en de mogelijkheden voor het gebruik van standaard UV-A straling (UVA)-riboflavine gemedieerde fotochemische dwarsbinding (ook bekend als de Dresden-protocol), afgekort hier als (riboflavine CXL) voor achterste scleral stabilisatie axiale rek in bijziendheid halt toe te roepen. Deze fotochemische methode is met succes gebruikt voor de behandeling van destabilisatie van het anterieure globe-oppervlak gezien in keratoconus en post-LASIK keratectasia (d.w.z., het uitpuilende hoornvlies). Toepassing van dit protocol CXL voor de sclera wordt echter belemmerd door kwesties met betrekking tot moeilijkheden bij de toegang tot de achterste sclera met een ultraviolette lichtbron (UV), evenals de noodzaak om te wijzigen van een veel grotere weefsel oppervlakte. Dat gezegd zijnde, de CXL-aanpak is gebruikt om te stoppen axiale rek in visueel vorm beroofd konijnen (door tarsorrhaphy), hoewel meerdere regio's van posterieure sclera meerdere afzonderlijke bestraling zones in die studie3 vereist. Daarentegen kan de injectie van een chemische stabilisator en (dat wil zeggen, cross-linking agent) via de sT-ruimte een eenvoudiger manier om te wijzigen de posterieure sclera, het vermijden van de noodzaak voor de invoering van een UV-lichtbron vertegenwoordigen. Deze injectietechniek is bekend als een nuttige manier inducerende oogbeschadigingen en/of verdoving tijdens oogheelkundig procedures zoals cataract chirurgie4,5,6. Wollensak7 eerder heeft beschreven van het gebruik van een injectie van de sT met behulp van glyceraldehyde (een chemische cross-linking agent gelijkaardig in concept aan de formaldehyde die het vrijgeven van agenten (FARs) beschreven in deze studie) aan het verharden van de sclera konijn en de genipin heeft is aangetoond dat het beperken van axiale lengte in FD cavia's8,9. Deze onderzoekers hebben aangetoond dat een duidelijk voordeel van het gebruik van een chemisch agens die oplosbaar over de fotochemische CXL-techniek. Dus scleral dwarsbinding met behulp van een injecteerbare chemisch agens van een soort, met inbegrip van de FARs (d.w.z., TXL)10, kon bieden een haalbaar behandelingsmethode de progressie van scleral rek gezien in bijziendheid halt toe te roepen.

In de protocollen die hier gepresenteerd, gebruiken we een chemische cross-linking oplossing van natrium hydroxymethylglycinate (SMG), geleverd via sT injectie aan de sclera van dode foetussen konijn ogen. Wij hebben uitgevoerd soortgelijke protocollen eerder voor actuele chemische dwarsbinding in het hoornvlies. Met name in die eerder gemeld studies, kan concentratie afhankelijke dwarsbinding effecten worden verkregen met behulp van SMG, met een effect bereik verspreid over ruim boven die haalbaar zijn met fotochemische CXL zoals bepaald door de thermische denaturatie analyse11 .

We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van de cross-linking effect van SMG geleverd via sT injecties aan scleral weefsel, thermische denaturatie met behulp van differentiële Scanning Calorimetrie (DSC) en tweede harmonische generatie microscopie (SHGM).

Met behulp van differentiële scanning calorimetrie (DSC), ook bekend als thermische analyse, wordt een thermische denaturatie overgang gemeten, die voor scleral weefsel wordt hoofdzakelijk laten leiden door de eigenschappen van de fibrillar collagens, want zij de meerderheid van de bulk vormen van eiwit. Deze methode evalueert de stabiliteit van collageen moleculaire structuur en de kruiselings gekoppelde obligaties die de collageen fibrillen, de belangrijkste tertiaire eiwitstructuur stabiliseren. Tijdens de verwarming in de DSC, wordt de temperatuur van een kritische overgang bereikt die tot denaturatie van het molecuul van collageen leidt, wat resulteert in het uncoiling van de triple helix, een proces dat vormt wat is algemeen bekend als gelatine. Deze thermische denaturatie verstoort waterstofbruggen langs de collageen-molecuul en aan hogere temperaturen door geïnduceerde cross-linking methoden12,13kan worden verschoven. Deze methode is gebruikt voor vele decennia, met name in de industrie biomaterialen en processen met leder te maken. Echter, deze methode vereist extractie van de sclera weefsel en dus kan alleen nuttig zijn als een ex vivo -techniek.

