Een basisprotocol te beoordelen van de giftigheid van chemische stoffen in een model dier, Caenorhabditis elegans, wordt beschreven. De methode is geschikt en nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, alsook wat betreft de risico-evaluatie van verschillende milieuverontreinigende stoffen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meten van het Effect van chemische stoffen op de groei en voortplanting van Caenorhabditis elegans
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Toxicologische evaluatie is van cruciaal belang voor het inzicht in de effecten van chemische stoffen op levende organismen op gebied van fundamentele en toegepaste biologische wetenschappen. Een niet-zoogdier bodem ronde worm, Caenorhabditis elegans, is een waardevolle modelorganisme voor toxicologische studies vanwege haar gemak en gebrek aan dierenethiek kwesties vergeleken met zoogdieren dierlijke systemen. In dit protocol, wordt een gedetailleerde procedure voor de toxicologische evaluatie van chemische stoffen in C. elegans beschreven. Een klinische anticancer geneesmiddel, etoposide, die richt zich op menselijk topoisomerase II en DNA-replicatie van menselijke kankercellen remt, werd geselecteerd als een model chemische testen. Leeftijd-gesynchroniseerde C. elegans eieren werden blootgesteld aan dimethylsulfoxide (DMSO) of etoposide, en dan de groei van C. elegans elke dag voor 4 dagen werd bewaakt door de stereomicroscoop observatie. Het totale aantal eieren gelegd vanaf C. elegans behandeld met DMSO of etoposide werd ook geteld met behulp van de stereomicroscoop. Etoposide behandeling sterk beïnvloed de groei en voortplanting van C. elegans. Door vergelijking van het totale aantal eieren gelegd van wormen met verschillende behandeling perioden van chemische stoffen, kan worden besloten dat de giftigheid voor de voortplanting van chemische stoffen op de voortplanting van C. elegans omkeerbaar of onomkeerbaar is. Deze protocollen kunnen nut zijn voor zowel de ontwikkeling van verschillende drugs en de risico-evaluatie van toxische stoffen in het milieu.
Inleiding
Toxicologische evaluatie is essentieel voor de ontwikkeling van farmaceutische producten, nutraceuticals, en cosmeceuticals, evenals de risico-evaluatie van verschillende milieu-toxines. Het knaagdier model is een van de meest populaire in vivo de experimentele systemen voor deze studie toxicologie; Als alternatief, bij niet-zoogdieren organismen zoals C. elegans zijn ook op grote schaal gebruikt. Bij niet-zoogdieren toxicologische evaluatiemodellen zijn gunstig vanwege niet alleen dierlijke ethische kwesties, maar ook hun gemak en nut gezien van kosteneffectiviteit, onderhoudbaarheid, snelheid en reproduceerbaarheid1,2 ,3,4.
C. elegans, een bodem ronde worm, als een dier model in diverse fundamentele en toegepaste biologie en scheikunde onderzoek is benut. Het is een 1 mm lange, transparante nematode, die gewoon in vaste of vloeibare Nematode groei Media (NGM) gevoed met de bacteriële stam Escherichia coli OP50 wordt onderhouden. C. elegans heeft een korte levenscyclus en wild-type N2 C. elegans ongeveer 300 eieren legt. Daarom is het gemakkelijk om te worden gebruikt als experimentele materialen3,4,5doorgegeven. C. elegans heeft ook wijd gebruikt in de toxicologische studies van veel drugs en milieuverontreinigende6,,7,,8,9.
Omdat veel antikanker geneesmiddelen snel scheidslijn kankercellen gericht, kunnen ze ook beschadigen snel normale cellen zoals beenmerg, intestinaal epitheel en haarfollikel cellen verdelen. Bijvoorbeeld richten topoisomerase remmende geneesmiddelen op het proces van de replicatie van DNA van kankercellen; ze remmen dus ook snel normale cellen verdelen. Elk levend organisme heeft topoisomereasen, en deze topoisomerase remmers waarschijnlijk gevolgen milieu ecosystemen6,10,11. Dus is een drug toxicologische evaluatie platform met behulp van een model dier waardevol voor zowel de ontwikkeling van geneesmiddelen en de milieurisicobeoordeling.
In dit artikel beschrijven we de gedetailleerde protocollen om te testen van de toxiciteit van etoposide, oftewel een klinische antikanker agent die doelstellingen topoisomerase II, als een model giftige chemische stof in C. elegans. Voor dit doel beschrijven we de meetmethode van lichaamsgrootte en het totale aantal eieren gelegd in C. elegans etoposide behandeld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: het hele experiment moet worden uitgevoerd in een schone geïsoleerde laboratorium bewaard bij 20 ° C met laag stof en minimalisering van de verontreiniging tijdens het worm en bacteriële behandeling. Voor dit doel, experimenten moeten worden uitgevoerd onder de vlam van een alcohol-lamp of met behulp van een schone bankje.
