De precieze evaluatie van pijn reactie in een neuropatische diermodel is cruciaal voor de pathofysiologie van pijn ziekten onderzoeken en ontwikkelen van nieuwe analgetica. Presenteren we een gevoelige en objectieve methode om te bepalen van de zintuiglijke functie van het knaagdier hind paw door een geautomatiseerde gait analysesysteem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geautomatiseerde ganganalyse in muizen met chronische vernauwing blessure
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De von Frey-test is een klassieke methode die wijd verbeid gebruikt is te onderzoeken van de zintuiglijke functie van neuropatische pijn dieren. Nochtans, heeft enkele nadelen zoals subjectieve gegevens en de eis van een geschoolde, ervaren experimentator. Tot op heden, een aantal wijzigingen hebben verbeterd de von Frey-methode, maar heeft nog een paar beperkingen. Recente rapporten hebben gesuggereerd dat ganganalyse meer nauwkeurige en objectieve gegevens van de neuropathische dieren produceert. Dit protocol laat zien hoe uit te voeren van de geautomatiseerde ganganalyse om te bepalen van de mate van neuropatische pijn in muizen. Na enkele dagen van acclimatisering mochten de muizen lopen vrij op de glazen vloer tot verlichting van voetafdrukken. Vervolgens, kwantificering van de voetafdrukken en gait werden uitgevoerd via videoclips met automatische analyse van diverse wandel parameters, zoals gebied van paw print, schommel tijd, hoek van paw, enz.
Het belangrijkste doel van deze studie is om te beschrijven van de methodologie van geautomatiseerde ganganalyse en kort vergelijken met gegevens uit de klassieke zintuiglijke test met von Frey gloeidraad.
Inleiding
Pathologische veranderingen van zenuwstelsel veroorzaakt door trauma, metabole stoornissen, ontsteking, infectie, ischemie, of auto-immune ziekte af en toe leiden tot neuropathische pijn, die is gedefinieerd als een pijn ontstaan als een rechtstreeks gevolg van een letsel of ziekte gevolgen voor de somatosensorische systeem1. Neuropatische pijn is meestal ondraaglijk en helaas, conventionele analgetica over het algemeen niet produceren voldoende pijn verlichting2. Een belangrijk kenmerk van neuropatische pijn bevat spontane en stimulatie-opgeroepen (dat wil zeggen, allodynia en hyperalgesia) pijn. Allodynia is een Nociceptieve reactie die op normaal niet-pijnlijke stimuli, zoals lichte aanraking of warme stimulatie optreedt. Hyperalgesia geeft een verbeterde pijn reactie op schadelijke stimuli van mechanische en/of thermische3. Hoewel deze twee symptomen zowel kritisch afbreuk doen aan de levenskwaliteit van de patiënt, is mechanische allodynia opgeroepen door zachte tactiele stimulatie de meest verzwarende symptoom omdat zachte contact moeilijk is te voorkomen in het dagelijks leven.
Om te onderzoeken het onderliggende mechanisme en nieuwe analgetica voor de behandeling van neuropatische pijn, is de nauwkeurige meting van de respons van de pijn essentieel. Talrijke neuropatische pijn dierlijke modellen hebben ontwikkeld Nociceptieve reacties op de hind paw gebied vanwege haar hoge toegankelijkheid4,5,6,7. Dus, de meeste pijn reactie evaluaties zijn uitgevoerd op de plantaire of dorsale oppervlak van de achterste poot door mechanische stimuli met behulp van speciale instrumenten, zoals von Frey filamenten toe te passen. Een van de meest gebruikte methode is de up en down, methode beschreven door Dixon8 en de latere gemodificeerde versies9,10. Echter zeer bekwaam, ervaren onderzoekers zijn vereist voor het uitvoeren van de test von Frey en de resultaten kunnen subjectief.
Het systeem van de analyse van de geautomatiseerde gang kan onderzoeken neurologische en neuromusculaire aandoeningen door het meten van de diverse parameters van het lopen in de vrij bewegende knaagdieren. In een verscheidenheid van zenuw schade diermodellen, kunnen de mate van Nociceptie en het antinociceptive effect van verschillende behandelingen worden geëvalueerd zonder toevoeging van een pijn stimulatie11,12,13, 14. deze analysesysteem kan detecteren gait van statische en dynamische parameters, zoals: afdrukbereik (het gebied van de volledige paw afdruk die met de vloer contact) paw, paw intensiteit (de gemiddelde intensiteit van de contactmogelijkheden paw-gebied), paslengte (de de afstand tussen opeenvolgende plaatsingen voor de dezelfde paw), houding fase (de duur van de grond contact voor een enkele hind poot), stap sequentie (de volgorde waarin de vier paws zijn geplaatst op de verdieping), swing (de duur van de swing-fase) en snelheid (berekend swing van de paslengte en duur swing en uitgedrukt in pixels per seconde). Deze paper toont de toepassing een analysesysteem en biedt een korte vergelijking van gegevens met de test van de von Frey met chronische vernauwing letsel (CCI) neuropatische muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de ethische richtsnoeren van de internationale vereniging voor de studie van pijn en door de institutionele Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd op de Chungnam National University ( Daejeon, Zuid-Korea).
