Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56391

⸱

1 juni 2018

 ,  , 
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Wij beschreven twee chemische-gebaseerde protocollen voor het kweken van muis embryonale stamcellen in detail. Deze nieuwe methode maakt gebruik van synergetische mechanismen ter bevordering van Tet-gemedieerde oxidatie (door vitamine C) en onderdrukken van DOVO synthese van 5-methylcytosine (door PD0325901) om DNA hypomethylation en pluripotent van muis embryonale stamcellen te onderhouden.

Samenvatting

Embryonale stamcellen (ES) hebben het potentieel om te onderscheiden in een van de drie lagen van de kiem (endoderm, mesoderm of ectoderm), en vele geslachten voor regeneratieve geneeskunde kunnen genereren. ES cel cultuur in vitro lang het onderwerp geweest van wijdverbreide bezorgdheid. Klassiek, muis ES-cellen worden bijgehouden in serum en leukemie remmende factor (LIF)-met medium. Echter onder voorwaarden van de serum/LIF, cellen heterogeniteit in de morfologie en het profiel van de expressie van genen pluripotent-gerelateerde weergeven, en zijn meestal in een metastabiele staat. Bovendien, gekweekte ES-cellen vertonen wereldwijde hypermethylation, maar naïef ES-cellen van de binnenste cel massa (ICM) en primordial kiemcellen (PGCs) zijn in een staat van wereldwijde hypomethylation. De toestand van de hypomethylated van ICM en PGCs is nauw verbonden met hun pluripotent. Ter verbetering van muis ES cel cultuur methoden, hebben we onlangs een nieuwe methode gebaseerd op het selectief gecombineerd gebruik van twee kleine-molecuul verbindingen de DNA-hypomethylated en pluripotente toestand te handhaven ontwikkeld. Hier presenteren we dat de gezamenlijke behandeling van vitamine C (Vc) en PD0325901 kunt ongeveer 90% van de 5-methylcytosine (5mC) 5 dagen op muis ES cellen wissen. De inhoud van de gegenereerde 5mC is vergelijkbaar met die in PGCs. Het mechanistisch onderzoek blijkt dat PD0325901 up-regelt Prdm14 expressie om te onderdrukken Dnmt3b (DOVO DNA methyltransferase) en Dnmt3l (de cofactor van Dnmt3b), door vermindering van DOVO 5mC synthese. VC vergemakkelijkt de omzetting van 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) gekatalyseerde voornamelijk door Tet1 en Tet2, met vermelding van de betrokkenheid van zowel de actieve als de passieve DNA-demethylations. Bovendien Toon muis ES cellen onder Vc/PD0325901 voorwaarden, homogene morfologie en pluripotente staat. Gezamenlijk stellen wij een roman en chemische-synergy cultuur methode voor het bereiken van DNA-hypomethylation en het onderhoud van pluripotent in muis ES-cellen. De kleine-molecuul chemische-afhankelijke methode overwint de grote tekortkomingen van serum cultuur en houdt belofte voor het genereren van homogene ES-cellen voor verdere klinische toepassingen en onderzoeken.

Inleiding

ES-cellen zijn afkomstig uit de ICM een blastocyst-1. De cellen kunnen in een Braziliaanse pluripotent zijn en alle somatische lineages en germline cellen2. Oprichting van ES-cellen biedt de mogelijkheid te onderzoeken van de ontwikkeling processen in vitro en cellen voor medische relevantie voor regeneratieve geneeskunde op basis van hun pluripotent3kan genereren.