1. onderhoud van C. elegans en ei voorbereiding voor de chemische Test
- behouden C. elegans N2 (var. Bristol) op een NGM agarplaat gevoed met live E. coli OP50 bij 20 ° C 12 , 13.
- Voorbereiden leeftijd-gesynchroniseerde eieren met een bleekwater oplossing behandeling 5 of de tijd ei legdatum methode 6 , 14 , 15.
Opmerking: voordat ei voorbereiding, jas de etoposide-bevattende NGM plaat met warmte-geïnactiveerd E. coli OP50 zoals hieronder beschreven. Warmte-geïnactiveerd E coli OP50 wordt gebruikt om te minimaliseren van de metabole activiteit van E. coli 6 , 16.
2. Voorbereiding van warmte-geïnactiveerd E. coli OP50 op Feed C. elegans tijdens de Test op reproductietoxiciteit over
- 500 mL dubbele gist trypton (DYT) voedingsbodem bereiden zoals beschreven in tabel 1 en enten van een één kolonie van E. coli OP50 gekweekt op een agar Luria Bertani (LB) plaat 5.
- De OP50 E. coli in een schudden incubator voor 14u bij 37 ° C en 150 rpm Incubeer.
- Na het centrifugeren voor 30 min op 3,220 x g en 20 ° C, verwijderen van alle bovenstaande DYT middellange en voeg een pre mengsel van 25 mL S-buffer, 250 µL van 1 M MgSO 4 en 25 µL van 5 mg/mL cholesterol (opgelost in ethanol). Al deze oplossingen zijn steriele.
- Resuspendeer de bacteriën en deze overbrengen naar een wegwerp plastic buis van 50 mL.
- Voor de warmte-inactivering, Incubeer de geresuspendeerde E. coli OP50 in een waterbad gedurende 30 minuten bij 65 ° C.
- Afkoelen tot kamertemperatuur en winkel bij 4 ° C tot gebruik. Dit kan worden opgeslagen voor maximaal een maand.
3. Voorbereiding van NGM platen bevattende hetzij 1% DMSO of 750 µM Etoposide
- voorbereiden twee schone 200 mL glazen flessen. Voeg 0.6 g NaCl, 0,5 g pepton, 3,4 g agar, en 195 mL gedestilleerd water en een magneetroerder tot één fles. Een magneetroerder toevoegen aan de andere lege fles.
- Autoclaaf deze twee flessen voor 15 min bij 121 ° C, en dan koel neer de flessen in een waterbad gedurende 30 minuten bij 55 ° C.
- Toevoegen van 0,2 mL 1 M CaCl 2, 0.2 mL 5 mg/mL cholesterol, 0.2 mL 1 M MgSO 4 en 5 mL van de 1 M KPO 4 (al deze oplossingen zijn steriel) en dan meng ze door magnetische roeren op een hete plaat op 55 ° C. Het gemengde NGM medium verdeel
- in twee flessen met hetzelfde volume (van elke 100 mL). Vervolgens 1 mL van DMSO toevoegen aan een fles, meng opnieuw met behulp van de magnetische roeren. Bewaar de andere fles in een waterbad bij 55 ° C tot en met de volgende stap. Aliquot 3 mL van de DMSO-bevattende middellange tot elke 35 x 10 mm 2 petrischaal. Ongeveer 33 DMSO-bevattende NGM platen kunnen worden gemaakt van deze stap.
- Mix van de andere fles met behulp van de magnetische roeren, voeg 1 mL van 75 mM etoposide (stock opgelost in DMSO), meng opnieuw en herhaal de aliquote procedure (stap 3.4). Ongeveer 33 etoposide (750 µM)-bevattende NGM platen kan worden gemaakt van deze stap.
Opmerking: In de gecorreleerde eerdere papier 6, we getest 0, 250, 500 en 1000 µM van etoposide. Op basis van die gegevens, kozen we voor de 750 µM van etoposide dosis in deze paper. - Cool down van de chemische stof bevattende NGM platen tot kamertemperatuur door hen te verlaten bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 3 uur en hen bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
Opmerking: In het geval van lichtgevoelige chemicaliën, afdekken licht om te minimaliseren van de licht-geïnduceerde decompositie.
Opmerking: Pas desgewenst een normale NGM plaat zonder chemicaliën voor het ei leggen assay, die kan worden uitgevoerd met behulp van twee verschillende chemische behandeling voorwaarden zoals hieronder beschreven. - Voeg 100 µL van warmte-geïnactiveerd E. coli OP50 (zoals beschreven in sectie 2) en op elke plaat NGM verspreid. Laat droog overnachting in een incubator C. elegans bij 20 ° C voor de chemische test
4. Meting van C. elegans groei
- overdracht van de leeftijd-gesynchroniseerde C. elegans eieren aan de plaat van de NGM aangevuld met 1% DMSO of 750 µM etoposide.