Tweede-harmonische generatie microscopie (SHGM) is gebaseerd op de niet-lineaire optische eigenschappen van bepaalde materialen, met niet-centrosymmetric moleculaire omgevingen. In dergelijke materialen, intens licht, bijvoorbeeld licht geproduceerd door lasers, genereert SHG signalen, waarin het invallende licht wordt verdubbeld in frequentie. Biologische stoffen waarvan bekend is dat het maken van de SHG signalen zijn collageen, microtubuli en spier myosin. Collageen enthousiast met een infrarood licht van 860 nm golflengte zal bijvoorbeeld een signaal van de SHG in het zichtbare bereik met 430 nm golflengte uitzenden. Tweede harmonische generatie (SHG) signaal imaging is een veelbelovende methode voor de beoordeling van de therapeutische collageen dwarsbinding. Het is gekend voor meer dan 30 jaar dat collageen fibrillen in weefsels SHG signalen14 uitstoten. Echter kon pas onlangs hoge resolutiebeelden worden verkregen15 in een verscheidenheid van weefsel, met inbegrip van de pees16, kraakbeen17, huid en bloedvaten18, en in collageen gels19.

Deze studie is gebaseerd op deze kennis, en evalueert de SHG signaal veranderingen in de sclera via SMG chemisch geïnduceerde cross-linking van collageen. De resultaten wijzen erop dat SMG wijziging van de sclera de signalen van de SHG geproduceerd uit weefsel collageen vezelbundels (de hogere orde quaternaire structuur bestaat uit collageen fibrillen verhoogt) en ook een structurele morfologische veranderingen in de collageen produceert glasvezelnetwerk, weerspiegeld in de vezel bundel "straighten."

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden uitgevoerd met behulp van dode foetussen konijn ogen binnen intact outbred konijn hoofden. Alle institutionele en nationale richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd.

1. bereiding van de oplossingen

  1. SMG voorbereiding TXL:
    1. Bereiden 1 mL 0,2 M concentratie van natriumbicarbonaat oplossing (NaHCO3) oplossing met behulp van 0.0165 g NaHCO3 poeder opgelost in 1 mL gedestilleerd water.
    2. Los 0.1016 mg poeder natrium hydroxymethylglycinate (SMG) in 1 mL gedestilleerd water om een eindconcentratie van 800 mM SMG. Aanpassen van natriumbicarbonaat oplossing voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 M NaHCO3 en 400 mM SMG. Concentraties van SMG afhankelijk van de cross-linking effect gewenst. In het protocol beschreven hier gebruikten we 40, 100 en 400 mM SMG.

2. subTenon de injectie voor TXL met behulp van SMG

  1. Vul twee 1 mL insuline spuiten (25G naalden) met 400 µL controle en SMG oplossing, respectievelijk.
  2. Plaats de rabbit's hoofd in een vlak profiel met behulp van een kussen. Piepschuim of een stapel papier kan worden gebruikt om op te lossen van het hoofd in een optimale positie.
  3. Intrekken van de oogleden met een speculum pediatrische oog.
  4. Meet de initiële intraoculaire druk (IOP) met behulp van een applanation tonometry apparaat.
  5. De site van beoogde injectie in het bovenste middelste gedeelte van de limbus markeren met een viltstift weefsel.
  6. Intrekken van het bindvlies rond de plaats van injectie met een conjunctivale pincet (of een pincet met getande ronde tip) en steek de naald door het bindvlies, invoeren van Tenon de capsule net iets buiten de gemarkeerde limbal site (dat wil zeggen, 2-3 mm van de limbus). Een kleine snede in het bindvlies kan ook worden gemaakt met een iris schaar ter vergemakkelijking van de passage van de naald door de Tenon capsule.
  7. Eenmaal binnen Tenon de capsule, ervoor te zorgen dat de naald vrij mobiel is door het bewegen van het links-naar-rechts. Gedurende deze tijd, moet de hele wereld niet verplaatsen. Dit bevestigt de juiste plaatsing van de naald boven de sclera in de sub-Tenon van (sT) ruimte.
  8. Injecteer de oplossing van de spuit en de naald te negeren. Direct na de injectie, zal de vloeistof zich ophopen in de ruimte van de sT maken een anterior Ardennen gezien door het bindvlies (dat wil zeggen, chemosis).
  9. Herhaal de meting IOP om te bevestigen dat het niet als gevolg van een onbedoelde perforatie van de hele wereld veranderen.
  10. Verwijder de deksel speculum en uitvoeren van digitale massage door middel van de gesloten oogleden voor ongeveer 2-3 min.
  11. Laat het hoofd voor een incubatietijd van 3,5 h (kamertemperatuur 18 ° C =), voorafgaand aan het verplaatsen naar de volgende stap.

