Ratten angst-achtig gedrag getest door de verhoogde plus doolhof is sterk afhankelijk van de testomgeving. Hier laten we zien hoe apparaat instellingen, met name de structuur van arm, van invloed zijn op gedrag op het doolhof, en leggen we een betrouwbaar protocol voor het detecteren van de effecten van Anxiolyse drugs. Dit verslag zal bijdragen aan angst onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Testen van dierlijke angst bij ratten: effecten van Open Arm richels en gesloten Arm muur transparantie in Elevated Plus doolhof Test
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De verhoogde plus doolhof test is een gedrags test voor het beoordelen van de dieren angst bij knaagdieren. Hoewel deze test algemeen op het gebied van behavioral science toegepast wordt, zijn tegenstrijdige resultaten vaak voorzien van verschillende laboratoria. Als u wilt identificeren redenen voor de verschillende resultaten, we eerder gericht op arm functies, die tussen laboratoria, de meeste met name de aanwezigheid/afwezigheid van richels op de zijkanten van de open armen en de transparantie/ondoorzichtigheid van gesloten arm muren verschillen. In een vorig rapport, we een aangepaste ontworpen container gebruikt voor het vergelijken van het gedrag van de rat op verschillende combinaties van open en gesloten arm ontwerpen onder identieke proefomstandigheden, en toonde dat verschillen in arm functies met experimentele interfereren resultaten. Kortom, open arm richels aanzienlijk toegenomen angst-achtig gedrag bij ratten, terwijl transparante wapens kunnen ook dit gedrag gedaald. We geverifieerd bovendien een hogere gevoeligheid van de detectie van het effect van een geneesmiddel Anxiolyse in een combinatie van neen-ledged open arm + ondoorzichtige ommuurde gesloten arm in vergelijking met een combinatie van ledged open arm + transparante ommuurde gesloten arm. In dit verslag introduceren wij onze protocol voor de verhoogde plus doolhof test, samen met de bespreking van de belangrijkste resultaten van het vorige verslag en onze experimentele ervaring. Wij geloven dat dit verslag zal het verstrekken van nuttige informatie voor onderzoekers werkzaam zijn of die van plan om gebruik van de verhoogde plus doolhof in hun studie.
Inleiding
Het aantal patiënten met stemmingsstoornissen, met inbegrip van-angststoornis en depressie, groeit. Hoewel de ontwikkeling van deze aandoeningen zowel genetische en omgevingsfactoren omvat, zijn de gedetailleerde pathogene mechanismen nog niet volledig begrepen1. Daarom is onderzoek moet zich concentreren op het blootleggen van de onderliggende mechanismen van stemmingsstoornissen, alsmede de ontwikkeling van doeltreffende geneesmiddelen die minder bijwerkingen hebben.
Gedrags tests op proefdieren zijn nuttig voor het onderzoek van hogere hersenfuncties, inclusief emoties. Zoals dierlijk gedrag zeer variabel is, verschillen experimentele resultaten vaak tussen laboratoria, zelfs indien een identiek ingeteelde stam gebruikte2 was. Onderzoekers moeten dus ook begrijpen van de basisfuncties van de experimentele apparaten die zij vaststellen teneinde betrouwbare en nauwkeurige resultaten in het laboratorium.
De verhoogde plus doolhof test is oorspronkelijk opgericht om onderzoeken van emotionele reactiviteit in knaagdieren3,4. Het hele apparaat is meestal gelegen 500 mm boven de vloer, en bestaat uit twee open en gesloten takken waardoor een plus vorm. Metingen van arm exploration (met inbegrip van de duur en frequentie van de items op elke arm), afstand reisde, en bepaalde gedragingen zoals uitgerekt-bijwonen houding van onderworpen dieren worden geregistreerd tijdens observationele periodes. Door deze maatregelen, wordt dierlijke angst geschat als een experimentele resultaten.
De verhoogde plus doolhof test wordt gebruikt over de hele wereld, maar niet alle laboratoria gebruiken de dezelfde apparatuur ontwerp5,6, en deze verschillen van invloed kunnen zijn op de experimentele resultaten. Verschillen omvatten bijvoorbeeld de aanwezigheid of afwezigheid van richels langs de open armen en/of het gebruik van transparante of ondoorzichtige wanden gesloten armen5,6. De richels langs open armen en het gebruik van transparante muren voor gesloten armen werden ontwikkeld om te voorkomen dat de dieren eraf vallen het apparaat7en te vergemakkelijken van gedrags opmerkingen binnen de gesloten armen, respectievelijk8,9. Al zijn er enkele studies die hoe individuele arm structuur verschillen onderzocht van invloed kunnen zijn op de mogelijkheid om te detecteren dierlijke angst1,2,5,10,11 , het gecombineerde effect van open (met/zonder korte richel) en gesloten (transparant/ondoorzichtig muren) arm functies op dierlijk gedrag nog niet is onderzocht.