1. inductie van CCI op nervus ischiadicus
- huis mannelijke ICR muizen met een gewicht van 20-25 g onder een 12u licht/donker cyclus bij gecontroleerde kamertemperatuur (behouden bij 20-25 ° C) en luchtvochtigheid (40-60%), met gratis toegang tot voedsel en water. Een periode van de acclimatisering voor muizen in de dierenverzorgers kamer van ten minste 1 week voor de operatie toestaan.
- Tijdens huisvesting, observeren het uiterlijk en gedrag van de muizen en gebruik geen muizen abnormale motorische activiteit tonen.
Opmerking: Één dag voorafgaand aan de operatie CCI, meten de mechanische gevoeligheid van de achterste poot door von Frey filamenten toe te passen en de geautomatiseerde ganganalyse voor normale basislijnwaarden uit te voeren. Wijs de muizen willekeurig aan controle en experimentele groepen.
- Tijdens huisvesting, observeren het uiterlijk en gedrag van de muizen en gebruik geen muizen abnormale motorische activiteit tonen.
- Anesthetize op de dag van de operatie, de muizen door het injecteren van 2,2,2-tribromoethanol (250 mg/kg, intraperitoneaal (IP)).
Opmerking: Draag persoonlijke beschermingsmiddelen zoals chirurgenjas, handschoenen en masker.- Weeg 2,5 g van 2,2,2-tribromoethanol en voeg 2-methyl-2-buthanol aan het eindvolume van 5 mL. Bewaar deze oplossing weg van licht (bijvoorbeeld gebruik van een donkere container of in folie wikkelen).
- Toestaan reagentia te ontbinden volledig door verwarming bij 40 ° C en roeren gedurende 10-30 min.
- Voeg gedistilleerd water aan het uiteindelijke volume van 200 mL en roer tot goed gemengd.
- Slaan aliquots bij 4 ° C en in het donker te houden. Na twee weken, de verdoving moet worden vervangen door nieuwe aliquots.
- Injecteren een volume van 20 µL per 1 g lichaamsgewicht. Bijvoorbeeld, als het lichaamsgewicht van de muis 25 g is, geven 500 µL van oplossing. Deze verdoving duurt typisch 1 h.
Opmerking: Deze oplossing zal worden giftig bij blootstelling aan licht en/of warmte dus wees voorzichtig om te voorkomen dat blootstelling aan licht en warmte. Een IP-injectie route wordt ten zeerste aanbevolen.
- Wanneer de muis in diepe anesthesie valt, plaatst u deze op de operatietafel met de dorsale zijde omhoog (d.w.z., liggend) en steriliseren van de buitenste halverwege dij gebied van de rechterkant met een 70% alcohol doekje.
Opmerking: Diepe verdoving bevestigen door het controleren van het gebrek aan respons te knijpen of druk van de stimulans op de achterste poten of staart. - De CCI op de juiste ischiadicus zenuw van de muis bewegen.
- Maken van een sneetje op de huid rond het midden dij gebied van 1.0-1.5 cm lengte met een scalpel mes.
- Bot ontleden de bovenbeenspieren met de micro-mosquito hemostat bloot van de nervus ischiadicus.
- De nervus ischiadicus blootgestelde ligate 3 keer met 1.0-1.5 mm intervallen met behulp van een 4-0 chromic catgut hechtdraad.
Opmerking: Zorg losse ligations door koppelverkoop van de nervus ischiadicus tot milde schudden wordt weergegeven op de ipsilaterale hind poot. Kreeg de sham-groep van muizen de dezelfde chirurgische opening onder vergelijkbare omstandigheden behalve zonder zenuw afbinding.
- Sluit de chirurgische opening met 3-4 eenvoudige onderbroken hechtingen met 5-0 zijde en steriliseren met Povidon jodium voor desinfectie van de buitenste oppervlakte van chirurgie.
- Na de operatie, plaatst u de muisaanwijzer in een schone kooi op een verwarming pad. Wanneer dieren zijn hersteld van anesthesie, terugsturen naar hun thuis kooi.
Opmerking: In deze studie worden antibiotica werden niet gebruikt. De CCI + GBP groep ontvangen IP-gabapentine (GBP) bij een dosis van 50 mg/kg eenmaal daags als positieve controle.