3. de weefsels voorbereiding

  1. Intrekken van de oogleden met behulp van het ooglid speculum oog op het optimaliseren van de toegang tot de hele wereld. Selecteer de optimaal formaat speculum volgens de grootte van het oog.
  2. Het bindvlies rond de limbus te scheiden. Als het heeft al zijn ingesneden in de buurt van de plaats van injectie, omtrek vouwt de grenzen dus het een entmateriaal grootte van ongeveer 1 x 1 cm bevatten zou.
  3. Knip de extra oogbeschadigingen en/of spieren op hun sites van scleral inbrengen.
  4. Verhoog de oogbol met pincet, het duwen van de posterieure zijde. Dit biedt toegang tot de achterste bol en snijden van de oogzenuw met ophthalmic slagader en ader vlakbij de achterste stok van de wereld zal vergemakkelijken.
  5. Knip de corneoscleral complex, met de buitenrand, met inbegrip van de gemarkeerde injectieplaats. De vlek moet wel zichtbaar op het resterende deel van de sclera.
  6. Verwijder het corpus vitreus en alle lagen die zijn gekoppeld aan de binnenzijde van de sclera door tractie met weefsel pincet toe te passen.
    Opmerking: Verdere stappen afhankelijk zijn van de volgende procedures wordt uitgevoerd: 4. - DSC analyse, 5. - SHG microscopie.

4. voor regionale DSC analyse

  1. Voor het behandelde oog: knip vier scleral sectoren van de resterende scleral cup met de schaar zodat de plaats van de injectie is gevestigd in de bovenste sector en uitgelijnd centraal. Snijd de resterende 3 sectoren van zowel laterale zijden (d.w.z., nasale en temporele), en de onderkant.
    Opmerking: de nummering van de sectoren (1-4) die zijn verder onderverdeeld in vierkanten (1-16) wordt geïllustreerd in figuur 1A.
  2. Snijd de scleral sectoren (1-4) in kleinere vierkantjes (1-16) van ongeveer 4 x 4 mm elke. Sector 1 moet worden onderverdeeld in 9 vierkantjes (zorg de exacte plaats van de injectie een individuele vierkant [plein 2]). Verdeel sectoren 2 en 3 in 2 vierkanten (pleinen 10-11 en 12-13) en sector 4 in 3 vierkanten (pleinen 14-16).
  3. Een nummer toewijzen aan elk vierkant, zoals weergegeven in figuur 1A, om het lokaliseren van de afstand van de geanalyseerde weefsel van de locatie van het geïnjecteerde gebied.
  4. Voor het controle-oog: nadat het weefsel te verdelen in vier scleral sectoren (vergelijkbaar met het behandelde weefsel) knip vierkante stukjes weefsel van de volgende locaties: 3 vierkanten uit de top sector (sector 1), 1 van elke zijde (sectoren 2 en 3), en 1 van de onderkant sector (sector 4).
  5. Schraap de resterende netvlies en choroidal lagen en spoel tweemaal met verse PBS telkens verlaten de stukken ondergedompeld in de oplossing voor ongeveer 10 s tegelijk.