Twee groepen seminally de muis ES-cellijnen opgericht in 1981 en wanneer cellen afgeleid van het vroege embryo muis werden gekweekt in de foetale runderserum (FBS)-met medium met muis embryonale fibroblasten (MEFs) als de feeder laag1,4 . MEFs mitotically waren geïnactiveerd en vooraf waren gegroeid in gerechten vóór het kweken van ES-cellen. MEFs ondersteuning voor muis ES cel bijlage en produceren van groeifactoren te bevorderen van voortplanting en onderdrukken de differentiatie5, terwijl FBS essentiële trofische factoren en hormonen voor celproliferatie biedt. Latere studies aangegeven dat LIF geproduceerd door feeder cellen de belangrijkste cytokine voor zelf-vernieuwing en onderhoud van pluripotent in muis ES-cellen was, en de toevoeging van LIF in het medium voor feeder cellen6 vervangen kon. Het uithoudingsvermogen van muis ES cellen in FBS/LIF medium op feeders is momenteel nog steeds de standaard methode die door veel onderzoekers aangenomen. Echter, sommige problemen met deze benadering van de klassieke cultuur. Ten eerste, feeder cellen afscheiden van overtollige en ongecontroleerde factoren en pathogene besmetting7kunnen veroorzaken. Om te voorkomen dat deze inmenging, coating het oppervlak van gerechten met gelatine en de toevoeging van LIF in serum-bevattende medium zijn alternatieve methoden voor het behoud van de muis ES cellen zonder feeder-laag cellen. Bovendien vertonen de muis ES cellen geteeld onder omstandigheden van de serum/LIF morfologische heterogeniteit in cel populaties, en zelfs in de mate van expressie van pluripotent-gerelateerde factoren8. Recente studies suggereren dat onder omstandigheden van de serum/LIF, de kern pluripotent-gerelateerde transcriptiefactoren (met inbegrip van SOX2, Nanog en OCT4) de pluripotent door middel van LIF en WNT signalering ondersteunen kunnen; echter, met name, zij ook activeren een fibroblast groeifactor (FGF) signaal om differentiatie8trigger. Als gevolg van de ambivalente dubbele actie van de kern transcriptiefactoren, muis ES cellen gekweekt in het serum aanwezig heterogeniteit, bestaande uit twee verwisselbare populaties, een soortgelijk aan ICM en een ander lijkt de op de voorbehandelde epiblast staat8. Bovendien, muis ES cellen in serum vertonen vaak global hypermethylation9, overwegende dat ICM en PGCs zijn in een staat van de wereldwijde hypomethylated, die nauw is met hun pluripotent9,10 verbonden.

Er is een aanzienlijke vraag naar het ontwikkelen van nieuwe methoden voor het kweken van muis ES-cellen. Diverse verbeterde protocollen zijn vastgesteld sinds 200311 maar er nog steeds enkele beperkingen en tekortkomingen7. Sinds 2008, het gecombineerde gebruik van twee kleine-molecuul kinase-remmers, PD0325901 (de Inhibitor van de omwenteling van de mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) / extracellulaire-signaal-gereglementeerde kinase (ERK) (MEK)) en CHIR99021 (de Inhibitor van de omwenteling van glycogeen synthase kinase 3 (GSK3)), in N2B27 medium met LIF en zonder serum voor kweken muis ES12 cellennieuwe perspectieven heeft geopend. Deze nieuwe beschreven medium wordt gekenmerkt door het gebruik van twee remmers (2i). Muis ES-cellen gekweekt in 2i/LIF medium zijn meer homogeen in cel populaties en de uitdrukking van pluripotent factoren. Daarnaast vertonen 2i/LIF-gekweekte muis ES-cellen DNA hypomethylation wereldwijd, die dichter bij ICM-achtige cellen9,13is. Zelfs zo, heeft 2i cultuur zijn nadelen. PD0325901 en CHIR99021 zijn onoplosbaar in water en in het algemeen worden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO)-op basis van de stamoplossing te voegen in een kweekvloeistof. Studies hebben aangetoond dat langdurig en lage dosis blootstelling van cellen aan DMSO kan leiden tot cytotoxiciteit14.

Hier, we twee kleine-molecuul verbindingen gebruikt en ontwikkelde een nieuwe methode van de cultuur van muis ES-cellen. De nieuwe cultuur methode combineert Vc en MEK-remmer PD0325901 ter bevordering van DNA hypomethylation snel en doeltreffend tot een vergelijkbaar niveau van PGC, genoemd als het protocol voor het kweken van Vc/PD0325901. Muis ES cellen in serum-bevattende medium Vc/PD0325901-toegevoegde vertonen homogeniteit in de morfologie en zijn opgelopen in een grondtoestand. Vergeleken met 2i cultuur, muis ES cellen gekweekt onder Vc/PD0325901 voorwaarden vertonen sneller kinetiek van DNA-demethylatie en het hypomethylation niveau vergelijkbaar met die van PGC kunnen bereiken. Bovendien, het gebruik van een enkele inhibitor (PD0325901) vermindert de input DMSO tot medium in vergelijking met die gebruikt in 2i (PD0325901/CHIR99021) en vermindert de schade aan cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding

  1. Bereiden van een oplossing van 1,0 mM PD0325901 (MEK-remmer) en 3.0 mM CHIR99021 (GSK3-remmer).
    1. Weeg 2 mg PD0325901 en voeg 4.15 mL van DMSO in een flesje amberkleurig glas.
    2. Weeg 2 mg CHIR99021 en voeg 1.43 mL van DMSO in een flesje amberkleurig glas.
    3. Volgende reconstitutie, (50 µL/buis in 200 µL PCR buizen) aliquots bij-20 ° C worden opgeslagen en beschermd tegen licht. Verwijder een buis met de bevroren voorraad van een vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur vóór gebruik.
  2. Weeg 0.0176 g van Vc in 1 mL van een centrifugebuis en reconstrueren het met 1 mL steriel water met een eindconcentratie van 100 mM vóór gebruik.
  3. Inactivering van FBS: Incubeer FBS 500 mL in een waterbad bij 56 ° C gedurende 30 min.
  4. 600 mL voedingsbodem voor te bereiden voor het kweken van muis ES-cellen.
    1. Gebruik van een fles van DMEM/hoge glucose medium (500 mL) en verwijderen van 40 mL.
    2. Supplement 460 mL van DMEM/hoge glucose medium met 20% geïnactiveerd FBS (120 mL), 1000 U/mL LIF (60 µL van 107 U/mL stockoplossing), 0.1 mM niet-essentiële aminozuren (NEAA) (6 mL van de stockoplossing 10 mM), 1 mM natrium pyruvaat (6 mL van de stockoplossing 100 mM) , 2 mM L-glutamine (6 mL van de stockoplossing van 200 mM), 0.1 mM β-mercaptoethanol (600 µL van 100 mM stockoplossing), en 33 IU/mL penicilline en 33 µg/mL streptomycine (2 mL penicilline-streptomycine gemengd oplossing (10.000 IE/mL penicilline en 10.000 µg Mo/mL streptomycine)) . Definieer de voedingsbodem als serum medium.
    3. Pipeteer 50 µL van de stockoplossing van PD0325901 (1,0 mM) en Vc (100 mM), respectievelijk, in 50 mL van het serum medium (eindconcentratie: 1.0 µM PD0325901 en 100 µM Vc), en definiëren van de middellange als Vc/PD0325901 medium.
      Opmerking: Bereiden de Vc/PD0325901 middellange fresh vóór gebruik als gevolg van de instabiliteit van Vc.
    4. Met behulp van een precisiepipet, breng 50 µL van de stockoplossing van PD0325901 (1,0 mM) en CHIR99021 (3,0 mM), respectievelijk, in 50 mL van het serum medium (eindconcentratie: PD0325901 1.0 µM en CHIR99021 3.0 µM), en definiëren van de middellange als 2i medium.
  5. De gelatine beklede gerechten te bereiden.
    1. Bereid de 0,1% gelatine-oplossing: los van 0,3 g gelatine in 300 mL ultrazuiver water in een glazen reagens fles met een dop en steriliseren in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. winkel de steriele oplossing bij kamertemperatuur.
    2. Incubeer de cel cultuur gerechten (6 cm diameter) met 2 mL 0,1% gelatine oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens gecombineerd de gelatine. De gerechten in de lucht droog en ze gebruiken binnen 12 uur.
  6. Bereiden van 10 mL van muis ES cel bevriezing medium in een centrifugebuis 15 mL: 90% FBS (9 mL) en 10% DMSO (1 mL). Gebruik het medium binnen 1 dag.
  7. Bereiden van een bevriezing container: 100% isopropylalcohol aan de vullijn van de bevriezing container toevoegen en verwijderen van de oude isopropyl-alcohol. Voeg nieuwe isopropyl alcohol direct na elke vijf keer gebruiken.
  8. Maken van de enzymatische spijsvertering-buffer: Weeg 1.2114 g van Tris poeder in 100 mL ultrazuiver water toevoegen te bereiden 100 mM Tris oplossing geconcentreerd zoutzuur (ongeveer 12 M) in de oplossing van Tris op pH 7,6 (ongeveer 0,6 mL geconcentreerd zoutzuur).
  9. 50 mL radio immunoprecipitation assay buffer (buffer RIPA) bereiden: 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20% glycerol, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Te vullen met 1 mM DTT, 1 X proteaseinhibitor cocktail, en 1 mM PMSF vóór gebruik. Zodra de PMSF is toegevoegd, gebruikt u de buffer binnen 30 min.

