Methodenartikel

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

DOI:

10.3791/56444

⸱

16 november 2017

 ,  , 
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke norovirus lijders aanzienlijke volksgezondheid en economische verliezen wereldwijd. Opkomende in vitro teelt voorschotten gelden niet nog voor routinematige opsporing van het virus. De huidige detectie en kwantificering technieken, die voornamelijk afhankelijk zijn van nucleïnezuur amplificatie, discrimineren niet besmettelijke uit niet-besmettelijke virale deeltjes. Het doel van dit artikel is om specifieke details over recente vorderingen in de technieken samen worden gebruikt om te verwerven verdere informatie over de status van de infectiviteit van virale deeltjes. Een techniek omvat de beoordeling van de binding van een norovirus ssDNA aptamer te capsids. Aptamers hebben het voordeel dat het gemakkelijk wordt gesynthetiseerd en gewijzigd, en zijn goedkoop en stabiel. Een andere techniek, dynamisch licht verstrooiing (DLS), heeft het voordeel van Eiwitmantel gedrag optreedt in oplossing. Elektronenmicroscopie zorgt voor visualisatie van de structurele integriteit van de virale capsids. Hoewel veelbelovend, zijn er enkele nadelen aan elke techniek, zoals niet-specifieke aptamer binding aan positief geladen moleculen van monster matrices, eis van gezuiverde Eiwitmantel distributielijsten en arme gevoeligheid voor elektronenmicroscopie. Niettemin, als deze technieken worden gebruikt in combinatie, het lichaam van de geproduceerde gegevens vindt u uitgebreidere informatie over norovirus Eiwitmantel integriteit die kan worden gebruikt voor het afleiden van de infectiviteit, informatie die essentieel is voor een nauwkeurige evaluatie van inactivatie methoden of interpretatie van virusdetectie. Dit artikel bevat de protocollen voor het gebruik van deze methoden te discrimineren besmettelijke menselijke norovirus deeltjes.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke norovirus is verantwoordelijk voor een aanzienlijke volksgezondheid last wereldwijd, waardoor ongeveer 685 miljoen ziekten en 212,000 doden jaarlijks1, aan een kostprijs in de miljarden dollars2,3. Vandaag, omvat norovirus detectie en kwantificering genoom versterking en/of ligand-gebaseerde platforms. Eerstgenoemde is over het algemeen de voorkeur, want het is gevoeliger, kwantitatieve informatie, en over het algemeen lagere risico van valse positieve resultaten4 heeft. De meest voorkomende norovirus detectie en kwantificering genoom amplificatie techniek is reverse-transcriptase kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Omdat het richt zich op en een klein segment van het menselijke norovirus genoom versterkt, RT-qPCR alleen is niet in staat zijn van discriminatie tussen besmettelijke en niet-infectieuze deeltjes, als vrije genomic RNA, beschadigde capsids met genoom, en capsids met dodelijk gemuteerd/afgekapt genoom kunnen nog worden versterkt door RT-qPCR. Terwijl twee nieuwe in vitro teelttechnieken voor menselijke norovirus5,6 hebben onlangs gemeld, beide nog steeds vertrouwen op RT-qPCR voor virus kwantificering en zijn nog niet haalbaar methoden voor routinematige klinische/milieu testen voor menselijke norovirussen. RT-qPCR blijft dus, de gouden standaard voor het testen van de klinische/milieu.

Andere methoden in vitro zijn ontwikkeld in een poging om de status van de infectiviteit van norovirus deeltjes beter te schatten. Deze methoden kunnen in het algemeen worden gecategoriseerd als die waarmee de integriteit van het norovirus Eiwitmantel en die evaluatie genoom integriteit. De voormalige aanpak is meer populair. Een veelgebruikte methode is RNase Voorbehandeling voorafgaand aan de winning van virale genomic RNA, maar dit houdt geen rekening met virale deeltjes, die intact blijven, maar niet over de mogelijkheid om te binden host receptoren/co-factoren, evenals virale deeltjes die hebben dodelijk gemuteerd of zijn afgekapt of beschadigd marginaal genoom7. Eiwitmantel integriteit kan ook worden geëvalueerd op basis van het vermogen van het virus te binden aan menselijke norovirus co-receptor/co-factoren, die koolhydraten histo-bloed groep antigenen (HBGAs) genoemd. HBGAs in de intestinale epitheliale cellen van de gastheer aanwezig zijn als onderdeel van glycoproteïnen of glycolipiden (onder meerdere andere weefsels) en in lichaamsvloeistoffen zoals speeksel uitgescheiden kan worden. Darmen bacteriën die HBGA-achtige stoffen bevatten op hun oppervlakken hebben ook aangetoond dat het menselijke norovirus8,9,10te binden, en dergelijke interactie kunnen bevorderen norovirus infectie5. Het basisconcept van het gebruik van HBGA-bindende is dat alleen virale deeltjes kunnen binden met de vermeende receptor/co-factor zou kunnen cellen te infecteren. Meerdere studies suggereren dat kraal gebaseerde HBGA bindende voorafgaand aan versterking van de nucleïnezuur een veelbelovende methode voor infectiviteit discriminatie11,12,13,14is, 15,16. Een grote uitdaging met betrekking tot de HBGAs is dat geen enkel HBGA type alle menselijke norovirus genotypen kunt binden. Om aan te pakken dit, is varkens maag mucin, waarin HBGAs, gebruikt in plaats van gezuiverde HBGA koolhydraten in het belang van gemak van synthese, consistentie, en lagere kosten.

