Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

6.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56411

⸱

9 november 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Samenvatting

Chemotaxis, of de migratie van een verloop van een chemoattractant, is het best te begrijpen wijze van gestuurde migratie. Studies met behulp van sociale amoeba Dictyostelium discoideum bleek dat een complex signaaltransductie netwerk van parallelle trajecten de respons op chemoattractants versterkt, en leidt tot vooringenomen actine polymerisatie en uitsteeksel van een pseudopod in de richting van een verloop. Moleculaire mechanismen rijden van andere soorten gestuurde migratie, bijvoorbeeld als gevolg van blootstelling aan het schuintrekken stroom of elektrische velden, zijn daarentegen niet bekend. Vele regulatoren van chemotaxis vertonen lokalisatie bij de regelafstand of de achterblijvende hoek van een cel, migreren, evenals tijdelijke wijzigingen worden weergegeven in de lokalisatie of activering na globale stimulatie met een chemoattractant. Om te begrijpen van de moleculaire mechanismen van andere soorten gestuurde migratie ontwikkelden we een methode waarmee onderzoek van cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie op basis van korte (2-5 s) blootstelling aan stroom schuintrekken. Deze stimulatie kan geleverd worden in een kanaal terwijl imaging cellen uiten fluorescently-geëtiketteerden biosensoren te onderzoeken van de individuele cel gedrag. Bovendien kan celpopulatie worden gestimuleerd in een plaat, lysed, en immunoblotted met behulp van antilichamen die actieve versies van proteïnen van belang herkent. Door het combineren van beide tests, kan men een breed scala van moleculen geactiveerd door veranderingen in subcellular localisatie en/of fosforylatie onderzoeken. Using zulks werkwijze vastbesloten wij dat acute mechanische stimulatie activering van de Chemotactische signaal transductie en actine cytoskelet netwerken activeert. De mogelijkheid te onderzoeken van cellulaire reacties op acute mechanische stimulatie is belangrijk voor het begrijpen van de initiatiefnemende gebeurtenissen nodig zijn voor de beweeglijkheid van de stroom-geïnduceerde schuintrekken. Deze aanpak biedt een instrument voor de studie van de Chemotactische signaaltransductie netwerk zonder de storende invloed van de chemoattractant receptor.

Inleiding

Migratie van eukaryotische cellen is bevooroordeeld door middel van diverse chemische en fysische signalen in het milieu, met inbegrip van gradiënten van oplosbare of substraat-gebonden chemoattractants, variabele stijfheid van de substraten, elektrische velden of schuintrekken stroom. Hoewel er al veel vooruitgang in ons begrip van de moleculaire mechanismen chemotaxis rijden, minder is gekend over andere soorten gestuurde migratie en hoe deze uiteenlopende signalen zijn geïntegreerd op cellulair niveau tot een uniforme trekkende reactie.

Regie migratie naar een toenemende concentratie van een chemoattractant omvat drie gedrags componenten: beweeglijkheid, directionele sensing en polariteit1. Motility verwijst naar willekeurige verkeer van cellen bereikt door pseudopod uitsteeksel. Directionele sensing is de mogelijkheid van een cel om de oorzaak van een chemoattractant worden opgespoord, die kan optreden zelfs in cellen geïmmobiliseerd. Polariteit verwijst naar de meer stabiele asymmetrische distributie van intracellulaire componenten tussen de leading en lagging rand van een cel, die tot verhoogde persistentie in beweging leidt.

Cellulaire reactie op een chemoattractant hangt af van de activiteit van vier conceptueel gedefinieerde regulerende netwerken: receptor / G eiwit, signaaltransductie, actine cytoskelet en polariteit1. Chemoattractant binding aan de G eiwit-gekoppelde receptor stuurt het signaal via heterotrimeric G eiwitten α en βγ op het stroomafwaarts signaaltransductie netwerk, dat het signaal directionele versterkt. Meerdere trajecten binnen het netwerk signaaltransductie handelen in parallel en worden meegenomen bij het actine cytoskelet netwerk aan bias actine polymerisatie, en daaruit voortvloeiende pseudopod uitsteeksel, in de richting van het verloop. Belangrijke regulatoren van chemotaxis behoren tot Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-kinase (PI3K) fosfatase en Tenzin homolog (PTEN) en guanylyl cyclase. Feedbackmechanismen binnen het netwerk signaaltransductie en tussen de signaaltransductie en actine cytoskelet netwerken verder versterken het antwoord. Ten slotte, het slecht gedefinieerde polariteit netwerk ontvangt input van het cytoskelet actine, en verder vooroordelen het signaaltransductie netwerk ter bevordering van permanente migratie in de richting van het verloop.

