Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.

Samenvatting

Acellulair extracellulaire matrix preparaten zijn nuttig voor het bestuderen van de cel-matrix interacties en regeneratieve cel therapie toepassingen vergemakkelijken. Verschillende commerciële extracellulaire matrixproducten zijn beschikbaar als hydrogels of membranen, maar deze niet beschikken over weefsel-specifieke biologische activiteit. Want perfusie decellularization meestal niet mogelijk met menselijke hartweefsel is, ontwikkelden we een 3-stap onderdompeling decellularization proces. Menselijke myocardiale segmenten aangeschaft tijdens een operatie worden eerst behandeld met wasmiddel-vrije hyperosmolar lysis-buffermengsel, gevolgd door incubatie met de Ionische detergent, natrium dodecyl sulfaat, en het proces is voltooid door te profiteren van de intrinsieke activiteit van de DNase van foetale runderserum. Deze techniek resulteert in cel-gratis bladen van cardiale extracellulaire matrix met grotendeels bewaard vezelig weefsel architectuur en biopolymeer samenstelling, die getoond werden specifieke milieu signalen doorgeven aan cardiale cel populaties en pluripotente stamcellen cellen. Cardiale extracellulaire matrix bladen kunnen vervolgens worden verder verwerkt tot een poeder microparticle zonder verdere chemische modificatie, of, via korte pepsine spijsvertering, in een zelfassemblerende cardiale extracellulaire matrix hydrogel met verduurzaamd topicale.

Inleiding

De extracellulaire matrix (ECM) biedt niet alleen structurele ondersteuning maar is ook belangrijk voor biologische cel en weefsel functioneren¹. In het hart participeert de ECM in de regulering van de pathofysiologische reacties zoals fibrose, ontsteking angiogenese, cardiomyocyte contractiele functie en levensvatbaarheid en resident progenitor cel lot. Naast haar primaire onderdelen - vezelig glycoproteïnen glycosaminoglycanen en proteoglycans - bevat het een heleboel secreted groeifactoren en cytokines membraanachtig blaasjes met nucleïnezuren en proteïnen^2,3.

Het is onlangs duidelijk dat Acellulair ECM preparaten niet alleen zijn voor het bestuderen van de cel-matrix interacties, maar ook voor potentiële therapeutische cel-gebaseerde toepassingen van onschatbare waarde geworden. Het belang van een adequate omgeving naar therapeutische cel producten of gemodificeerde weefsels wordt nu algemeen erkend. Pogingen hebben gedaan om te combineren cel suspensies of actieve samenstellingen met gedefinieerde biopolymeric hydrogels^4,5,6 of met eiwit cocktails uitgescheiden door lymfkliertest Sarcoom cellen (dat wil zeggen, Matrigel, Geltrex) ⁷. de voormalige topicale hebben beperkt, de laatste zijn echter problematisch in GMP-grade processen, en beide ontbreken de weefsel-specifieke topicale van cardiale ECM (cECM)^{8,9,10, 11,12,13}.

Decellularization van het myocardium is eerder uitgevoerd door perfusie van het hele hart via de coronaire therapieën^14,15. Hoewel dit mogelijk is in dierlijke harten, zijn intact menselijke harten zelden beschikbaar. Dus, een onderdompeling proces waarmee voor de behandeling van weefselmonsters verkregen in de operatiekamer was favoriet. Onze "3-stap" protocol bevat 3 aparte incubatie stappen namelijk lysis van de solubilisatie en DNA-verwijdering. Het levert de menselijke myocardiale ECM met grotendeels bewaard gebleven eiwitten en glycosaminoglycaan samenstelling^16,17. Deze cECM segmenten toestaan voor in vitro studies van cel-matrix interacties, maar zijn slecht geschikt voor potentiële therapeutische toepassingen van de mens-schaal. Het productieproces werd vervolgens uitgebreid produceren gelyofiliseerd cECM microdeeltjes of een cECM hydrogel¹⁸.

Dit protocol voorziet in de decellularization van menselijke myocard verkregen chirurgische monsters, behoud van de hoofdcomponenten van myocardiale extracellulaire matrix (ECM) en hun biologische activiteit. Dit protocol is aanbevolen wanneer menselijke cardiale ECM met bewaarde weefsel-specifieke topicale is vereist voor experimentele studies van cel-matrix interacties, of wanneer een geschikt milieu voor cel-gebaseerde regeneratie van het myocardium benaderingen nodig is. In principe is het ook mogelijk om aan te passen van dit protocol aan GMP-grade omstandigheden, zodat het gebruik van verwerkte cECM haalbaar voortaan therapeutische toepassingen moet.