2. groeien muis ES-cellen op gelatine beklede gerechten

  1. Vooraf warm muis ES-cellen (wild type, 129 SvEv) cultuur medium, trypsine en fosfaatgebufferde oplossing (PBS) in een waterbad bij 37 ° C.
  2. Passage van de cellen. Gecombineerd het medium volledig uit de schotel en Pipetteer 2 mL PBS aan de gerechten te spoelen van de cellen.
    1. Verwijder de PBS met een pipet en wassen van de cellen opnieuw met 2 mL PBS.
    2. Verwijder de PBS en Voeg 0.3 mL trypsine-EDTA (0,25%) toe aan elk gerecht.
    3. Betrekking hebben op de hele schotel met de trypsine snel en dan onmiddellijk verwijderen.
    4. Zet de schotel in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 minuut om de cellen van de Schotel los te maken. Neem de gerechten uit de incubator en voeg toe 2 mL voorverwarmde serum middellange tot het beëindigen van de actie van trypsine.
    5. Distantiëren van de kolonies van de cel in een enkele celsuspensie door resuspending met een pipet (5 mL pipet tip) 10 keer.
  3. Breng 150 µL van 2 mL van de oplossing van de cel (ongeveer 190.000 cellen door te tellen met een hemocytometer) in een nieuwe gelatine beklede schotel, en aan te vullen met 3 mL van versgemaakte Vc/PD0325901 medium per 6 cm cultuur schotel. Cultuur van de cellen in een incubator 37 ° C met 5% CO2.
  4. Elke 24 uur tijdens het broeden, verwijder het oude kweekmedium en voeg 3 mL verse Vc/PD0325901-medium in de schotel van de cultuur als gevolg van de instabiliteit van Vc. Expect 70-80% confluentie na 2-3 dagen.
  5. Na het bereiken van 70-80% confluentie, passage van de cellen en blijven ze zoals beschreven in stappen 2.2-2.4 cultuur.

3. bevriezen en ontdooien muis ES-cellen

  1. Bevriezen muis ES-cellen.
    1. De cellen van de schotels met trypsine loskoppelen door stap 2.2.
    2. Breng de cellen in een plastic tube van 15 mL en centrifuge bij 800 x g en kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
    3. Dump de bovendrijvende vloeistof zachtjes in een bekerglas en resuspendeer de pellet cel met 1 mL vers gemaakte bevriezing medium. Bereiden de bevriezing middellange 30 min vóór deze stap om ervoor te zorgen dat er kamertemperatuur vóór gebruik.
    4. Overdracht van de cellen in de bevriezing van de middellange-tot een 1.8 mL microcentrifuge buis met een 1 mL pipet en plaats de microcentrifuge buis in een bevriezing container. Isopropyl alcohol toevoegen aan de vullijn van de bevriezing container en bewaar deze bij kamertemperatuur alvorens het te gebruiken.
    5. Laat de bevriezing containers's nachts in een vriezer-80 ° C.
    6. De microcentrifuge-buizen overbrengen in een container van vloeibare stikstof tot 2 – 3 jaar.
      Opmerking: Doe niet houden cellen in het ijskoude medium voor een lange tijd en de cellen snel overbrengen in een vriezer-80 ° C als gevolg van de toxiciteit van DMSO.
  2. Ontdooi muis ES-cellen.
    1. Vooraf warm 50 mL serum voedingsbodem in een waterbad 37 ° C.
    2. Neem een cel-bevattende flesje uit de vloeibare stikstof-container en dompel de afgetopte ampul in een waterbad 37 ° C. Schud het snel in het waterbad te ontdooien. Breng de cellen in een tube van 15 mL met een pipet 1 mL. Voeg 2 mL voorverwarmde serum kweekmedium in de buis te verdunnen het bevriezing medium en vervolgens Centrifugeer bij 800 x g en kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
    3. Verwijder het supernatant en resuspendeer zachtjes de cel pellets met verse Vc/PD0325901 medium gebruik van een 5 mL-pipet 3 mL.
    4. De cellen van de tube van 15 mL overbrengen in een gelatine beklede schotel en cultuur van de cellen voor 24 h. cultuur de cellen opnieuw zoals beschreven in stap 2.