Veel van onze mechanistische begrip van chemotaxis werd mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van fluorescently-tagged biosensoren voor verschillende onderdelen van de regulerende netwerken. Vele chemotaxis toezichthouders hebben een asymmetrische verdeling van de regelgevende molecuul zelf of haar activiteit. Bijvoorbeeld, biosensoren die herkent geactiveerd versies van kleine GTPases Ras en Rap1-Ras-bindende domeinen van Raf1 (hierna aangeduid als RBD hier) en RalGDS, respectievelijk – lokaliseren naar de voorrand van een chemotaxing cel2,3. Evenzo PI3K en haar product phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), erkend door een pleckstrin-homologie (PH) domein, Toon ook lokalisatie aan de voorzijde van een cel4,5. In tegenstelling, een 3-fosfatase-PTEN, die worden omgezet in PIP3 terug phosphatidylinositol (4,5)-difosfaat, lokaliseert aan de rand van de achterstand van de cel-6. Nog belangrijker is, is deze biosensoren wijzigen hun lokalisatie in reactie op de wereldwijde stimulatie met een chemoattractant. Leading edge markers, die cytosolische of op de toppen van de uitsteeksels in een cel rusten, relocalize naar de cortex, overwegende dat achtergebleven rand markeringen, die corticale lokalisatie en zijn afwezig vanaf de toppen van de uitsteeksels in een cel rusten, worden cytosolische na stimulatie. Analyse van biosensor distributie in reactie op de wereldwijde stimulatie met een chemoattractant minimaliseert de bijdrage van de motiliteit en polariteit, die vaak de opmerkingen verwarren. Globale of uniforme stimulatie van een celsuspensie met een chemoattractant wordt ook gebruikt als een instrument voor het beoordelen van wijzigingen voor de gehele bevolking in eiwit activering, vaak gedetecteerd door proteïne fosforylatie7,8,9 . Deze biochemische bepaling wordt voornamelijk gebruikt voor temporele informatie, terwijl microscopie wordt gebruikt om zowel temporele en ruimtelijke informatie verzamelen over het gedrag van verschillende onderdelen van de regulerende netwerken.

Het signaaltransductie netwerk omvat functies van een prikkelbaar systeem10,11. Reacties op supra-drempel Chemotactische stimuli zijn "all-or-none" en vuurvaste punten weergegeven. Reacties zijn ook stochastically geactiveerd en oscillerende gedrag kunnen tonen. Signaaltransductie gebeurtenissen zijn gelokaliseerd aan regio's van de cortex die als golven12,13,14,15 verspreiden. Voorste, terug, markeringen worden gerekruteerd voor of distantiëren van, de actieve zones van het teeltmateriaal golven. Als gevolg van de achterstand van de actieve zone vuurvaste regio vernietigen de tegengesteld gerichte golven als ze elkaar ontmoeten. Het teeltmateriaal signaaltransductie golven ten grondslag liggen aan de cellulaire uitsteeksels die cel migratie10bemiddelen.

Veel van de bovengenoemde informatie over chemotaxis kwam van de studies op de sociale Amoebe Dictyostelium discoideum, hoewel soortgelijke regulerende mechanismen zijn ook van toepassing op de neutrofielen en andere zoogdieren cel typen16 . Dictyostelium is een reeds lang gevestigde modelorganisme dat een robuuste Chemotactische reactie tijdens hongersnood, heeft wanneer duizenden afzonderlijke cellen naar een aggregatie midden migreren, uiteindelijk de vorming van een meercellig fruiting body met sporen. Chemotaxis is ook essentieel in de fase van de eencellige groei van dit organisme voor het lokaliseren van bacteriële voedselbronnen. Belangrijker, is migratie van afzonderlijke Dictyostelium cellen opvallend vergelijkbaar met de migratie van zoogdieren neutrofielen of metastatische kankercellen, die allemaal zeer snelle Wortelpotigen-type migratie ondergaan. In feite, worden zowel de algemene topologie van de regulerende netwerken, evenals veel van de individuele signaaltransductie trajecten die betrokken zijn bij chemotaxis bewaard tussen Dictyostelium en zoogdieren leukocyten17. Bovendien andere cellen, zoals fibroblasten, receptor tyrosine kinases (RTK) gebruiken in plaats van GPCRs; RTKs kunnen echter voeden in soortgelijke netwerken.

In tegenstelling tot chemotaxis ontbreekt grondig inzicht in de signalering mechanismen die verschillende andere vervoerswijzen gestuurde migratie rijden. Ook naar cellen migreren in een chemoattractant verloop verscheidene studies hebben gemeld activering en/of de lokalisatie van typische voorrand markers, met inbegrip van actine polymerisatie, PIP3 en/of extracellulaire signaal-gereglementeerde kinase (ERK) 1/2, op de voorkant van cellen ondergaan regisseerde migratie in reactie op stroom of veranderingen in elektrische velden18,19,20,21schuintrekken. Echter, in deze studies continue blootstelling aan de prikkel ook resulteerde in cel migratie, bloot de vraag, bijvoorbeeld, de toonaangevende markers lokaliseren speciaal in reactie op een prikkel, of als ze gewoon lokaliseren op de voorrand vanwege toegenomen aantal pseudopods aan de voorzijde van een migreren cel.