Een recente publicatie door Moore et al. 17 introduceerde een reeks nieuwe technieken voor het schatten van menselijke norovirus Eiwitmantel integriteit. In plaats van HBGAs, Moore et al. 17 binding van een grotendeels reactief nucleïnezuur aptamer (M6-2)18 en in het algemeen reactief monoklonaal antilichaam (NS14)19 tot en met warmtebehandelde GII.4 Sydney norovirus capsids (virusachtige deeltjes of experimentele) onderzocht en vergeleken dit om de binding aan synthetische HBGAs. Nucleic zuur-aptamers zijn korte (~ 20-80 nt) één gestrande nucleïnezuren (ssDNA of RNA) die Vouw in unieke driedimensionale structuren als gevolg van hun volgorde en binden van een doel. Omdat ze nucleïnezuren, zijn ze minder duur; gemakkelijk chemisch gesynthetiseerde, gezuiverd en gemodificeerde; en stabiele te verwarmen. Verscheidene verslagen van aptamers gegenereerd tegen norovirussen bestaat, met een aantal van hen tonen brede reactiviteit aan een verscheidenheid van stammen18,20,21,22. Bij wijze van voorbeeld, Moore et al. 17 aangetoond dat aptamer M6-2 gebonden aan gezuiverde, geassembleerd menselijke norovirus capsids (experimentele) en gedragen op dezelfde manier aan HBGA in de afhankelijkheid van de virale Eiwitmantel om hogere orde (bijv, secundaire en tertiaire) structuur voor eiwit binding aan het optreden. Aan de andere kant, een aanzienlijk deel van norovirus VLP binding aan antilichaam NS14 bleef na capsids werden volledig gedenatureerd. Evaluatie van norovirus bindend in de studie van Moore et al. 17 werd gedaan met behulp van een eenvoudige, plaat gebaseerde methode ELISA, vergelijkbaar met de uitzondering dat aptamers worden gebruikt in plaats van antilichamen (vandaar de methode werd genoemd ELASA). Deze hoge doorvoer experimentele methode werd gebruikt om de effecten van verschillende behandelingen op de norovirus Eiwitmantel, werk dat is waardevol voor het begrijpen van het mechanisme van virale inactivatie bij blootstelling aan fysische of chemische stressoren evalueren. Een nadeel van deze methode is echter de lagere gevoeligheid en gebrek aan tolerantie voor matrix-geassocieerde verontreinigingen op hogere niveaus waardoor niet-specifieke binding door de aptamers.

Moore et al. 17 gebruikt een andere methode, dynamisch licht verstrooiing (DLS), voor controle van aggregatie van virale deeltjes naar aanleiding van warmtebehandeling. DLS wordt gebruikt bij het evalueren van de grootte van nanoparticle schorsingen en heeft uitgebreid naar eiwitten23,24 en virussen25,26,27. De intensiteit van de lichtverstrooiing door deeltjes in oplossing fluctueert als een functie van deeltjesgrootte, zodat voor de berekening van diffusie coëfficiënt en vervolgens deeltje diameter gevestigde formules gebruiken. De DLS-techniek kunt onderscheiden van de hydrodynamische diameter van verspreide deeltjes naar de nanoschaal, die maakt de ontdekking van verspreide virussen, individuele Eiwitmantel eiwitten of Dimeren en virus aggregaten op basis van grootte27. Virus aggregatie, vertegenwoordigd door een toename van de grootte van de deeltjes, is kenmerkend voor verlies van Eiwitmantel integriteit. Aangezien de Eiwitmantel is gedenatureerd en haar structuur verstoord, hydrofobe residuen worden blootgesteld en veroorzaken de deeltjes te plakken aan elkaar en vormen van aggregaten. Distributielijsten kunnen worden gebruikt voor het meten van deeltjesgrootte na een opgegeven behandeling of de kinetiek van aggregatie in real-time17,28. Deze methode heeft het voordeel van het toestaan van waarneming van Eiwitmantel gedrag in oplossing maar vereist hoge concentraties van gezuiverde Eiwitmantel, die wellicht niet geheel representatief is voor het virus in zijn natuurlijke staat.