4. uittreksel totaal eiwit uit cellen

  1. Spoel de verzamelde cellen met 1 mL PBS en vervolgens Centrifugeer bij 800 x g en kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
  2. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel grondig met RIPA buffer pipetteren zachtjes met DTT, proteaseinhibitor cocktail en PMSF aangevuld. Het volume van de buffer RIPA is ongeveer 5 x die van de cel pellet.
    Opmerking: Uit de cel resuspensie op ijs te voeren.
  3. Houd de cellen in de buffer RIPA gedurende 30 minuten op ijs en centrifugeer bij 13.000 x g en 4 ° C gedurende 5 min.
  4. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en slaan aliquots bij-80 ° C.
  5. Bepaal de concentratie van het eiwit met de een Bradford eiwit assay kit.

5. het uittreksel van DNA uit cellen en Digest DNA in een enkele Nucleoside met behulp van enzymen

  1. De cellen met trypsine verzamelen zoals beschreven in stappen 3.1.1 en 3.1.2.
  2. De DNA-extractie uit te voeren met een genomic DNA zuivering kit na instructies van de fabrikant.
  3. Bewaar de geëxtraheerde DNA in 1 mL centrifuge buizen. Voeg 100 µL ultrazuiver water in de centrifugebuis, en los van het DNA door pipetteren ongeveer 15 keer. Bepaal de concentratie en het evalueren van de kwaliteit van DNA door het meten van de absorptie bij 260 nm en 280 nm15. De DNA-concentratie is ongeveer 500 ng/µL.
  4. Digest 5 µg van DNA in een 50 µL oplossing systeem: Voeg 5 µL van 100 mM Tris-HCl-oplossing, pH 7,6 (eindconcentratie: 10 mM), 2 U kalf intestinale fosfatase, 1 U DNase I, 0.005 U snake venom fosfodiësterase ik, en 5 µg van DNA (het berekenen van de toegevoegde volume volgens de measu rode DNA-concentratie, ~ 10 µL) in een centrifugebuis en verhoging van het volume van de oplossing voor 50 µL met ultrazuiver water. Incubeer het mengsel bij 37 ° C's nachts. Centrifugeer de verteerd DNA-oplossing bij 1000 g en kamertemperatuur voor 1 min voor het verzamelen van de oplossing naar de onderkant van de buizen.
  5. Breng de verteerd DNA-oplossing van de centrifuge buizen in ultra-filtratie buizen (een molecuul gewicht cutoff: 3 kDa) en centrifuge bij 13.000 g- en 4 ° C gedurende 30 minuten om de spijsvertering enzymen.
  6. Bereid de monsters voor de analyse van 5mC en 5hmC.
    1. P.a. 5hmC: Pipetteer 36 µL van filter oplossing voor een nieuwe centrifuge buis (1 mL) en voeg 4 µL van 5'-(hydroxymethyl-d3),-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) met de uiteindelijke concentratie van 3 nM.
    2. P.a. 5mC: 196 µL van ultrazuiver water in een nieuwe centrifugebuis en Pipetteer 4 µL van filter oplossing toevoegen aan de buis (50-fold verdunning), als gevolg van de hoge dichtheid van 5mC in genomic DNA. Breng 36 µL van de verdunde oplossing tot een nieuwe centrifugebuis en voeg 4 µL van (5'-(methyl-d3),-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) met de eindconcentratie van 50 nM. Gebruik [D3]-5hmC en [D3]-5mC als de interne standaard te kalibreren van 5hmC en 5mC, respectievelijk.
  7. Overdracht van de monsteroplossing meten buizen en bewaren bij 4 ° C. 5mC en 5hmC met ultra-high-performance liquid chromatography-triple vierpolige massaspectrometrie met meerdere-reactie monitoring (UHPLC-MS/MS (MRM)) zoals beschreven in een vorige verslag15analyseren.