We ontwikkeld testen die ons toelaten te observeren de reactie van cellen op acute mechanische perturbation geleverd als schuintrekken stroom zowel op het bevolkingsniveau en als afzonderlijke cellen22. Vergelijkbaar met de globale stimulatie met een chemoattractant, acute stimulation met schuintrekken stroom maakt de studie van een cellulaire reactie op een mechanische prikkel zonder de storende bijdrage van beweeglijkheid of polariteit. Deze biochemische en microscopische tests te combineren met genetische of farmacologische verstoringen ons toelaat om te leren over hoe mechanische stimuli worden waargenomen en verzonden. Bovendien biedt deze aanpak ook een nieuwe methode voor te tikken in het systeem stroomafwaarts van de chemoattractant receptor in het ontbreken van een chemoattractant, waardoor het isoleren van de netwerken van de signaal transductie en actine de cytoskelet van de receptor/G eiwit netwerk.

Met behulp van de technieken die hieronder we onlangs aangetoond dat acute shear stress leidt tot activatie van meerdere onderdelen van de Chemotactische signaal transductie en actine cytoskelet netwerken22. Door de acute mechanische stimulus toe te passen op verschillende tijdstippen, we laten zien dat ook aan chemoattractants, reactie op mechanische stimuli ook kenmerken van een prikkelbaar systeem vertoont, met inbegrip van het all-or-none gedrag van de reactie onder verzadigen van de voorwaarden en de aanwezigheid van een refractaire periode. Tot slot, door een combinatie van mechanische en chemische stimulatie we bleek dat de twee prikkels aandeel signaal transductie en actine cytoskelet netwerken, waardoor waarschijnlijk voor de integratie van meerdere stimuli bias cel migratie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van de oplossingen

  1. bereiden HL-5 media met behulp van de volgende handelingen uit: 10 g/L dextrose, 10 g/L proteose pepton, gistextract 5 g/L, 0.965 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 g/L KH 2 PO 4, en, tenzij anders aangegeven, 0,03 g/L streptomycine in gedeïoniseerd water. Autoclaaf het medium en winkel bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Als gevolg van verschillen tussen proteose pepton en gist extract verworven van verschillende leveranciers, alsmede tussen individuele partijen, pH van de media dienen te worden aangepast aan de typische aantal 6.4 tot en met 6.7.
  2. Bereiden SM platen met behulp van de volgende handelingen uit: 10 g/L dextrose, pepton 10 g/L, 1 g/L gist extract, 2,31 g/L KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 en 20 g/L agar in gedeïoniseerd water. Autoclaaf, cool, en giet 30 mL van de oplossing van de agar per 10-cm petrischaal. Zodra de agar stolt, slaan de platen bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  3. Voorbereiden 10 x fosfaat Buffer (PB) met behulp van 13.4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O en 6,8 g/L KH 2 PO 4 in gedeïoniseerd water. De 10 x voorraad bewaren bij 4 ° C. Dilute tot 1 x met gedeïoniseerd water voor gebruik.
  4. Bereiden DB Buffer door haar aan te vullen 1 X PB met 2 mM MgSO 4 en 0,2 mM CaCl 2.
  5. Voorbereiden 100 mM cafeïne in gedeïoniseerd water. Bewaren bij − 20 ° C.
  6. Bereiden 100 mM cAMP stockoplossing door ontbinding van cAMP natrium zout monohydraat in gedeïoniseerd water. Bereiden een 1 mM werken voorraad in gedeïoniseerd water. Opslaan van beide stamoplossingen op − 20 ° C. voorbereiden cAMP eindoplossing op de gewenste concentratie in DB op de dag van het experiment.
    Opmerking: Voorraad oplossingen kunnen bevriezen-ontdooid een paar keer.
  7. Voorbereiden 25 mM foliumzuur in 1 x PB. Voeg een paar druppels 1 N NaOH tot het poeder volledig oplost. Bewaren bij − 20 ° C.
  8. Bereiden 3 x monster buffer met behulp van het volgende: 187,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% (m/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS), 30% glycerol, 126 mM dithiothreitol en 0,03% (m/v) bromophenol blauw. Aliquot en winkel op − 20 ° C.
    1. Prior te gebruiken, ontdooien in een waterbad 37 ° C en gaat u verder met het bereiden van monster buffer met protease en phosphatase inhibitors door verdunnen 3 x monster buffer tot 1 x, en het toevoegen van 50 mM NaF, 2 mM nb 3 VO 4, 25 mM natrium pyrofosfaat en 1 x volledige EDTA-vrije proteaseinhibitor cocktail in gedeïoniseerd water. Voeg de remmers onmiddellijk voordat de procedure in stappen 3.1.2-3.1.3.
  9. 5 mM Latrunculin A oplossing in DMSO bereiden. Aliquot en winkel op − 20 ° C.