5. voor SHG Imaging

  1. Snij het bovenste gedeelte van de sclera met behulp van schaar een 1 x 1 cm om ruimte te creëren met de plaats van injectie uitgelijnd centraal.
  2. Schraap de resterende netvlies en choroideus lagen en spoel tweemaal met verse PBS telkens verlaten van de stukken in de oplossing voor ongeveer 10 s.
  3. Plaats het weefsel in 1 mL buizen gevuld met PBS oplossing voor vervoer naar de imaging faciliteit. Alle procedures, volgend op de incubatietijd en beginnen met de dissectie van de oogbol moeten worden uitgevoerd binnen een uur.

6. microscopie Protocol

Opmerking: Dit protocol voor imaging achterwaarts-verstrooid SHG signaal van collageen van sclera weefsel is op maat gemaakt voor de laser scanning microscoop.

  1. Microscopie instellen
    1. Als u wilt maximaliseren optimaliseren het signaal en de resolutie bij het uitvoeren van de SHG microscopie een objectief gebruiken voor het verzenden van infrarood licht en met een hoge numerieke diafragma (NB). Onze doelstelling is Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 water onderdompeling.
    2. Aanpassen van de kraag van de correctie van de lens aan de diepte van het monster, in dit geval dat is de dikte van het dekglaasje aan, 0,17 millimeter.
    3. Monteren van het objectief van 25 x en een royaal bedrag van smeerolie watergedragen gel ter dekking van de beeldvorming oppervlak voor montage van het monster toe te voegen. De gel op basis van water zal niet verdampen tijdens het experiment en vandaar beeldkwaliteit zal handhaven.
    4. Plaats het scleral weefsel uit een tube van 1 mL met PBS zonder drogen tussen twee 25-mm ronde coverslips (episcleral zijde naar beneden) bieden maximale contact tussen de episclera en het dekglaasje aan oppervlak.
      Opmerking: Het weefsel kan ook worden geplaatst vanuit een ongedekte positie op het dekglaasje aan. Een goede hoeveelheid PBS moet houden het weefsel gehydrateerd tijdens imaging. In dit geval het stuk weefsel en de PBS toevoegen na het monteren van de cellchamber.
    5. Monteren van de kamer van de cel door het plaatsen van een 25-mm ronde dekglaasje aan, enkel of in een sandwich techniek, op het onderste gedeelte van de kamer en schroef het bovenste deel naar beneden om te creëren een verzegelde ronde kamer. Niet schroef naar beneden strak wanneer een top dekglaasje aan wordt gebruikt, teneinde te vermijden kunstmatig afvlakken en schade aan het weefsel.
    6. Monteer de zaal van de cel met het monster weefsel in het werkgebied van de Microscoop.
    7. De Microscoop voor oog weergave met doorvallend licht aangezet.
    8. Het werkgebied plaatsen en aanpassen van de hoogte van de doelstelling, zodat het onderste oppervlak van het monster in beeld, is zoals bepaald door heldere veldkeuring via het oog stuk.
    9. Alle lichten met uitzondering van de monitor van de computer uit te schakelen en zo veel licht van de monitor mogelijk blokkeren met aluminiumfolie vellen gedrapeerd in het werkgebied van de Microscoop. Minimaliseren van alle strooilicht bereiken de detectoren zorgt geluidsarme verwerving, zoals de GaAsP NDD detectoren hoge gevoeligheid hebben.
    10. Controleer of de definitie van de lens juist is in het deelvenster Ti Pad van de software.
    11. In het deelvenster A1 Compact GUI kiezen de IR laser voor imaging de NDD detectoren en kies de DAPI-kanaal dat is uitgerust met een 400-450 nm bandfilter filter.
    12. Stel in het deelvenster A1 MP GUI de golflengte van de infrarood laser naar 860 nm en open de sluiter.
    13. Laser scannen voorwaarden in het deelvenster A1 Compact GUI als volgt instellen Selecteer: (a) Galvano scanner, (b) unidirectionele scannen, (c) Pixel Nadruktijd tijd 6.2 µs, (d) Frame grootte 1024 x 1024 pixels, (e) lijn gemiddeld 2 x
      Opmerking: De Galvano scanner en unidirectionele scannen zorgt voor nauwkeurige puntsgewijs uitlijning. Een formaat van 1024 x 1024 voor de volledige gezichtsveld vertaalt zich in een pixelgrootte van 0,5 μm /pixel. Lijn gemiddeld zal de shot ruis in de afbeelding.
    14. Set imaging voorwaarden in A1 Compact GUI deelvenster door laser macht en detector winst aan te passen. Open het deelvenster tabel kijken (LUTs) waarin een histogram van de intensiteitswaarden van de pixels in de huidige afbeelding. Levende imaging in "Zoeken"-modus inschakelen en de gedetecteerde bereik van pixelwaarden te maximaliseren door laser macht en detector winst aan te passen. Vermijd verzadiging. Gebruikelijke waarden zijn 2,5% laser macht, uit een totaal van 2,35 W op 860 nm, en 100 HV (detector winst).
    15. Opmerking: Voor deze opstelling is de kracht van de laser gemeten met een interne Energiemeter 5.2 mW. Elke keer dat een experiment wordt uitgevoerd, opnieuw het percentage van de laser aanpassen zodat de interne vermogensmeting constant op 5.2 is mW tussen imaging sessies. Zorg moet worden genomen bij de vaststelling van de macht van de laser. De kameleon II-laser is een 3 W laser bij 800 nm en een 10% of hogere macht kon potentieel weefselschade veroorzaken.
  2. Beeldacquisitie
    1. Scan het weefsel gebied met het gereedschap XYZ overzicht in de schermafdrukmodus.
    2. Stel de beeldvorming op lagere resolutie (256 x 256 pixels en geen regel gemiddeld) om de overname van afbeeldingen in deze modus te versnellen.
    3. Het vastleggen van 5 x 5, 3 x 3 of één gezichtsveld ter dekking van het gehele oppervlak van het weefsel. Op elke bedieningsplaats, vóór de verovering van het overzicht, de "Scan"-modus inschakelen en brengen het weefsel in beeld. Merk op dat de verschillende regio's van het weefsel lichtjes verschillende posities in de axiale richting zal hebben.
    4. Zoek een vlak stuk waar de collageenvezels worden gezien in het hele gezichtsveld en dubbelklikt u op die positie in het overzicht hulpprogramma om de etappe naar die specifieke locatie.
    5. Live "Scan"-modus inschakelen, aanpassen van positie op de Z van de doelstelling, zodat de onderkant vlak in focus is, en in de Ti-Pad, de Z-drive te gebruiken om te verplaatsen het optische vliegtuig 10-15 μm boven deze onderste laag.
    6. Verwerven van een afbeelding met hoge resolutie met 1024 x 1024 pixels en 2 x lijn gemiddeld, met behulp van de "Capture"-knop.
    7. De locatie opslaan in het XYZ-overzicht met de "+" knop. Dit zorgt ervoor dat het zelfde gebied van weefsel is niet heroverd.
    8. Voor elk stukje weefsel 10 foto's vastleggen van niet-overlappende gezichtsveld.