6. het analyseren van 5mC en 5hmC met behulp van UHPLC-MS/MS15

  1. Verschillende parameters voor het analyseren van 5mC en 5hmC instellen met behulp van de UHPLC-MS software.
    1. Het stellen van een nieuwe methode. Open de software en klik op "bestand | Nieuw | Methode". Vertonen het berichtvak van "Method Editor" met de inhoud "Wilt u de wijzigingen voor de huidige methode wilt opslaan" en klik op "Nee".
    2. Het bouwen van de parameters van de sampler. Klik op "Sampler | Setup | Injectie". Selecteer "Standaard injectie" en "5 µL op geïnjecteerde volume" input.
    3. De parameters van de pomp in UHPLC bouwen.
      1. Klik op "BinPump2 | Setup"om te bouwen van de parameters van de pomp. Instellen "Flow" op "0,25 mL/min" en "Stop time" op "15 min".
      2. Instellen "Oplosmiddel B op 5%" en "Limieten druk" op "Max 600 bar".
      3. Klik op "BinPump2 | Tijdschema"te bouwen de isocratic elutie parameters voor 5mC analyse. Klik op "Toevoegen" als een rij wilt toevoegen. Ingang "0.00" op "Tijd" en "5.0" op "B %". Klik op "Toevoegen" eens te meer om een nieuwe rij toevoegen. Ingang "15.00" op "Tijd" en "5.0" op "B %".
      4. Klik op "BinPump2 | Tijdschema"om te bouwen van de kleurovergang elutie parameters voor 5hmC analyse. Klik op "toevoegen als een rij wilt toevoegen. Ingang 0,00 op tijd en 5.0 op "B %". Klik op "Toevoegen" eens te meer om een nieuwe rij toevoegen. Ingang "3.00" op "Tijd" en "5.0" op "B %". Klik op "Toevoegen" voor een andere 6 keer 6 rijen worden toegevoegd. Ingang "3.01" op "Tijd" en "15,0" op "B %", "6,00" op "Tijd" en "15,0" op "B %", "6.01" op "Tijd" en "100" op "B %", "10.00" op "Tijd" en "100.0" op "B %", "10.01" op "Tijd" en "5.0" op "B %", "15.00" op "Tijd" en "5.0" op "B %" in volgorde.
        Opmerking: De analyse van 5mC en 5hmC individueel als gevolg van de scheiding van de verschillende gebruiksvoorwaarden UHPLC uitvoeren
    4. De parameters van de temperatuur van het compartiment (TCC) van de kolom in de UHPLC bouwen.
      Klik op "TCC | Setup | temperatuur (links) "en"30 ° C"input.
    5. Stellen de parameters van de QQQ-MS/MS.
      1. Klik op "MS QQQ | Stop de tijd | Geen limiet/als pomp"," Ion bron | ESI"," tijd filteren | Piekbreedte: 0.07 min ". Instellen "tijd van segmenten: Begintijd: 0"; "Scantype: MRM"; "Div waarde: MS"; "Delta EMV (+): 200" en "Delta EMV (-): 0".
      2. Bouwen van de parameters van de controle van de overgangen van 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC en D3-5hmC
        1. Klik op "MS QQQ | Overname | Scannen segmenten: wonen: 90"; "Fragmentor: 90"; "Botsing energie: 5"; "Cel Accelerator Voltage: 4" en "polariteit: positieve".
        2. Ingang "5mC" op "Samengestelde naam", "242" atie"voorloper", "126" bij "Product Ion" voor 5mC analyse. Klik op de rechter knop en selecteer "Rij toevoegen" om een nieuwe rij toevoegen. Input "D3-5mC" op "Samengestelde naam", "245" atie"voorloper", "129" bij "Product Ion" voor D3-5mC-analyse.
        3. Aanvulling andere drie rijen met dezelfde modus. Ingang "dC" op "Samengestelde naam", "228" atie"voorloper", "112" bij "Product Ion" voor dC analyse. Ingang "5hmC" op "Samengestelde naam", "258" atie"voorloper", "142" bij "Product Ion" voor 5hmC analyse. Ingang D3-5hmC op samengestelde naam, "261" atie"voorloper", "145" bij "Product Ion" voor D3-5hmC-analyse.
      3. De parameters van de gas-bron te bouwen. Klik op "MS QQQ | Bron | Source parameters: Gas Temp: 300 ° C "; "Gas Flow: 11 L/min"; "Vernevelaar: 15 psi"; "Positieve-capillair: 3500 V".
      4. Sla de voorgestelde methode. Klik op "MS QQQ | Instrument | De methode Save". Selecteer een traject voor de voorgestelde methode van "Map" en geef een naam voor de methode door het invoeren van de inhoud van "Methode", bijvoorbeeld: 5mC en 5hmC analyse.
  2. UHPLC scheiding en MS/MS analyse van mononucleosides
    1. Bereiden de mobiele fase voor 5mC en cytosine (C) analyse: vormen de mobiele fase van oplossing A en B. oplossing A: 500 mL ultrazuiver water met 500 µL van mierenzuur (uiteindelijke concentratie: 0.1%), en oplossing B: 500 mL voor 100% methanol. Meng de oplossing A en B bij 95:5 (v: v) als de mobiele fase te elueren 5mC en C (ingesteld in stap 6.1.3.3). Het debiet vastgesteldop 0,25 mL/min (ingesteld in stap 6.1.3.1).
    2. De mobiele fase door oplosmiddel A en B voor 5hmC analyse voor te bereiden. Oplosmiddel A is 2.0 mM NH4HCO3 waterige oplossing (pH 9.0) (500 mL), en oplosmiddel B is 100% methanol (500 mL). Aparte 5hmC door een geoptimaliseerde kleurovergang elutie: 0-3 min, 5,0% B en 95% per (v: v); 3-6 min, 15,0% B en 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15 min, 5,0% B en 95% A (ingesteld in stap 6.1.3.4). Het debiet vastgesteldop 0,25 mL/min (ingesteld in stap 6.1.3.1).
  3. Electrospray MS/MS gebruiken met MRM modus (ingesteld in stap 6.1.5.1) te analyseren van de elutie van de kolom en het aannemen van het positieve ion-modus (ingesteld in stap 6.1.5.2.1).
    1. Controleren van de overgangen: 5mC, m/z 242→126 (botsing energie, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (te zetten in stap 6.1.5.2.2).
    2. De capillaire en fragment spanningen vastgesteldop +3,500 V (ingesteld in stap 6.1.5.3) en 90 V (ingesteld in stap 6.1.5.2.1), respectievelijk.
    3. Het geïnjecteerde volume vastgesteldop 5 µL en analyseren van elk monster 3 keer (ingesteld in stap 6.1.2). Dienst van de bijbehorende standaard curven te evalueren van de hoeveelheid 5mC en 5hmC.
      1. De standaard curve van 5mC: 1 – 50 nM transfer (1, 5, 10, 20, 50 nM, eindconcentratie) standaardoplossing van de 5mC in centrifuge buizen en voeg 50 nM [D3]-5mC buizen. Aanvulling het totale volume aan 50 µL. uitvoeren van de analyse van de standaard 5mC de instructies volgen voor het 5mC monster (stap 6).
      2. Bouwen van de standaard curve van 5hmC: 1 – 20 nM overdragen (1, 2, 5, 10, 20 nM, eindconcentratie) standaardoplossing van de 5hmC te centrifugeren van buizen en voeg 3 nM [D3]-5hmC de buizen. Aanvulling het totale volume aan 50 µL. uitvoeren van de analyse van de standaard 5hmC de instructies volgen voor het 5hmC monster (stap 6).