2. Voorbereiding van D. discoideum cellen

Opmerking: D. discoideum cellen in HL-5 media te handhaven hetzij in weefselkweek platen of een schorsing van de cultuur zoals eerder beschreven 23. Indien nodig, transformatie cellen met fluorescently-geëtiketteerden biosensoren volgens standaard electroporation protocollen 24. Verschillende stammen van D. discoideum, evenals plasmiden codering biosensoren of andere genen van belang kunnen worden verkregen bij de Dicty voorraad Center (dictybase.org).

  1. Groei en verzameling cellen van de vegetatieve D. discoideum
    1. voor analyse van vegetatieve cellen, groeien cellen in aanwezigheid van bacteriën te verminderen van het aantal macropinosomes, die gewoonlijk worden waargenomen in axenically-gekweekte cellen 25.
      1. Voorbereiden een cultuur van Klebsiella aerogenes door het enten van een klein aantal cellen uit een voorraad van glycerol of uit een vorige cultuur in de gewenste omvang van de HL-5 medium zonder antibiotica. Incubeer bacteriecultuur op een roteerschudapparaat op 200 rpm (0,42 x-g) bij kamertemperatuur (20-22 ° C) voor 16-18 h.
        Opmerking: De K. aerogenes stam die hier gebruikt is niet-pathogene (Zie de Tabel van de materialen).
    2. D. discoideum verzamelen in de fase van de exponentiële groei van weefselkweek platen of van een schorsing cultuur, en de cellen met behulp van een hemocytometer volgens fabrikant rekenen ' s instructies. 1 x 10 5 D. discoideum cellen met 260 µL K. aerogenes vering op een SM-plaat verspreid. Zet de plaat opwaartse beneden de volgende dag. Groeien van cellen bij kamertemperatuur totdat de D. discoideum cellen beginnen het bacteriële gazon wissen maar voordat ze beginnen met aggregeren (~ 36-48 h).
    3. Collect D. discoideum cellen in 5 mL DB buffer door hen te schrapen met een glas strooier. Cellen overbrengen in een polypropyleen tube van 50 mL. Spoel de plaat met een andere 5 mL DB buffer en zwembad met de oorspronkelijke schorsing. Vullen van de buis tot 50 mL met DB buffer.
    4. De schorsing van de D. discoideum bij 360 x g centrifuge voor 3-4 min. gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 mL DB Buffer. Herhaal de stappen wassen totdat het supernatans is duidelijk (~ 3 tot en met 4 wasbeurten). Resuspendeer de pellet van de laatste cel in de buffer van de DB aan een definitieve dichtheid van ~ 5 x 10 6 cellen/mL.
  2. Voorbereiding van aggregatie-cellen van de bevoegde D. discoideum
    1. ontwikkelen D. discoideum cellen door 1 h verhongering gevolgd door 4 h van honger en pulserende met 50 nM kamp elke 6 min volgens norm protocollen 23.
    2. Na ontwikkeling, het meten van het uiteindelijke volume van de celsuspensie.
    3. Op basis van het aantal cellen die worden gebruikt voor ontwikkeling, berekenen celdichtheid van de definitieve opschorting.
      Opmerking: Als kamp wordt geleverd in 100 volume-eenheden µL elke 6 min, cel volume verhoogt met 1 mL voor ieder uur van cAMP pulserende. Dus, voor de standaardvoorwaarden 8 x 10 7 cuvetten in DB 4 mL, na 4 uur van ontwikkeling het eindvolume is 7 mL en de definitieve celdichtheid is ~1.1 x 10 7 cellen/mL.