2. Meting van de mechanische Allodynia (von Frey Test)
Opmerking: de frequentie van de reactie van de terugtrekking op de mechanische stimuli beoordelen met behulp van 1 g van von Frey gloeidraad op de plantaire oppervlak van de ipsilaterale hind paw.
- Op elke dag van de test, muizen brengen de gedrags test kamer en acclimatiseren van de muizen in hun eigen huis kooi voor ten minste 30 minuten vóór de test
Opmerking: Draag persoonlijke beschermingsmiddelen zoals chirurgenjas, handschoenen en masker. - Zet de muis in een transparant acryl box op de metalen gaas vloer en de muis voor 30 min. acclimatiseren
- 1 g van von Frey gloeidraad zachtjes op de plantaire oppervlak van de achterste poot van toepassing totdat de gloeidraad knik.
- Toepassen gloeidraad stimulatie naar de ipsilaterale hind paw 10 keer met ten minste 10 s intervallen en het resultaat opnemen.
Opmerking: In deze studie, het aantal paw terugtrekking reacties van 10 proeven worden weergegeven als percentage van paw terugtrekking frequentie (PWF, %). De von Frey-test werd uitgevoerd om de twee dagen na de operatie van het CCI.
3. Uitvoeren van geautomatiseerde ganganalyse
Opmerking: het systeem van de analyse van de gang visualiseert elke poot afdrukken terwijl het dier loopt en automatisch verschillende parameters van de gang analyseert, zulke zoals afdrukken, paw paw intensiteit, paslengte, houding fase, stap sequentie, schommel, schommel snelheid, etc. In deze studie, toonden we paw afdrukbereik en één houding na het omzetten van de gegevens in het percentage wijzigen tussen contralaterale links versus ipsilaterale rechts hind poot. Dus, is een resultaat van 50% geeft aan dat de grootte van de poot afdrukken en de duur van paw gebied in contact met de vloer, tussen de linker- en rechterkant hetzelfde zijn. Bovendien, lagere gegevenswaarden bijna 0% aangeven dat zowel de grootte en de duur van het contact in de ipsilaterale hind paw in vergelijking met de contralaterale zijde zijn gedaald (zie paneel B van Figuur 2 en Figuur 3).
- Voor acclimatisatie, blijven de muizen binnen het analyseapparaat gait voor 10 min één keer per dag vanaf 5 dagen vóór de operatie CCI.
Opmerking: Gait analyse test met inbegrip van de acclimatisatie moet worden uitgevoerd in het donker. - Brengen de muizen in de test kamer voor ganganalyse en acclimatiseren in hun kooi voor ten minste 30 minuten vóór de test
- Instellen op het tabblad instellingen van het programmamenu, de " loopbrug lengte " aan 30 cm, en de " maximale duur uitvoeren " tot en met 5 s en de " maximale variatie uitvoeren " tot 50%.
- Selecteer een geregistreerde camera van de ' setup ' tabblad van de ' programma ' menu.
- Selecteer " overname open " van de ' verwerven ' tabblad van de ' programma ' menu.
- Na het statusbericht, klikt u op de ' uitlijnen achtergrond ' knop om een foto van de achtergrond van de loopbrug leeg (dat wil zeggen, lege).
- Klik op de ' beginnen met overname ' knop en plaats een muis op de loopbrug; de opname begint automatisch volgens de bewegingen van de muis.
Opmerking: Als de muis duidelijk over de loopbrug loopt, het programma automatisch classificeert deze bewegen zoals " Compliant uitgevoerd " met een groen pictogram. Als de software niet detecteren van de voetdruk, de experimentator ziet een rood pictogram en de opname moet herhalen. Ten minste vijf succesvolle compatibele runs zijn nodig voor analyse. - Na de test, selecteer ' classificeren punten ' via het tabblad ophaal van de ' programma ' menu.
- Selecteer de pistes voor analyse en klik op de ' automatisch classificeren ' knop.
Opmerking: Na de classificatie, alle statistische parameters worden automatisch opgeslagen en de experimentator vindt de resultaten door te klikken op " weergave uitgevoerd statistieken " in het menu analyseren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wij hebben de von Frey-test uitgevoerd en geautomatiseerde ganganalyse bij CCI muizen tot 10 dagen na de operatie van het CCI. Herhaalde maatregelen voor twee-weg variantieanalyse (ANOVA) bepaalt de algemene gevolgen voor statistische analyse en Dunnett van post-hoc analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de p-waarde tussen de experimentele groepen.