De laatste methode gebruikt door Moore et al. 17 was transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Hoewel deze methode gevoeligheid mist en geen kwantitatieve gegevens produceert, staat het voor de visualisatie van de effecten van verschillende behandelingen op de virale Eiwitmantel structuur. Hoewel nog niet ideaal voor klinische/omgevingsinstellingen, is het gebruik van deze methoden in combinatie waardevol inzicht in menselijke norovirus inactivatie. Het doel van dit artikel is bedoeld als diepgaande protocollen voor de plaat gebaseerde bindende assay (ELASA), Distributielijsten, en TEM voorbereiding methoden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van warmtebehandelingen die men op het norovirus Eiwitmantel in het kader van de behandelingen effecten op Eiwitmantel integriteit zoals gepresenteerd in Moore et al. 17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bindende Assay voor het evalueren van verlies van hogere Norovirus Eiwitmantel orderstructuur plaat gebaseerde

Opmerking: een zeer vergelijkbaar ELASA protocol bij degene die hier gepresenteerd is gepubliceerd 29, en soortgelijke ELASA testen zijn eerder gemeld als onderdeel van onderzoek elders 17 , 18 , 22 artikelen.

  1. Warmtebehandeling van menselijke norovirus GII.4 Sydney capsids
    1. verkrijgen gezuiverde menselijke norovirus grote Eiwitmantel proteïne (VP1) van GII.4 Sydney (toetreding: JX459908) in capsids geassembleerd.
      Opmerking: Capsids in de studie werden verkregen hoffelijkheid van R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
    2. Dilute capsids met 50 µg Fe/mL in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,2) tot een maximale hoeveelheid 15 µL in individuele afgetopte PCR buizen. Zorgt ervoor dat de buis ten minste 600 bevat ng van Eiwitmantel. Ervoor zorgen dat er 600 ng van Eiwitmantel per behandeling-ligand combinatie.
    3. Verwarm thermische cycler gewenste warmtebehandeling.
      Opmerking: voor de toepassing van dit protocol, behandeling bij 68 ° C gedurende verschillende tijden (0 - 25 min) werd gekozen.
    4. Verwarm een extra thermische cycler tot 4 ° C voor directe koeling. Buizen met Eiwitmantel oplossing aan de thermische cycler toevoegen voor de gewenste tijd. Onmiddellijk overdracht aan vooraf gekoelde 4 ° C cycler voor 5 min na Verwarming.
      1. Opnemen 95 ° C gedurende 5 minuten behandeling als een besturingselement gedenatureerde Eiwitmantel. Omvatten onbehandelde (23 ° C) Eiwitmantel oplossing als positieve controle. PBS met geen Eiwitmantel als een extra negatieve controle bevatten.
    5. Kort spin naar beneden in een centrifuge om alle druppels aan de onderkant van de buis en de oplossingen van de behandelde Eiwitmantel in PBS tot 3 µg/mL verdund. Ervoor zorgen dat er ten minste 200 µL van verdunde, behandelde Eiwitmantel (100 µL per putje).
  2. Toepassing 100 µL van Eiwitmantel oplossing aan elk putje, ervoor te zorgen er ten minste twee putten per behandeling. Bovendien bevatten 2 controleputjes met 100 µL PBS voor elke ligand; Dit biedt de extinctie van de achtergrond van de bepaling. De afdekplaat met een deksel, zegel de randen met parafin film ter vermindering van de verdamping, en laat die 's nachts op een schudden incubator bij 4 ° C of gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  3. Bereiden de buffer met blokkerend doordat de 5% afgeroomde melk vaste stoffen (g/v) in PBS met 0,05% Tween-20 (PBST).