3. Biochemische analyse van cel reactie op mechanische of chemische stimulatie

  1. Acute mechanische stimulatie van cellen gevolgd door Lysis van de cel
    1. plaat 2 x 10 6 aggregatie-bevoegde cellen (uit stap 2.2) na 4 uur van ontwikkeling in 35-mm gerechten met 2 mL DB. De cellen te voegen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur toestaan. Wassen cellen tweemaal met 1 mL DB. Incubeer de cellen in DB met 2.5 mM cafeïne voor 30 min zonder enige verstoring van de platen.
      Opmerking: Als cellen worden behandeld met een farmacologische remmer moeten, gewenste concentratie van remmer of toevoegen dezelfde hoeveelheid geschikt vehiculum tijdens basalation met cafeïne.
    2. Aanbrengen mechanische stimulatie, plaatst u de plaat (één tegelijk) op een roteerschudapparaat en onmiddellijk het inschakelen bij 150 rpm (0,24 x g) voor 5 s.
      Opmerking: De plaat kan ook handmatig gestimuleerd worden door beweging op een cross-wise wijze voor ongeveer 5 s.
    3. Aspirate de buffer op de aangegeven tijden na het begin van de stimulatie. Onmiddellijk lyse de cellen door toevoeging van 100 µL monster buffer met protease en phosphatase inhibitors.
    4. Plaats van de plaat op ijs, en de lysate verzamelen in een 1.5-mL-buis. Voor ' tijd 0 ', lyse de cellen zonder schudden. De buizen overbrengen in een blok warmte 95 ° C gedurende 10 minuten direct na lysis. Doorgaan met immunoblotting of slaan lysates bij -20 ° C.
  2. Stimulatie van cellen met een Chemoattractant
    1. Basalate aggregatie-bevoegde cellen na 4 uur van ontwikkeling door hen snel schudden in het bijzijn van 5 mM cafeïne 200 rpm (0,42 x g) op een roteerschudapparaat gedurende 30 minuten.
      1. Centrifuge de celsuspensie op 360 x g voor 3-4 min. gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 mL ijskoud DB Buffer. Herhaal de stap wassen.
    2. Resuspendeer de pellet van de laatste cel in ijskoude DB buffer met een definitieve dichtheid van 4 x 10 7 cellen/mL op basis van de oorspronkelijke cel nummer gebruikt voor de ontwikkeling van de cellen (zie stap 2.2). Houden van de celsuspensie op ijs voorafgaand aan stimulatie.
      1. Pipet 50 µL van 10 µM kamp of het voertuig in een polystyreen beker geplaatst op een roteerschudapparaat.
    3. Om te stimuleren van de cellen, voeg 450 µL van de ijskoude celsuspensie in de dezelfde beker en onmiddellijk inschakelen in het roteerapparaat bij 200 rpm (0,42 x g). Op verschillende momenten na het begin van de stimulatie (bijvoorbeeld 10, 30, 45, 60, 120 s), kort stoppen de shaker nemen 50 µL aliquots van celsuspensie en lyse de cellen toevoegen door deze naar 1,5 mL tubes met 25 µL 3 X monster buffer.
      1. Voor ' tijd 0 ', gebruikt de cellen uit de ongestimuleerde ijskoude celsuspensie.
        Opmerking: De eindtemperatuur van de celsuspensie tijdens stimulatie is ~ 9 ° C 26. Onder deze omstandigheden de piek reactie iets later plaatsvindt dan de piek voor stimulatie uitgevoerd bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld, chemoattractant stimulatie van het aanhangend cellen op de Microscoop of mechanische stimulatie van het aanhangend cellen).
    4. De buizen overbrengen in een blok warmte 95 ° C gedurende 10 minuten direct na lysis. Doorgaan met immunoblotting of slaan lysates bij -20 ° C.
  3. Analyse van de reactie van de cel door Immunoblotting
    1. lysates (vanaf stappen 3.1.3 of 3.2.4) draaien op een 4-15% Tris-HCl polyacrylamidegel, overbrengen naar een Polyvinylideenfluoride fluoride membraan, blok en immunoblot met phospho-PKC Ζ Thr410 (voor het opsporen van phospho-PKBR1 en phospho-PKBA). Het signaal te detecteren door incubatie met horseradish peroxidase-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam, gevolgd door Chemoluminescentie met behulp van Verbeterde Chemiluminescentie substraat.
    2. Voor de detectie van meerdere eiwitten, strippen de vlek met strippen buffer, en opnieuw sonde met een primair antilichaam tegen phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (te detecteren phospho-ERK2). Bevestigen van gelijke eiwit laden door de Polyvinylideenfluoride fluoride membraan met Coomassie briljant blauw kleuring.