7. DSC Protocol

Opmerking: Ga verder met deze stap zodra weefsel voorbereiding voltooid, regionale DSC p.a., of is na het weefsel imaging wanneer SHGM wordt uitgevoerd.

  1. DSC pannen, gewogen en label voor te bereiden.
    Opmerking: Deze stap moet gebeuren vóór weefsel dissectie om te minimaliseren van weefsel uitdroging.
  2. Elk scleral vierkant met een absorberend tissue droog en leg het plat op de bodem van een pan van de DSC met getande pincet.
  3. Weeg de pan met de weefsel binnen en het deksel gekruld en bedekt te verkrijgen van het weefsel nat gewicht (de massa van de monsters moet worden in de range van 5 tot en met 11 mg).
    Opmerking: Seal elke pan met behulp van de krimptang alvorens tot het volgende weefsel monster. De pannen zijn hermetisch afgesloten, voorkomen van waterverlies vóór thermische analyse.
  4. Zodra het monster is geribbeld, plaats het op de aangewezen locatie op de DSC-lade. Moet er 6 monsters voor het besturingselement en 16 voor het behandelde oog.
  5. Maken van een methode met behulp van instrument beheren van software, het opgeven van het gewicht van het weefsel en uitvoeren van de thermische analyse met behulp van de volgende parameters: temperatuurbereik van 40 tot 80 ° C, opwarmsnelheid: 1 ° C/min, warmtestroom: 17.37 mW, gasstroom (N2): 19,8 mL/min, Gas druk: 2,2 bar.
  6. Zodra voltooid, analyseren de gegevens voor elk monster door het extraheren van de overgang temperatuur piek op welke thermische denaturatie optreedt met behulp van het instrument voor het beheer van software.