  4. Verwijder de behandelde Eiwitmantel oplossingen van de plaat. Voeg 200 µL per putje van blokkeerbuffer toe. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts, verzegeld bij 4 ° C.
  5. Voorbereiden de ligand bindende oplossingen voor de biotinyleerd aptamer M6-2 18 , 29 en biotinyleerd synthetische HBGA bloed type A of biotinyleerd type H.
    1. Dilute de biotinyleerd aptamer tot 1 µM in nuclease-gratis water. Zorg ervoor dat er genoeg oplossing voor 200 µL totaal voor elke behandeling. Verdun de gekozen biotinyleerd HBGA tot 30 µg/mL in de blokkeerbuffer. Ervoor zorgen dat er genoeg oplossing voor 200 µL totale volume voor elke behandeling.
      Opmerking: Voor het gebruik van minder HBGA, 10 µg/mL HBGA in 0,25% afgeroomde melk-PBST kan worden vervangen. Concentraties voor zowel HBGA als biotinyleerd M6-2 zijn eerder geoptimaliseerd en gemeld.
  6. Verwijderen blokkeerbuffer en wassen van de platen 3 keer met 200 µL per putje PBST. Pat van de plaat ondersteboven op steriele papieren handdoeken drogen het resterende vocht.
  7. Voeg 100 µL per putje van de ligand bindoplossingen, ervoor te zorgen dat er 2 putten per warmtebehandeling-ligand combinatie. De plaat voorzien van een deksel op een roteerschudapparaat op ongeveer 60 rpm gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
    Opmerking: Zorg 2 putten van de onbehandelde capsids en volledig gedenatureerde capsids voor elke ligand als positieve en negatieve controles, respectievelijk. Bovendien bevatten 2 " geen Eiwitmantel " putten voor elke ligand als de plaat achtergrond controle.
  8. Verwijder de ligand-oplossingen en was de putjes goed 3 keer met 200 µL per putje PBST. Pat van de plaat ondersteboven op steriele papieren handdoeken drogen resterende vocht.
  9. Voeg 100 µL per putje van oplossing van 0,2 µg/mL streptavidine-mierikswortelperoxidase in PBS. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden op een roteerschudapparaat.
    Opmerking: Andere streptavidine-horseradish peroxidase geconjugeerde zal hebben verschillende concentraties. Raadplegen van de gebruiker ' s handleiding voor de ideale bereik van concentraties voor ELISA toepassingen van enzym en zorg ervoor dat het is optimale.
  10. Verwijder de geconjugeerde oplossing. 3 keer wassen met 200 µL per putje PBST. Pat van de plaat ondersteboven op steriele papieren handdoeken drogen resterende vocht.
  11. Voeg 100 µL per putje 3,3 ', 5,5 '-tetramethylbenzidine (TMB) substraat, en de kleuren te ontwikkelen voor 5-15 min. Let op negatieve controle putten voor een kleur en moet consequent ontwikkelen voor hetzelfde tijdstip tussen repliceren platen zijn toegestaan. Zich bewust zijn van het bereik van de extinctie van de plaat-lezer gebruikt, evenals.
    Opmerking: De ontwikkelende tijden afwijken op basis van de kwaliteit van de gebruikte liganden/reagentia.
  12. Stoppen met de ontwikkeling van de reactie met 100 µL per putje 1M fosforzuur. Meteen lezen plaat bij 450 nm. Opslaan van de gegevens.
    Opmerking: Invoering van het zuur in het algemeen vertraagt de reactie drastisch maar niet volledig stopt het. Laat niet de gestopte plaat voor een uitgebreide hoeveelheid tijd vóór het lezen van de extinctie.