4. Acute mechanische stimulatie en Live Imaging van afzonderlijke cellen op de Microscoop

  1. beoordeling van het antwoord op acute mechanische stimulatie met behulp van een apparaat van de stroom
    1. verzamelen en Verdun vegetatieve of aggregatie-bevoegde cellen op ~ 1 x 10 6 cellen/mL in DB zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2, respectievelijk. ~ 600 µL laden in de dia. met een kanaal (Zie de Tabel van materiaal voor details). Toestaan dat cellen koppelen voor 10 min. ervoor te zorgen dat alle van de inhammen in de dia zijn volledig gevuld. Op de top met extra buffer zonodig.
      Opmerking: Het bepaalde dia gebruikt voor analyse heeft drie ingangen, die voeden in smalle, 1-mm kanalen, maar vervolgens samen te voegen tot één breed, 3 mm-kanaal. De hoogte van het kanaal is 0,4 mm. Hoewel de cellen zijn verguld in het kanaal, alleen het brede gedeelte is beeld.
    2. Geven een van de lijnen die is gekoppeld aan een 50 mL-reservoir via het voorste juiste ventiel van de fluidic eenheid (Zie de Tabel van materialen voor details). Met behulp van de software voor de pomp, zorg ervoor dat de klep is gesloten (d.w.z. aan de linkerkant). Vul het reservoir met DB.
      1. De druk vastgesteldop 50 mbar en zet hem aan. Vul in en spoel de regel met DB door te klikken op het ventiel om het te openen. Draai de druk terug naar 0 en sluit het ventiel na ~ 30 s.
    3. De lijn aansluit op één van de drie inhammen aan de ene kant van de dia zonder overvulling van alle luchtbellen. Sluit de andere twee baaien. Sluit de lijn van de afvoer aan de inlaat van de één op de tweede zijde van de dia..
      Opmerking: De buis gebruikt voor de input en afvoer lijnen in deze setup heeft een inwendige diameter van 1,6 mm.
    4. Plaats de dia op de Microscoop onder een 20 X lucht doelstelling. Om de spoel het kanaal, schakelen de klep te openen van de regel en klik op " druk op ", startende bij hogere druk (~ 50 mbar of ~ 40 dyn/cm 2) om de vloeistof erdoor tot de drain.
      1. Zodra de vloeistof uit de afvoer komt, externe druk te verminderen tot nul (dwz. zwaartekracht flow alleen, ~ 15 dyn/cm 2), en blijven spoelen voor ~ 30 s. Switch de klep naar de tegenovergestelde positie om te stoppen met de stroom.
    5. Beelden met RFP of GFP verlichting op een omgekeerde fluorescentie Microscoop onder een 40 X olie doelstelling 3 s tussenpozen te verwerven. Met de klep in de gesloten stand, zet de druk op de gewenste druk, meestal tussen de 15 en 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
    6. Na het verwerven van 5 beelden, leveren de stimulans door over te schakelen van de klep aan de " open " positie. De stroom uit te schakelen na 2-5 s door over te schakelen van de klep aan de tegenovergestelde richting.
      Opmerking: Voor bepaalde zwakkere biosensoren (b.v. PTEN, CynA en RalGDS) het kan noodzakelijk zijn naar afbeelding cellen met een confocal microscoop uitgerust met een 40 X olie doelstelling.
  2. Testen effecten van farmacologische remmers op reactie op acute mechanische stimulatie met behulp van een apparaat van de stroom
    1. cellen in de dia met een kanaal plaat, zoals beschreven in stap 4.1.1. Twee regels instellen: een paslijn via het voorste juiste ventiel zoals in stap 4.1.2, en de tweede tot en met de rug links ventiel. Klem de lijn links en zet de klep in de " gesloten " positie (links). Vul een regel met DB met het juiste voertuig, en de tweede met de oplossing die een farmacologische inhibitor van belang (b.v. 5 µM Latrunculin A).
      Opmerking: Er moet fysiek klem de linker lijn omdat de " gesloten " linkerpositie opent de klep voor die lijn.
    2. Vulling en spoel het recht lijn door het aanzetten van de druk op 50 mbar en schakelen de klep aan de " open " (rechts) positie. Schakel de klep naar links na ~ 30 s. vulling en de lijn links door het verwijderen van de klem voor ~ 30 s. Connect spoel beide lijnen aan twee van de inhammen aan de ene kant van de dia met een kanaal, sluit de resterende inlaat en sluit de afvoer aan de inlaat van de één op de tweede zijde. < / l Ik >
    3. wassen van de dia met de buffer in de juiste koers en het uitvoeren van stimulatie in de dezelfde buffer zoals beschreven in stappen 4.1.3 en bovenstaande 4.1.4.
      Opmerking: Hoewel de juiste lijn werd gekozen als de eerste in deze opstelling, de volgorde kan worden omgekeerd.
    4. Na stimulatie, schakelen de klep om te openen de juiste lijn op nul druk (dwz de zwaartekracht stroom alleen, ~ 15 dyn/cm 2). Verwijder de klem van de lijn links en schakelt het ventiel naar links om het openen van die lijn. De eerste regel klem.
    5. Na het uitvoeren van 3-5 mL buffer met remmer via, de klep naar het recht om te stoppen met de stroom, en Incubeer de cellen met de Inhibitor van de omwenteling voor de vereiste lengte van tijd (bijvoorbeeld 15 min). De stroom inschakelen door over te schakelen van het ventiel elke ~ 10 min. voor ~ 15 s om te voorkomen dat zuurstof ontbering. Herhaal stimulatie met de tweede lijn.
  3. Alternatieve methode voor de beoordeling van de reactie op acute mechanische stimulatie met behulp van een micropipet
    1. de micropipet gevuld met DB volgens standaard protocol 23 instellen. Compensatie druk blijven uitoefenen op 1.500 psi.
    2. Verzamelen en Verdun vegetatieve cellen zoals beschreven in stap 2.1. Plaats 25 µL druppels ~7.5 x 10 5 cellen/mL in een zaal 1-well laat houden gedurende ten minste 10 minuten, en bedek met 3 mL DB.
    3. Plaats de zaal op een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met een 40 X olie doelstelling. De cellen te zoeken. Zachtjes lager het micropipet in het midden van het gezichtsveld totdat het eerst de bodem van de kamer raakt.
      Opmerking: Aangezien de compensatie druk werd vastgesteld op 1500 Psi, de cellen zal worden voortdurend blootgesteld aan een zeer langzame stroming van DB aan de micropipet.
    4. Beginnen met RFP of GFP verlichting 3 s tussenpozen afbeeldingen ophalen. Passen de ' Clean ' functie vrij te geven een bolus van vloeistof uit de micropipet. Blijven imaging ikn de aanwezigheid van stroom als gevolg van druk van de compensatie alleen.
  4. Een alternatieve methode voor de beoordeling van de reactie op acute mechanische stimulatie via bulk buffer toevoeging
    1. verzamelen en Verdun vegetatieve cellen zoals beschreven in stap 2.1. Plaats 20 µL druppels van cellen op ~ 1 x 10 6 cellen/mL in DB in het midden van een goed uit een 8-well-zaal. Toestaan dat cellen te houden voor ten minste 10 min.
    2. Beginnen met RFP - of GFP-specifieke verlichting op een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met een 40 X doel 3 s tussenpozen afbeeldingen ophalen. Richten op een gebied dicht bij de rand van de druppel.
      3. 430 µL van DB toevoegen
    3. snel aan de ene kant van de put. Blijven imaging.
    4. Voor analyse van de wisselwerking tussen mechanische en chemische prikkels, 12 of 45 s na mechanische stimulatie, zachtjes toevoegen 50 µL van foliumzuur (eindconcentratie 20 nM) of het voertuig (DB) zonder een mechanische reactie. Blijven imaging.
  5. Kwantificering van reactie
    1. de 32-bits TIFF-afbeelding te openen in de Software van de analyse van de afbeelding (Zie Tabel van materialen voor details) 27.
    2. Onder de ' analyseren ' tabblad, ga naar " Set metingen ". Schakel het selectievakje voor ' grijs-waarde betekent '. Zorg ervoor dat de andere selectievakjes niet zijn ingeschakeld. Klik op " OK ".
    3. Onder het ' proces ' tab, klik op " aftrekken achtergrond ". Houd de rolstraal van de bal op 50 pixels, en doe niet controle een van de opties in het menu weergegeven. Zoom in op de cel met behulp van de ' Magnifying Glass ' hulpmiddel.
    4. Gebruiken de ' rechthoek ' tool, tekent u een vak (~2.5 x 2,5 µm 2) in het cytosol, om ervoor te zorgen niet te tekenen over de kern of het plasma-membraan. Druk op " Ctrl " + " M " toetsen of ga naar de ' analyseren ' tab en klik op " maatregel " de gemiddelde grijze waarde van het vak te bepalen. Doorgaan naar de volgende frames en maatregel opnieuw, ervoor te zorgen dat het vak blijft in het cytosol.
      Opmerking: Aangezien D. discoideum cellen zeer snel bewegen het vak kan worden verplaatst van de ene kader naar het volgende te houden in het cytosol.
    5. Immers van de frames hebben geanalyseerd, kopieert u de waarden naar een werkblad. Normaliseren ter verantwoording voor cel-naar-cel variatie in de niveaus van de expressie van verschillende biosensoren, de waarden voor de gemiddelde grijswaarde waargenomen op moment 0. Berekenen van de reciproke van de waarden aan de accumulatie van het signaal op de cortex.