De resultaten die worden weergegeven in Figuur 1...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Meting van de mechanische allodynia met behulp van von Frey filamenten is momenteel de meest gebruikte methode van pijn diermodellen om aan te tonen van tactiele overgevoeligheid. Zoals dierlijke modellen voor neuropathische pijn hebben voortgezet worden ontwikkeld, de methodologie van de evaluatie voor de zintuiglijke functie geweest ook verbeterde8,9,10,15. In die verslagen, is er gesuggereer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door Chungnam nationale universiteit, Korea Instituut voor oosterse geneeskunde (KIOM) en een subsidie van de Korea Health Technology R & D Project via de Korea gezondheid industrie Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het ministerie van volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (verlenen van nummer: HI15C0007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.9% Saline | JW Pharmaceutical | N/A | Drager voor geneesmiddelen |
| 1ml-sering | BD Plastipak | 300013 | Injectieapparaat |
| 2, 2, 2-tribromoethanol (97% zuiverheid) | Sigma | T48402 | Anestheticum |
| 2-methyl-2-buthanol (99% zuiverheid) | Sigma | 152463 | Oplosmiddel voor 2, 2, 2-tribromoethanol |
| Catwalk Geautomatiseerd ganganalysesysteem | Noldus | N/A | Automatische analysesoftware van dierlijke gang |
| Chromic catgut (4-0 dikte) | AILEE | C442 | Ligatuur om chronische constriktie-letsel aan de nervus ischiadicus te maken |
| Gabapentin | Sigma | Y0001280 | Analgesicum, gebruikt als positieve controlegeneesmiddel in dit onderzoek |
| Graefe-tang | F.S.T | 11051-10 | Chirurgisch instrument |
| Verwarmingskussen | DAESHIN ELECTRONICS | M-303AT | Regulering van lichaamstemperatuur |
| ICR-muis | Samtaco | N/A | Experimenteel dier |
| Mersilk (3-0 dikte) | ETHICON | W598H | Hechtdraad voor chirurgische sluiting van de huid |
| Micro-Mosquito | F.S.T | 13010-12 | Chirurgisch instrument |
| Micro-schaar | F.S.T | 14090-09 | Chirurgisch instrument |
| Nadelhouder | F.S.T | 12002-12 | Chirurgisch instrument |
| Povidonjod | Firson | N/A | Ontsmettingsmiddel om infectie na een operatie te voorkomen |
| Mesje | F.S.T | 10010-00 (#10) | Chirurgisch instrument om een incisie te maken |
| Meshandgreep | F.S.T | 10003-12 (#3) | Chirurgisch instrument om een incisie te maken |
| Von-Frey-filamenten | North Coast | NC12775-99 | Meetapparaat om sensorische functie voor mechanische stimulatie te testen |
Referenties
- Loeser, J. D., Treede, R. D. The Kyoto protocol of IASP Basic Pain Terminology. Pain. 137 (3), 473-477 (2008).
- Colloca, L., et al. Neuropathic pain. Nat Rev Dis Primers. 3, 17002(2017).
- Vranken, J. H. Mechanisms and treatment of neuropathic pain. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 9 (1), 71-78 (2009).
- DeLeo, J. A., et al. Characterization of a neuropathic pain model: sciatic cryoneurolysis in the rat. Pain. 56 (1), 9-16 (1994).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43 (2), 205-218 (1990).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 20, 441-462 (1980).
- Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Mol Pain. 10, 26(2014).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. J Neurosci Methods. , (2017).
- Kang, D. W., et al. Antinociceptive Profile of Levo-tetrahydropalmatine in Acute and Chronic Pain Mice Models: Role of spinal sigma-1 receptor. Sci Rep. 6, 37850(2016).
- Huehnchen, P., Boehmerle, W., Endres, M. Assessment of paclitaxel induced sensory polyneuropathy with "Catwalk" automated gait analysis in mice. PLoS One. 8 (10), e76772(2013).
- Vrinten, D. H., Hamers, F. F. 'CatWalk' automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
- Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. J Vis Exp. (82), e51212(2013).
- Ferland, C. E., Laverty, S., Beaudry, F., Vachon, P. Gait analysis and pain response of two rodent models of osteoarthritis. Pharmacol Biochem Behav. 97 (3), 603-610 (2011).
- Mogil, J. S., et al. Hypolocomotion, asymmetrically directed behaviors (licking, lifting, flinching, and shaking) and dynamic weight bearing (gait) changes are not measures of neuropathic pain in mice. Mol Pain. 6, 34(2010).
- Ferreira-Gomes, J., Adaes, S., Castro-Lopes, J. M. Assessment of movement-evoked pain in osteoarthritis by the knee-bend and CatWalk tests: a clinically relevant study. J Pain. 9 (10), 945-954 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