Protocol

Het studie-protocol voldoet aan de ethische beginselen die worden beschreven in de verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de Raad van bestuur en ethiek Commissie van Charité Medizinische Universität op institutionele beoordeling. Alle patiënten geboden geschreven, geïnformeerde toestemming voor gebruik van hartweefsel voor experimentele studies.

1. bereiding van menselijke myocard segmenteren

1. Verkrijgen van links ventriculaire myocard (grootte varieert afhankelijk van het type van chirurgie) rechtstreeks van de operatiekamer en vervoer in koude PBS in een steriele container.
2. Verwijder alle vetweefsel met een steriel scalpel met een mes van de no. 10 onder steriele omstandigheden.
3. Snijd het myocardium in blokjes van ongeveer 1 x 1 x 1 cm met behulp van een scalpel.
4. Plaats de kubussen in steriele 50 mL tubes.
   Opmerking: Als u wilt onderbreken, uitvoeren van stap 1.5, ga anders verder met stap 2.2. Vermijd het herhaaldelijk bevriezen-ontdooien cycli om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit en een afname van de kwaliteit van het weefsel.
5. Opslaan van de buizen met de kubussen bij-80 ° C. Het weefsel kan worden opgeslagen voor enkele maanden.

2. afdelen van het Myocardium kubussen in plakjes

1. Neem de sproeibuis(-buizen) met de bereid kubussen uit de vriezer.
2. Vervoer op ijs om de cryostaat.
3. Het object en de kamer temperatuur instellen tot-15 ° C.
   Opmerking: De juiste temperatuur is cruciaal voor het garanderen van perfecte segmenteren.
4. Chill lege 50 mL tubes en stempels in de zaal of op droog ijs.
5. Voeg een laag toe (ongeveer 0,5 - 1,0 mL) van cryosection medium op de koude stempel en laat het bevriezen totdat het is wit en solide.
6. Voeg een tweede laag van cryosection medium toe en plaats een myocard kubus op deze laag.
7. Zorg ervoor dat het cryosection medium en myocard zijn volledig bevroren voordat u verdergaat.
   Opmerking: Wanneer het monster en cryosection medium niet zijn bevroren het segmenteren zouden worden geschaad. Volledig bevroren cryosection medium verandert van vloeistof en transparante solide, wit en niet-transparante. De myocardiale kubussen moeten minstens 30 min tot 1 h tot het volledig bevriezen als verdergaat onmiddellijk uit stap 1.4. Wanneer het weefsel is bevroren moet het niet vervormen wanneer aangeraakt/behandeld met een pincet.
8. Stempel met bevroren myocard invoegen in de houder en draai alle schroeven.
9. Trim het oppervlak van het weefsel tot een nog vectorafbeeldingsbestanden oppervlak is verkregen.
10. Afdelen dikte 300 µm instellen
11. Sectie het bevroren myocardium met automatische segmenteren. Dit garandeert eenvormige gesneden secties. Ongeveer 30-40 secties kunnen worden gesneden uit een kubus.
12. Plaats elk segment na afdelen losjes in een precooled 50 mL-buis.
    Opmerking: Druk niet op de segmenten of pack strak. Ongeveer 40 segmenten kunnen passen in een buis.
13. Sluit de gevulde buizen en ijs opleggen.
    Opmerking: Als u wilt onderbreken Ga op met stap 2.14, anders verder met stap 3.2.
14. Winkel myocard segmenten bij-80 ° C. De segmenten kunnen worden opgeslagen voor enkele maanden.