5. Continue mechanische stimulatie en Live Imaging van afzonderlijke cellen op de Microscoop

  1. instellen in de cellen precies zoals hierboven beschreven in stappen 4.1.1 - 4.1.3 p.a. acute mechanische stimulatie. Open de stekker die betrekking hebben op het reservoir met de buffer zodat het volume kan worden bijgevuld als reactie is langer dan een paar minuten per keer geanalyseerd.
    Opmerking: Omdat het reservoir open voor de duur van het experiment blijft, deze test wordt uitgevoerd in de afwezigheid van externe druk en zwaartekracht stroom alleen afhankelijk. Het vergroten van het tempo van de stroom door de zwaartekracht, de afvoer kan worden geplaatst op een tafel onder de Microscoop.
  2. Beginnen imaging cellen met RFP - of GFP-specifieke verlichting op een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met een 40 X doel 3 s tussenpozen voor analyse van biosensor antwoorden. U kunt ook afbeelding met fase contrast met behulp van een 20 X doelstelling tussenpozen van 10 s voor analyse van totale cel migratie.
  3. Inschakelen van de stroom na verschillende frames op de nul-druk-instelling (d.w.z. stroom is als gevolg van zwaartekracht alleen of ~ 15 dyn/cm 2) door de klep over te schakelen naar de open positie. Wanneer het niveau van de vloeistof tot 5-10 mL in het reservoir valt, herladen met meer buffer. Zorg ervoor dat de vloeistof zorgvuldig toevoegen zodat luchtbellen niet krijgen in de regels gevangen doen.
    Opmerking: Het is belangrijk om toe te voegen vloeistof van dezelfde temperatuur om te voorkomen dat een schok reactie in de cellen.
  4. Kwantificeren cel snelheid en volharding met behulp van de software van de analyse van de migratie (Zie de Tabel van materialen voor details) volgens fabrikant ' s instructies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Temporele reactie van chemotaxis regelgevers op acute mechanische stimulatie