In een recent rapport bespraken wij het effect van deze combinaties van arm ontwerpen op angst-achtig gedrag in ratten12. Kortom, open arm richels aanzienlijk toegenomen angst-achtig gedrag bij ratten, terwijl transparante wapens kunnen ook dit gedrag gedaald. Bovendien, gecontroleerd we hogere gevoeligheid van de detectie van het effect van een geneesmiddel Anxiolyse in een combinatie van neen-ledged open arm + ondoorzichtige ommuurde gesloten arm in vergelijking met een combinatie van ledged open arm + transparante ommuurde gesloten arm. In dit verslag zullen wij introduceren ons protocol voor de verhoogde plus doolhof test, samen met de bespreking van de belangrijkste resultaten van het vorige verslag. Wij geloven dat dit verslag zal het verstrekken van nuttige informatie voor degenen die werkzaam zijn of die van plan om gebruik van de verhoogde plus doolhof in hun studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Meiji-universiteit (IACUC 14-0002(1)). Dieren die worden gebruikt in de representatieve resultaten waren als volgt voorbewerkt: mannelijke Sprague-Dawley ratten werden gekocht van een laboratorium dierlijke bedrijf en ondergebracht in groepen van 4 dieren per standaard rat kooi (W200 × D410 × H250 mm) voor ten minste één week voor aanvang van de gedrags experiment. De dierverblijven kamer is gehandhaafd op standaardomgevingsomstandigheden voor licht (licht/donker schema met op om 10:00 h licht 12:12), kamertemperatuur (25.0 ± 0,5 ° C) en luchtvochtigheid (55 ± 10%) ventilatie (10 keer / h), en dieren had ad libitum toegang tot voedsel () Oriental gist Co. Ltd., Tokyo, Japan) en water. De dieren werden bewaard in een standaard rat kooi (W410 x D250 x H200 mm, Toyoriko Co., Ltd., Aichi, Japan) met papier beddengoed (alpha-dri, LSG Corporatin, Tokyo, Japan).
1. verhoogde Plus doolhof Test
- Instellen van de verhoogde plus doolhof van apparatuur in een aangepaste container (W1, 500 × D1, 500 × H2, 000 mm) (figuur 1A) met een plus-vormige metalen kader 500 mm boven het woord ter ondersteuning van de run manier wapens (figuur 1B), verlichting in het plafond van de container om te verlichting van het oppervlak van de doolhof aan de vereiste lichtsterkte (Figuur 1 c), en een digitale videocamera in het plafond center om live video bewaking van de gedragsmatige tests (Figuur 1 c).
- Bevestig de armen (L500 x W100 mm) op het plus-vormige kader, en dan de vierkante centraal platform (W100 x D100 mm) in het midden van de vier armen fix (Figuur 1 d -F).
Opmerking: In ons laboratorium, hebben we twee soorten open armen (L500 x W100 mm) en twee soorten gesloten armen (L500 x W100 x H450 mm) (Figuur 1 d). De gesloten armen hebben ofwel transparant of ondoorzichtig muren (Figuur 1 d), en de open armen zijn ontworpen met of zonder een korte richel (H5 mm, figuur 1E). De vierkante centraal platform (W100 × D100 mm) wordt geplaatst in het midden van de vier armen (Figuur 1 d -F). Dus de volgende vier combinaties van wapens kunnen worden bereid volgens experimentele doel: open armen met richels + gesloten armen met transparante muren (richels/transparant), open armen met richels + gesloten armen met ondoorzichtige muren (richels/ondoorzichtig), open armen muren zonder richels + gesloten armen met transparante muren (No-richels/transparant) en open armen zonder richels + gesloten armen met ondoorzichtig (No-richels/ondoorzichtig). Het oppervlak van de baan van de arm is zwart, om betere dier traceren door de geautomatiseerde gedrag analysesoftware, zoals beschreven in paragraaf 2, gedragsanalyse. - Pas de intensiteit van de verlichting op het oppervlak van het deel van de distale einde van elke arm en centraal platform ongeveer 100 Lux.