3. decellularization van menselijke myocard segmenten

1. Neem het nodige aantal 50 mL buisjes met myocard secties uit de diepvries-80 ° C en het vervoer op het ijs.
2. De bevroren secties van alle 50 mL tubes van stap 3.1 overbrengen in een steriele bekerglas. Ongeveer 40 segmenten worden toegevoegd aan het bekerglas per tube 50 mL. Het bekerglas moet drie maal het volume van de 50 mL tubes; Gebruik een 150 mL-bekerglas bijvoorbeeld, voor decellularization voor een tube van 50 mL.
3. Voeg 50 mL lysis van de oplossing (10 mM Tris, 0,1% w/v EDTA, pH 7.4 in H₂O) per tube van 50 mL met myocard segmenten.
4. Schud de plakjes myocard in een steriele bekerglas van 100-150 toeren per minuut continu gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
5. Stam de vloeistof met de plakjes weefsel door een grove zeef. De plakjes weefsel met een botte pincetten overbrengen in een nieuwe steriele bekerglas. Voeg 50 mL 0,5% SDS in PBS per tube van de eerste 50 mL van myocard segmenten (bijvoorbeeld gebruiken 100 mL SDS oplossing wanneer twee 50 mL tubes myocardiale secties zijn wordt decellularized).
6. Schud voortdurend voor 6 h van 100-150 toeren per minuut bij kamertemperatuur.
7. Stam de vloeistof met de plakjes weefsel door een grove zeef. De plakjes weefsel met een botte pincetten overbrengen in een nieuwe steriele bekerglas en wassen 3 keer met 50 mL PBS voor elke 10 min terwijl het schudden van 150 toeren per minuut. Vervolgens wassen 's nachts in PBS met 1% penicilline/streptomycine en 1% nystatine (PBS-P/S-N) bij 100-150 rpm en 4 ° C terwijl het schudden.
   Opmerking: Grondig wassen is essentieel voor het volledig verwijderen van alle resterende SDS. Resterende sporen van SDS zijn giftig wanneer de ECM wordt gebruikt in combinatie met cellen.
8. De wassen-oplossing verwijderen en voeg 25 mL voorverwarmd FBS (37 ° C) met 1% penicilline/streptomycine en 1% nystatine aan de decellularized segmenten per tube eerste 50 mL van het myocard segmenten.
9. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C. In deze stap wordt elke resterende DNA uit de matrix vanwege de intrinsieke activiteit van de DNase van de FBS verwijderd.
10. De segmenten overbrengen in een nieuwe steriele bekerglas en wassen 3 keer met 50 mL PBS voor elke 10 min terwijl het schudden van 150 toeren per minuut.
    Opmerking: De ECM-segmenten kunnen worden opgeslagen in PBS-P/S-N bij 4 ° C voor meerdere dagen. Het is echter raadzaam onmiddellijk over te gaan.

4. verwerking van de cECM van de Decellularized tot een poeder

1. Plaats de ECM plakjes losjes in een nieuwe steriele 6-well plaat. Bevriezen van de ECM bij-80 ° C en lyophilize voor 2 dagen in een lyophilizer.
   Opmerking: meer dan één segment kan per putje geplaatst worden. Schik de plakjes om volledig bedekt het oppervlak van de put. Overlappende segmenten, heeft dit geen invloed op het latere vermaling succes.
2. Voor de verpulvering van het ECM-segment buizen gebruik specifieke frezen (Zie Tabel van materialen) met 1.4 mm keramische kralen. Vul de buizen losjes met gelyofiliseerd ECM met behulp van steriele botte pincet. Voor een optimaal resultaat wordt een totaalgewicht van ECM tussen 10-20 mg aanbevolen.
   Opmerking: Als de ECM te strak in de buizen frezen verpakt is de verpulvering proces will be negatively impacted.
3. Module-freeze de buizen in vloeibare stikstof.
   Let op: vloeibare stikstof is extreem lage temperatuur, passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen.
4. De bevroren buizen invoegen met het freestoestel en verpulveren de ECM.
   1. Een duur van 30 s en een maximale snelheid en beginnen met het apparaat.
   2. Na afwerking, neem de buizen en module-freeze weer in vloeibare stikstof.
   3. Herhaal dit vijf keer.
5. Het wassen van de deeltjes van de buizen door toevoeging van 1 mL ddH₂O per buis en schudden of vortex voor volledige solubilizing. Filtreer de heterogene oplossing via een maaswijdte van 200 µm in een tube van 50 mL.
6. Het bevriezen van de buis in-80 ° C of vloeibare stikstof.
7. Vervang de standaard deksel van de buis door een 0,22 µm filter. Dit filter deksel voorkomt dat het poeder uit de buis stromen maar kunt luchtcirculatie voor verdamping van water.
8. Plaats de buizen in de lyophilizer en lyophilize weer als u wilt verwijderen van het water van de stap (4.5)
   Opmerking: Lyofilisatie bij deze stap kan duren tot 3 dagen.
9. Poeder bij-80 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt of ga verder met stap 5.1.