7. het analyseren van de statistische significantie

  1. De statistische analyses met behulp van software uit te voeren.
    1. Open de software en selecteer "Kolom" in "nieuwe tabel & grafiek". Stel de parameters als volgt: "proef van gegevens | Begin met een lege tabel"; "Kies een grafiek-de eerste modus"; "Graphing wordt gerepliceerd of foutbalken | Plot | Bedoel met SEM".
    2. Klik op "Create" input van de drie replicaat-organismen van de groep van de controle- en Vc/PD0325901-behandeld in de "A" en "B"-lijn, respectievelijk. De zes gegevens selecteren en klik op "Analyseren" in de "analyse".
    3. Selecteer "t tests (non-parametrische tests)" in "Kolom Analyses" en klik op "OK" om de volgende interface.
    4. Stel de parameters als volgt: "Kies test | De naam van de test | Ongepaarde t -test; Opties | Tweezijdige"; "Betrouwbaarheidsintervallen: 95%"; "Significante cijfers | Toon 4 significante cijfers". Klik op "OK" om het verwerven van de p -waarde tussen de controle- en Vc/PD0325901 behandeling.
  2. Evalueren van de statistische significantie tussen het besturingselement en de experimentele groepen met tweezijdige en ongepaarde van de Student t-test van16.
    Opmerking: p < 0.05 duidt het bezitten van statistisch significant verschil. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

VC/PD0325901 geïnduceerde synergetisch global wissing van muis ES-cellen. Muis ES cellen in serum vertonen DNA hypermethylation, terwijl pluripotente ICM cellen en PGCs Toon globale verwijdering van methylation van DNA en de hypomethylated staat nauw verbonden met hun pluripotent9,10 is.