8. de beeldanalyse

  1. SHG signaal
    1. Selecteer ten minste 5-10 van de meest representatieve beelden van elke behandeling en de controle, zodat het gebied van de afbeelding wordt bezet door meestal collageenvezels.
    2. Elke afbeelding in ImageJ software uploaden en meten van de intensiteit van de gemiddelde pixel door het selecteren van analyseren > maatregel voor de actieve afbeelding.
    3. De waarden die geëxtraheerd worden gerapporteerd als de gemiddelde pixel intensiteit en kan ook worden aangetoond door het uitzetten van het histogram van intensiteiten door te selecteren in het menu analyseren > Histogram.
    4. Met behulp van een Excel-werkblad, een tabel voor het documenteren van alle gemeten gegevens dienovereenkomstig maken de monster-id.
    5. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van pixel intensiteit voor elke voorwaarde die behandeling en controle.
    6. Met behulp van de student t-test, verschillen voor alle paarsgewijze vergelijkingen van concentraties (d.w.z., 40 mM SMG vs. 0 en 400 mM SMG vs. 0) te vergelijken. [P≤0.05].
  2. Waviness
    1. Selecteer een afbeelding die wordt weergegeven de collageenvezels. Ten minste 10 beelden per monster moeten worden geanalyseerd (met inbegrip van een controlemonster voor elke concentratie - ten minste 40 in totaal).
    2. Open ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ vereist de voorafgaande installatie.
    3. Upload alle imagesby naar een geopend venster van de NeuronJ te slepen.
    4. Maken van tracering lijnen langs de vezels, volgt de omtrek van de fibril met de muis (pen Tekentabletten kan worden gebruikt), klikt u op M voor het meten van de afstand van totale vezel lengte.
    5. Selecteer "Optie" tangentiële rechte lijnen tekenen en verbinden het begin en het einde van de eerder getekende vezel contour. Klik nu op M voor het meten van de lengte van de end-to-end.
    6. Herhaal dezelfde procedure op ten minste 10 fibrillen per beeld.
    7. Deze twee metingen van elk van de 10 fibrillen verzamelen en inbreng van de gegevens in een excel-spreadsheet, totale vezel lengte (omtrek) en end-to-end lengte (rechte verbindingslijnen lijn) uitdrukken als lengte [kromme] en lengte [lineaire], respectievelijk.
    8. Berekening van de waviness-index (W) met behulp van de formule: W = lengte [kromme] / lengte [lineaire].
    9. Bereken het % van waviness vergelijking van de gegevens van de beelden van de behandelde samples(SMG) met de beelden van de controlemonsters met behulp van de formule: (W [SMG] - 1) / (W [beheer] - 1)
    10. Een paarsgewijze t-toets voor waviness index (W) uitvoeren om te bepalen van de statistische verschillen (p-waarden) van collageen vezels morfologie tussen verschillende behandeling voorwaarden en controle.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thermische denaturatie temperatuur (Tm) als een test method to evaluate methode TXL dwarsbinding effect: Een totaal van 16 paren van konijn ogen werden gebruikt in deze experimenten voor de TXL-procedure. Als een eerste deel van deze studie, werd de lokalisatie van cross-linking effect geïnduceerd door een enkele injectie van de cross-linking agent SMG via sT ruimte in het hoofd van dode foetussen konijn geëvalueerd. Dit type experiment sinds relevantie voor de klinische ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitgevoerde experimenten hebben aangetoond bewijs ter ondersteuning van het gebruik van de SHG signaal microscopie als een methode voor de evaluatie van collageen dwarsbinding effecten in sclera, verhogen van de toekomstige mogelijkheid van het gebruik van deze techniek als een controle-instrument voor de dwarsbinding behandelingen die gericht collageen eiwitten. Van de nota is een instrument al in klinische gebruik dat potentieel dit signaal SHG kan vangen. Hoewel dit instrument was vooral bedoeld voor imaging huid mens...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Tongalp Tezel, MD, voor raadpleging met betrekking tot sT injectie; Theresa Swayne, PhD, voor raadpleging met betrekking tot de SHG microscopie; en Jimmy Duong uit de ontwerp- en Biostatistiek Resource- alsmede de Biostatistical kern faciliteit van het Irving Institute at Columbia University Medical Center.