- Vóór elke proef, schoon het gehele apparaat met 70% ethanol oplossing en veeg met gedestilleerd water.
- Klik op "record" op de hard disk recorder om te beginnen met de digitale videocamera die u behaalt de rat gedrag voor de video analyse beschreven in paragraaf 2, gedragsanalyse imaging.
- Plaats van een dier op het centrale platform geconfronteerd met een open arm en laat gratis exploratie op het apparaat gedurende 5 minuten.
- Klik op de "stop" op de hard disk recorder tot het einde van de opname.
- Het aantal ontlasting en urinations na de getest dier terug te keren naar de dierverblijven kamer.
- Herhaal vanaf stap 1.4 tot het einde van het experiment.
Opmerking: Een droge test run wordt altijd uitgevoerd vóór het begin van elk experiment om te controleren dat de experimentele instellingen correct zijn ingesteld voordat alle proefdieren zijn blootgesteld aan de experimentele omstandigheden. Anders, sommige dieren, vooral het eerste dier treden verschillende milieu-omstandigheden (bijv., geluiden eventueel geïnduceerd door de experimentator tijdens manipulatie en/of dier signalen mogelijk achtergelaten door de eerder getest dier).
Opmerking: De onderzoekers zijn in de buurt van de container als een dier wordt getest. Dus, hoewel de onderzoekers niet zichtbaar zijn de rat nog steeds mogelijk om ze via geur en/of geluid.
2. de gedragsanalyse
Opmerking: Gedragsanalyse wordt uitgevoerd door handmatige observatie en geautomatiseerde analysesoftware.
-
Handmatige observatie
- Nadat het dier is geplaatst op de richel, het volgende observeren: aantal items (een vermelding op een arm is gedefinieerd als elke instantie wanneer alle 4 poten op de arm zijn), tijd doorgebracht op elke arm, en aantal uitgerekt-bijwonen houdingen tegenover een open arm , terwijl de steun uit het centrale platform naar een gesloten arm.
- Meet de duur en frequentie van de symptomen hierboven omschreven door stopwatch en tellen voor 5 min, vanaf wanneer de deuren van de container zijn gesloten.
-
Geautomatiseerde analyse
- Met behulp van de beschikbare software-programma, het volgende opnemen: afstand reisde, tijd doorgebracht in verschillende posities op open armen (proximale, distale en middelste segmenten van het centrale platform), en een minuut-tot-minuut-analyse van de tijd besteed aan open en gesloten wapens.
- Klik op "start" van de geautomatiseerde analysesoftware op hetzelfde moment als de handmatige observatie begint (de opname stopt automatisch als opname duur is ingesteld).
Opmerking: De gedragsanalyse software gebruikt in deze studie houdt het dier via het contrast met het veld achtergrond; het dier, dat is toegewezen een vaste grootte, is aangemerkt als het helderder-object en de motoriek van het middelpunt kan dus worden gebruikt voor dierlijke bijhouden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de vorige studie vergeleken we de gecombineerde effecten van open arm richels en transparantie van gesloten arm muren op de experimentele gedrag op de doolhof-12. Ratten aanzienlijk veel minder tijd doorgebracht op open armen zonder richels dan op open armen met richels (F [1, 60] = 13.49, P = 0.0005) (figuur 2A). Vergelijkbare resultaten werden ook gevonden voor het aantal items in de open armen (F [1, 60] 11.17, P
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Naarmate het aantal patiënten met psychiatrische stoornissen, met inbegrip van angststoornis, toeneemt, is het belangrijk voor de ontwikkeling van geavanceerde onderzoeken naar het inzicht van het fundamentele mechanisme van angst. Om dit te bereiken, is het ook belangrijk voor het optimaliseren van de experimentele procedures. Daarom, naar verbetering van de toepassing van de verhoogde plus doolhof test, wij hebben aangetoond dat het effect van arm functies op experimentele resultaten met behulp van ratten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedank Mr. Akihiro Hirano voor zijn hulp bij het opstellen van de aangepaste apparatuur. De auteurs bedank Mr. Kosuke Takahashi en Mr. Shingo Nakajima voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door onderzoek naar de risico's van chemische stoffen, gezondheid en laboratorium wetenschappen onderzoekssubsidies, ministerie van gezondheid, arbeid en welzijn, Japan (H25-KAGAKU-IPPANN-003) en onderzoek projectsubsidie A door het Instituut voor wetenschap en technologie Meiji Universiteit, Japan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Customized container (W1500 × D1500 × H2000 mm) | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