Eerder, wij en anderen gevonden dat Vc Tet-gemedieerde 5mC demethylatie

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In het werk, wij een nieuwe methode van het combineren van Vc en PD0325901 te houden muis ES-cellen om een ongedifferentieerde en hypomethylated state, die werd bereikt door een synergetische actie ter bevordering van DNA demethylatie door Vc en onderdrukken van DOVO DNA aangetoond Methylation door PD0325901. Bovendien toonde muis ES cellen grote morfologie onder het systeem van Vc/PD0325901 cultuur.

Om beter de provincie muis ES-cellen in het Vc/PD0325901 cultuur-systeem, zijn er enk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs vermelden geen potentiële belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (21435008 en 21327006 naar H.W.), en de strategische prioriteit Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDB14030200 naar H.W.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
fetal bovine serum Australia sourceCorning35-076-CVComponent van muis ES-cel medium
DMEM/high glucoseHycloneSH30022Component van muis ES-cel medium
LIFMilliporeESG1107Component van muis ES-cel medium
non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140050Component van muis ES-cel medium
sodium pyruvateGibco11360070Component van muis ES-cel medium
L-glutamineGibco25030081Component van muis ES-cel medium
penicillin streptomycin solutionGibco15140122Component van muis ES-cel medium
PBSSigmaP5493Cellen spoelen
trypsinHycloneSH30042Celdissociatie
gelatinSigma48722Dishes coating
PD0325901Stemolecule04-0006-10klein molecuul chemisch voor celkweek
CHIR99021Stemolecule04-0004klein molecuul chemisch voor celkweek
vitamin CSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd XW00508171klein molecuul chemisch voor celkweek
Ultra Bioscience water purification systemrPurelabUltraUltra water
DMSOSigmaD8418Celbevriezingsmedium
centrifugerEppendorf5427RDNA en eiwit extractie
protease inhibitor cocktailSigmaP8340Component van RIPA buffer
PMSF Protease InhibitorThermoFisher Scientific36978Component van RIPA buffer
DTTSigma43815Component van RIPA buffer
EGTASigmaE3889Component van RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit PromegaA1125Genoom DNA extractie
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificNanoDrop 2000Bepaling van DNA-concentratie
calf intestinal phosphataseNew England BiolabsM0290DNA spijsvertering
DNase INew England BiolabsM0303DNA spijsvertering
snake venom phosphodiesterase ISigmaP4506DNA spijsvertering
Nanosep 3K OmegaPallOD003C35filtratie van verteerd DNA
1290 UHPLC systemAgilent 1290UHPLC scheiding
G6410B triple quadrupole mass spectrometerAgilent G6410BMS/MS analyse
Zorbax Eclipse Plus C18 columnAgilent Zorbax Eclipse Pluskolom voor UHPLC scheiding
5-methylcytosineSolarbio Life SciencesSM8900 standaard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard)Toronto Research ChemicalsM295900standaard 5hmC
Prdm14 antibodybioworldBS7634Western blot analyse-primair antilichaam
Dnmt3a antibodybioworldBS6587Western blot analyse-primair antilichaam
Dnmt3b antibodyabcamab13604Western blot analyse-primair antilichaam
Dnmt3l antibodyabcamab3493Western blot analyse-primair antilichaam
Dnmt1 antibodyabcamab13537Western blot analyse-primair antilichaam
β-tubulin antibodybioworldBS1482MHWestern blot analyse-primair antilichaam
goat anti-rabbit IgGabcamab6721Western blot analyse-secundair antilichaam
goat anti-mouse IgGabcamab6789Western blot analyse-secundair antilichaam
TrizolInvitrogen15596-026RNA extractie
reverse transcription systemPromegaA3500RNA reverse transcriptie
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6001RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kitCells Biolabs, Inc.CBA-302alkalische fosfatasekleuring analyse
mouse ES cells: WT, 129 SvEvVerstrekt door Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)celstam van muis ES-cellen
microscopeZeissLSM510cellen observatie
GraphPad Prism 5.0GraphPad Prism Software Inc.5.0statistische analyse

Referenties

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156(2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171(2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194(2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

DNA-hypomethyleringbehandeling met vitamine CUHPLC-MS/MS-analysedetectie van 5-methylcytosineanalyse van 5-hydroxymethylcytosinePrdm14-expressieDnmt3b-suppressiecelkweekprotocol
Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.