- Incubate C. elegans in een incubator bij 20 ° C voor 4 dagen. De wormen met een stereomicroscoop observeren en microscopische beelden nemen elke dag. Meestal is 20 X vergroting (1 X objectief, vergroting van de zoom 2 X en 10 X oculair lens) geschikt voor de observatie van de groei van C. elegans. Ook nemen een microscopische opname van de Microscoop fase micrometer voor de worm grootte kalibratie.
Opmerking: Honger heeft invloed op de toxiciteitstest. Daarom voeden met voldoende bacteriën of aanpassen van de overgedragen C. elegans ei nummers aan het begin. Observeren tot 3 dagen uit te sluiten van de mogelijkheid van hongersnood. - Meten van de lichaamslengte van C. elegans behandeld met DMSO of etoposide op elk tijdstip ImageJ softwarematig.
Opmerking: Voor elk monster meting, 50 wormen zijn voldoende voor de statistische analyse.- In ImageJ, open de Microscoop fase micrometer afbeelding (' bestand ' → ' Open ').
Opmerking: Het beeld van de micrometer en worm beelden (stap 4.2) moet de dezelfde vergroting. - Een lijn van 1.000 µm op de micrometer kalibratie afbeelding slepen met behulp van ' rechte lijn ' hulpmiddel.
- Klik ' analyseren ' → ' Set schaal ' en input van 1.000 en µm in de ' bekend afstand ' vak en ' lengte-eenheid ' vak, respectievelijk. Controleer ' Global ' en klik op ' OK '.
- Open de worm afbeeldingen (' bestand ' → ' Open '). Tekent een lijn langs de functie van elke worm met ' vormlijn ' gereedschap. Het lichaam lengtegegevens verkrijgen door te klikken op ' analyseren ' → ' maat '.
- Herhaal deze stappen voor 50 wormen.
- In ImageJ, open de Microscoop fase micrometer afbeelding (' bestand ' → ' Open ').
5. C. elegans ei leggen Assay
- de leeftijd-gesynchroniseerde Incubate eieren op de NGM plaat met DMSO of etoposide voor 64 h (voor de eerste geboorte) tot de jonge volwassen stadium bij 20 ° C.
Opmerking: Het is optioneel gebruik van de wormen uit de groei meting experimenten. Het is handig om te doen van de meting van de groei en ei legdatum assay samen. - De volwassen wormen 5 overbrengen naar de nieuwe NGM platen zonder chemicaliën (voorwaarde 1, chemische behandeling binnen een bepaalde periode van tijd, van eieren naar jonge volwassen fase) of nieuwe NGM plaat met de dezelfde chemische voorbehandeling (voorwaarde 2, voortdurende blootstelling van chemische stoffen via de algemene experimentele periode), en ze vervolgens uit te broeden voor 24 h.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om wordt gerepliceerd met behulp van 3-5 NGM platen voor elke behandeling; deze wordt gerepliceerd kunnen worden gebruikt voor statistische analyse. - Overbrengen naar de nieuwe plaat van NGM zoals hierboven beschreven, en het aantal eieren elke dag. Tellen van de wormen die kroop uit, stierf, en werden intern LuikEd.
- Herhaal deze stappen totdat de wormen geen meer eieren, meestal in 5 dagen leggen.
- Berekenen van het aantal per worm van elke plaat gelegde eieren, en elke dag voor 5 dagen om te bepalen van het totale aantal gelegde eieren van deze waarden optellen.
Opmerking: Sluit het aantal wormen die verkend af en intern uitgebroed uit de berekening.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De behandeling van etoposide (24-96 h) achterlijk aanzienlijk de groei van C. elegans. Na 96 uur incubatie groeide etoposide behandeld wormen tot 0,86 mm in lengte, terwijl de voertuig-behandelde wormen tot 1.04 mm (Figuur 1 groeide). Groei retardatie werd ook blijkbaar waargenomen onder de stereomicroscoop observatie (Figuur 2). We begonnen om te zien van eieren uit de voertuig-behandelde wormen bij 72 h incubatietijd. ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel beschrijven we de evaluatie van de toxiciteit van chemicaliën in C. elegans, een bodem nematode, met behulp van etoposide als een toxische voorbeeld. Voor dit doel gebruiken we twee experimentele omstandigheden. In de eerste set, C. elegans werden geteeld op etoposide met platen van eieren naar de jonge volwassen fase, en vervolgens de wormen werden toegestaan om eieren te leggen op normale NGM platen zonder chemicaliën. In de tweede experimentele set, werden C. elegans voortdure...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de Korea Instituut voor wetenschap en technologie intramurale onderzoeksbeurs (2E27513) en de hoge toegevoegde waarde voedsel technologie ontwikkeling programma (IPET) gefinancierd door het ministerie van landbouw, voedselvoorziening en Plattelandszaken (315067-03).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
Referenties
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , In Press (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667(2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152(2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563(2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445(2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919(2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321(2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