| Verlichting | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
| Elevated plus maze apparaat | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
| Digitale videocamera | Watec | WAT-250D2 | Elke geschikte videocamera kan worden gekoppeld aan een harddiskrecorder voor het opnemen van trackingprofielen. |
| Harddiskrecorder | TOSHIBA | RD-R200 | Elke geschikte harddiskrecorder kan worden aangesloten op de digitale videocamera. |
| Sprague-Dawley ratten | Charles River Laboratories Japan, Inc. | NA | Elke geschikte ratten kunnen worden gebruikt voor uw onderzoek |
| Standaard ratafwerk | Toyoriko | TP-105 | Elke geschikte ratafwerk kan worden gebruikt voor uw onderzoek |
| Instrument om lichtintensiteit te meten | AS ONE | 1-5818-02 | Elk geschikt instrument om lichtintensiteit te meten |
| EthoVision XT versie 8.0 | Noldus | NA | Elke geschikte software om diergehecht te meten |
| Diazepam | Taiyo Pharmaceutical Industry | 1124402A2061 | Elk geschikt medicijn kan worden gebruikt voor uw onderzoek |
| Tween 80 | Wako Pure Chemical Industries | 9005-65-6 | Elk geschikt medicijn kan worden gebruikt voor uw onderzoek |
Referenties
- Nestler, E. J. Role of the Brain's Reward Circuitry in Depression: Transcriptional Mechanisms. Int Rev Neurobiol. 124, 151-170 (2015).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284 (5420), 1670-1672 (1999).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 327 (1), 1-5 (1984).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Violle, N., Balandras, F., Le Roux, Y., Desor, D., Schroeder, H. Variations in illumination, closed wall transparency and/or extramaze space influence both baseline anxiety and response to diazepam in the rat elevated plus-maze. Behav Brain Res. 203 (1), 35-42 (2009).
- Hogg, S. A review of the validity and variability of the elevated plus-maze as an animal model of anxiety. Pharmacol Biochem Behav. 54 (1), 21-30 (1996).
- Martinez, J. C., Cardenas, F., Lamprea, M., Morato, S. The role of vision and proprioception in the aversion of rats to the open arms of an elevated plus-maze. Behav Processes. 60 (1), 15-26 (2002).
- Anseloni, V. Z., Brandao, M. L. Ethopharmacological analysis of behaviour of rats using variations of the elevated plus-maze. Behav Pharmacol. 8 (6-7), 533-540 (1997).
- Anseloni, V. Z., Motta, V., Lima, G., Brandao, M. L. Behavioral and pharmacological validation of the elevated plus maze constructed with transparent walls. Braz J Med Biol Res. 28 (5), 597-601 (1995).
- Hagenbuch, N., Feldon, J., Yee, B. K. Use of the elevated plus-maze test with opaque or transparent walls in the detection of mouse strain differences and the anxiolytic effects of diazepam. Behav Pharmacol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Fernandes, C., File, S. E. The influence of open arm ledges and maze experience in the elevated plus-maze. Pharmacol Biochem Behav. 54 (1), 31-40 (1996).
- Horii, Y., Kawaguchi, M. Higher detection sensitivity of anxiolytic effects of diazepam by ledge-free open arm with opaque walled closed arm elevated plus maze in male rats. Behav Brain Res. 294, 131-140 (2015).
- Santos, R. O., et al. Evaluation of the effect of acute sibutramine in female rats in the elevated T-maze and elevated plus-maze tests. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 114 (2), 181-187 (2014).
- Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Dev Psychobiol. 52 (8), 731-739 (2010).
- Horii, Y., et al. Male Hatano high-avoidance rats show high avoidance and high anxiety-like behaviors as compared with male low-avoidance rats. Exp Anim. 61 (5), 517-524 (2012).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).
- Yang, Y., et al. Behavioral and pharmacological investigation of anxiety and maternal responsiveness of postpartum female rats in a pup elevated plus maze. Behav Brain Res. 292, 414-427 (2015).
- Albani, S. H., et al. Behavior in the elevated plus maze is differentially affected by testing conditions in rats under and over three weeks of age. Front Behav Neurosci. 9, 31(2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