Deels gesteund door onderzoek te voorkomen blindheid en door de nationale instituten van gezondheid subsidies NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007 NCI P30 CA013696 en NEI R01EY020495 (DCP). Verwante intellectuele eigendom van de eigenaar van de Columbia University: U.S. afgegeven octrooien neen: 8,466,203 en no: 9,125,856. International patent aangevraagd: PCT/US2015/020276.

Beelden werden verzameld in de Confocal en gespecialiseerd microscopie gedeelde Resource van de Herbert Irving uitgebreide Cancer Center aan de Columbia University, ondersteund door de NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). De confocal microscoop werd gekocht met NIH verlenen van #S10 RR025686.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120VEMD Millipore, Massachusetts, USADubbel gedistilleerd, gedeïoniseerd water. - protocol stap 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USACrosslinking reagens - protocol stap 1.1.2
Injectienaald met luer-lock spuitBD Eclipse, NJ, USASpuit voor sub tenon injectie. - protocol stap 2.1
KonijnenhoofdLa Granja pluimveeOutbredKonijnenhoofd gescheiden en geleverd binnen 1 uur postmortem. - protocol stap 2.2
Tono-pen Reichter Technologies Depew, NYIOP metingen - protocol stap 2.4
DSC 6000 AutosamplerPerkin-Elmer Waltham, MA, USAThermische denaturatie analyzer - protocol stap 7.4
Pyris software Perkin-Elmer, Waltham, MA, USAVer 11.0 protocol stap 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MPNikon Instruments, Melville, NY, USAEen waterimmersie objectief met hoge IR transmissie met een werkafstand van 2,0 mm - protocol stap 8.1.1.
GenTeal Alcon, Fort Worth, TX B000URVDQ8Watergebaseerde gel gebruikt als objectief immersieve medium in plaats van water om verdamping te voorkomen - 8.1.1
Chameleon Vision II Coherent, Santa Clara,CA, USATi:Sapphire gepulseerde laser met een pulsbreedte van 140 fs bij 80 MHz en een instelbaar bereik van 680 nm tot 1080 nm. - protocol stap 8.1.11
AttoFluor celkamerThermo Fisher Scientific IncA7816Fixatie van de dekglas - protocol stap 8.1.3
25-mm ronde dekglazen, #1.5Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USAGG-25-1.5protocol stap 8.1.3
Eclipse Ti-ENikon Instruments, Melville, NY, USAprotocol stap 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detectorNikon Instruments, Melville, NY, USAUitgerust met een 400-450 nm band pass filter - protocol stap 8.1.7
A1R-MP laser scanning systeemNikon Instruments, Melville, NY, USACompatibel met infrarood (IR) multi-foton excitatie. - protocol stap 8.1.8
NIS Elements softwareNikon Instruments, Melville, NY, USAVer 4.3verwezen naar als "software" in de tekst - protocol stap 8.1.9
Fiji/ImageJNational Institute of Health protocol stap 9.1.2
NeuronJEric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlandshttps://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, voor protocol stap 9.2.2
Microsoft Excel Microsoft Corporation, Redmond, WA, USAVer 14protocol stap 9.2.8

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
  3. Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
  4. Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
  5. Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
  6. Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
  7. Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
  8. Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
  9. Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89(2015).
  10. Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
  11. Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
  12. da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
  13. Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
  14. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94(1986).
  15. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  16. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  17. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
  18. Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004(2013).
  19. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  22. Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
  23. Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040(2009).
  24. Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
  25. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  26. Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
  27. Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
  28. Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
  29. Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
  30. Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
  31. Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
  32. Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
  33. Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
  34. Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
  35. Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
  36. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  37. Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
  38. Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
  39. McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
  40. Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
  41. Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
  42. Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
  43. Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
  44. Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
  45. Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
  46. Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
  47. Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
  48. Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
  49. Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SHG microscopiedifferenti le scannende calorimetriesub tenon injectiecollageenfibrillenformaldehyde afgevend middellaser scannende microscopiethermische denaturatie

Gerelateerde artikelen