Om te beoordelen van de reactie van D. discoideum cellen op mechanische stimulatie, werden aanhangend aggregatie-bevoegde cellen blootgesteld aan een korte puls van shear stroom. Aggregatie-bevoegde D. discoideum cellen afscheiden kamp, dat kan worden gevoeld door naburige cellen. Om te overwinnen de bijdrage van signalering van cel-cel, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven methoden bieden een handige manier om te beoordelen van zowel de bevolking als afzonderlijke cel gedrag in antwoord als u wilt schuintrekken van stroom. Nog belangrijker is, terwijl eerdere studies geanalyseerd lokalisatie van leading en lagging rand markeringen tijdens de migratie, laat de huidige aanpak onderzoek van de onmiddellijke effecten door de stroom van de shear acuut toe te passen. Using zulks werkwijze wij aangetoond dat in feite de eerste reactie van cellen wilt schuintrekken stroom niet c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie R35 GM118177 PND.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
DextroseFisherD16-1Gebruik voor het bereiden van HL-5 media en SM platen (stappen 1.1, 1.2)
Proteose peptonFisherDF0120-17-6Gebruik voor het bereiden van HL-5 media (stap 1.1)
Gist extractFisher50-550-445Gebruik voor het bereiden van HL-5 media en SM platen (stappen 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2OFisherS373-500Gebruik voor het bereiden van HL-5 media en 10X fosfaat buffer (stappen 1.1, 1.3)
KH2PO4FisherP386-500Gebruik voor het bereiden van HL-5 media, SM platen en 10X fosfaat buffer (stappen 1.1-1.3)
Streptomycine (dihydrostreptomycine sulfaat)FisherICN10040525Gebruik voor het bereiden van HL-5 media (stap 1.1)
Pepton (Bacto)FisherDF0118-17-0Gebruik voor het bereiden van SM platen (stap 1.2)
K2HPO4FisherP288-100Gebruik voor het bereiden van SM platen (stap 1.2)
AgarFisherBP1423-500Gebruik voor het bereiden van SM platen (stap 1.2)
MgSO4FisherM65-500Gebruik voor het bereiden van DB buffer (stap 1.4)
CaCl2FisherC79-500Gebruik voor het bereiden van DB buffer (stap 1.4)
CaffeïneFisherO1728-500Gebruik voor het bereiden van caffeïne (stap 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclisch Monofosfaat, Natriumzout)Fisher11-680-1100MGGebruik voor het bereiden van cAMP (stap 1.6)
FoliumzuurSigmaF7876Gebruik voor het bereiden van foliumzuur (stap 1.7)
Tris baseFisherBP152-500Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)
Natrium dodecylsulfaat (SDS)FisherBP166-500Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)
GlycerolFisherG33-500Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad1610610Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)
BromofenolblauwBio-Rad1610404Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)
NaFFisherS299-100Gebruik voor het bereiden van sample buffer met protease en fosfataseremmers (stap 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911Gebruik voor het bereiden van sample buffer met protease en fosfataseremmers (stap 1.8)
Natriumpyrofosfaat decahydraatFisherS390-500Gebruik voor het bereiden van sample buffer met protease en fosfataseremmers (stap 1.8)
Complete EDTA-vrije protease remmer cocktail (Roche)Sigma11873580001Gebruik voor het bereiden van sample buffer met protease en fosfataseremmers (stap 1.8)
Latrunculine AEnzo Life SciencesBML-T119-0100Gebruik voor het bereiden van Latrunculine A (stap 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gelBio-Rad3450029Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)
Polyvinylideenfluoride membraanBio-Rad1620177Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Konijnen antilichaamCell Signaling2060Primair antilichaam voor gebruik in immunoblotting (stap 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antilichaamCell Signaling4370Primair antilichaam voor gebruik in immunoblotting (stap 3.3)
Konijnen IgG HRP Gekoppeld Heel Ab (van Ezel)GE HealthcareNA934-100ULSecundair antilichaam voor gebruik in immunoblotting (stap 3.3)
Verbeterde chemiluminescentie substraat (Clarity Western ECL Substraat)Bio-Rad1705060Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)PiercePI46430Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)
Coomassie Brilliant BlueFisherPI20278Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)
K. aerogenes stam (niet-pathogeen)Dicty Stock Center (dictybase.org)
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materialen en apparatuur
Orbitale shaker (model G-33, of een vergelijkbaar alternatief)New Brunswick ScientificGebruik voor het kweken van K. aerogenes (stap 2.1.1), en voor het basaleren en stimuleren van D. discoideum cellen (stap 3). De gyroradius van deze shaker is 9,5 mm.
10 cm Petri schotel

Referenties

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Schuifstromingsignaaltransductieactinecytoskeletfluorescente biosensorenorbitale schudmachinemicrofluïdische kamerWestern blotcelmigratie
Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.