5. enzym op basis van Homogenizing van cECM Micro-deeltjes

1. Ontbinden varkens pepsine in 0,01 M HCl (pH 2.0) tot een concentratie van 1 mg/mL. Plaats op een rondschudapparaat bij kamertemperatuur totdat het volledig is opgelost.
2. Los van het gelyofiliseerd poeder voor menselijke ECM (stap 4.8) in de pepsine-oplossing voor een eindconcentratie van 10 mg/mL. Meng door pipetteren. Het totale volume is afhankelijk van de hoeveelheid ECM-oplossing nodig. Bijvoorbeeld, Los 10 mg voor ECM powder in 1 mL pepsine-oplossing.
   Opmerking: Ontbinding van deeltjes kan worden ondersteund door middel van zacht vortexing (1.000-1.500 RPM). Resterende brokken van microdeeltjes zal een negatieve invloed hebben op de spijsvertering.
3. Breng de oplossing over in 2 mL buisjes met een volume van 1 mL per buis.
4. Plaats de buizen in een tube-shaker voor 48 uur bij 27 ° C en 1200 rpm.
5. Neem de buizen uit de shaker en plaats op ijs of de houder van een vooraf gekoelde buis.
6. Mix 1/9 van het volume van ECM-oplossing van koude 10 x PBS (pH 7.4) met 1/10 van het volume van ECM-oplossing van koude 0,1 M NaOH in een precooled buis en plaats op het ijs. Dit mengsel zal neutraliseren de verteerd ECM-oplossing en onherroepelijk inactivering van de pepsine.
7. De ECM-oplossing aan de neutralisatie mengsel en meng grondig door pipetteren of vortexing toevoegen.
8. De ECM ingesteld op de gewenste concentratie met 1 x PBS (pH 7.4). De pH van de oplossing kan worden gecontroleerd met pH-papier.
   Opmerking: Voorbeeld berekening voor 10 mL verteerd ECM-oplossing:
   Voeg 10 mg varkens pepsine tot 10 mL HCl (pH 2.0).
   Voeg 100 mg ECM poeder tot pepsine-oplossing.
   Opmerking: Voorbeeld berekening voor het neutraliseren van 10 mL verteerd ECM-oplossing en de concentratie te stellen op 8 mg/mL:
   Vol_definitieve = c_start x Vol_start / c_definitieve = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
   Vol_10xPBS = Vol_start / 9 = 1/9 van 10 mL = 1.11 mL 10 x PBS
   Vol_NaOH = Vol_start / 10 = 1/10 van 10 mL = 1 mL
   Vol_1xPBS = Vol_definitieve - Vol_start - Vol_10xPBS - Vol_NaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0.39 mL

Resultaten

Het 3-staps protocol voor decellularization van menselijke myocard hier resultaten gepresenteerd in in de buurt van-volledige verwijdering van celmateriaal, met behoud van de belangrijke onderdelen van de ECM en de fibrillar structuur van ECM. Na decellularization blijkt de bruto verwijdering van cellen van het weefsel door de verandering in kleur (figuur 1A). Histologisch onderzoek met H & E en Masson Trichrome vlekken bleek het volledig ontbreken van residu...

Discussie

Bij de voorbereiding van menselijke myocardiale ECM, het doel is het bereiken van het volgende: verwijdering van relevante immunogene celmateriaal, behoud van ECM integriteit en topicale, steriliteit, niet-giftigheid van het eindproduct, GMP-proces-compatibiliteit, en geschiktheid van het product voor een bepaalde toepassing op het gebied van de behandeling. Door het combineren van ons 3-staps decellularization protocol met verdere verwerking in microdeeltjes of zelfassemblerende hydrogel, menselijk cardiale ECM materiaa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Balance	DR Precisa, Dietikon, Switzerland	Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3	InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany	SK-10-004
Cell culture plates (6-well)	Greiner, Frickenhausen, Germany	657160
Cryostat CM	Leica, Wetzlar, Germany	3050S
EDTA	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml)	Greiner, Frickenhausen, Germany	616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml	Greiner, Frickenhausen, Germany	188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrome, Berlin, Germany	S 0115
Freeze Dry System	Labconco, Kansas City, USA	7670520
Freezer (-80°C)	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Forma 900 Series
HCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	281.1
Microtome Blades Type 819	Leica, Wetzlar, Germany	14035838925
Minilys Homogeniser	PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany	91-PCSM
NaOH	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	K021.1
Nystatin	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P06-07800
PBS	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	14190-094
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Darmstadt, Germany	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm	Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany	91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker	Heidolph, Schwabach, Germany	544-41200-00
SDS	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	CN30.3
Stereo microscope	Leica, Wetzlar, Germany	M125
Steriflip-GP, 0,22 µm	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound	Hartenstein, Wurzburg, Germany	TTEK
Transfusion set 200µm	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	798.200.500
TRIS	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm	Medical Highlights, Rohrdorf, Germany	CV102-003
Vortex-Genie2	Scientific Industry, New York, USA	SI-0256