2. Analyse van de plaat gebaseerde Assay resultaten

  1. de rauwe extinctie-gegevens opslaan in een spreadsheet-programma. Verticaal de gemiddelde absorptie voor elk goed paar met de specifieke behandeling en de ligand produceren. Gebruiken deze gemiddelden voor alle latere analyses.
    Opmerking: Vergelijk beide goed verticaal absorptie om er zeker van te zijn dat geen paren van putten hebben sterk uiteenlopende waarden.
  2. Te analyseren van de absolute Eiwitmantel integriteit (alle bindende), aftrekken van de ruwe extinctie van de " geen Eiwitmantel " controle van elke andere extinctie Voorbeeldwaarde.
    Opmerking: U kunt ook verlies van bindende als gevolg van verlies van hoger volgorde (secundaire, tertiaire en quaternaire) structuur kan direct worden geanalyseerd. In plaats van af te trekken van de extinctie van de negatieve (geen Eiwitmantel) controle, aftrekken van de waarde van het besturingselement volledig gedenatureerde Eiwitmantel. Dit verwijdert alle bindende signaal als gevolg van niet-specifieke binding met het apparaat, alsmede bindend te wijten aan de reeks Eiwitmantel. HBGA en aptamer M6-2 wordt gebruikt weinig bindend voor volledig gedenatureerde Eiwitmantel, zodat beide methoden vergelijkbare resultaten oplevert. Vals positief signaal toegeschreven aan niet-specifieke aptamer bindend moet worden beschouwd wanneer het kiezen van welke analyse gebruiken.
  3. Met de negatieve of gedenatureerde controle-aangepast verticaal absorptie, deelt u de behandeling verticaal absorptie door hun respectieve positieve (geen behandeling) controle verticaal absorptie en vermenigvuldigen door 100. Dit geeft het percentage van het signaal van de behandelde Eiwitmantel ten opzichte van de onbehandeld controlegewas.
  4. Naar schatting van de mate van bindende signaal voor elke ligand te wijten aan de reeks Eiwitmantel aftrekken de " geen Eiwitmantel " negatieve controle van de verticaal van de oorspronkelijke absorptie, en nemen de gecorrigeerde extinctie van de gedenatureerde Eiwitmantel. Verdeel dit door de gecorrigeerde extinctie van de positieve controle-signaal, en kunt u deze vermenigvuldigen met 100. Dit geeft de schijnbare percentage van signaal als gevolg van ligand binding aan gedenatureerde Eiwitmantel/Eiwitmantel volgorde.

3. Distributielijsten voor het opsporen van Virus aggregatie na de warmtebehandeling

Opmerking: De volgende stappen mogelijk specifiek voor de software en instrument gebruikt, maar kan worden aangepast en toegepast op soortgelijke apparaten.

Gebruik van de software van het instrument van
  1. maken een nieuwe grootte SOP in de DLS: materiaal = eiwit, Dispersant = PBS, temperatuur = 25 ° C, equilibratietijd = 0 sec, celtype = wegwerp cuvette (kleine volume, ZEN0040), meting hoek = 173° Backscatter, Duur van de meting = automatisch, aantal metingen = 3, vertraging tussen metingen = 0 sec, gegevensverwerking: analyse model = General-Purpose (normale resolutie). Gebruik de standaardinstellingen voor alle andere parameters.
  2. Selecteer de groene uitvoering pijl binnen de software en de naam van het monster.
  3. Stappen 1.1.1 tot 1.1.4 voor de warmtebehandeling van experimentele.
  4. Dilute de hitte behandeld experimentele 1:10 in 1 x PBS voor een eindconcentratie van 5 µg/mL. (Optioneel) Filteren van het monster met een 1 µm poriegrootte verwijderen stofdeeltjes; DLS is zeer gevoelig voor stof, zoals grote deeltjes veel meer licht dan kleine deeltjes verstrooien.
  5. Breng 50 µL van verdunde experimentele in een klein volume wegwerp cuvette. De cuvette invoegen de monsterkamer van het instrument.
  6. De run start en gebruik de ' Correlogram ', ' Cumulants Fit ', en ' deskundig advies ' tabbladen te evalueren van de kwaliteit van de gegevens.
    1. Tijdens de run, Controleer of de indexwaarde polydispersiteit minder dan 0,3 is, vertegenwoordigen een kwaliteit meting. In de ‘ Multi-View ’ tab, zorg ervoor dat de correlatiecoëfficiënt is constante en dicht bij, maar niet meer dan 1, in een korte tijd, en druppels uit scherp op 0 op een later tijdstip, karakteristiek van deeltjesgrootte. Gebruik de ‘ deskundig advies ’ tabblad voor feedback over de kwaliteit van de gegevens tijdens de metingen.
    2. Na de meting is voltooid, Controleer nogmaals dat de indexwaarde van de polydispersiteit is minder dan 0,3. Ervoor te zorgen dat de cumulants passen lijn volgt de gegevenspunten nauw in de ‘ Cumulants passen ’ tab.
  7. Neemt het gemiddelde van de Z-gemiddelde deeltjesgrootte diameter gemeld voor elke meting als de deeltjesgrootte van elk monster. Uitzetten van de diameter in nm vs. Temperatuurin ° C.

4. Distributielijsten voor speurder Virus Aggregation in Real Time

Opmerking: de volgende stappen mogelijk specifiek voor de software en instrument gebruikt, maar kan worden aangepast en toegepast op soortgelijke apparaten.

Gebruik van de software van het instrument van
  1. maken een nieuwe grootte SOP in de DLS: materiaal = eiwit, Dispersant = PBS, temperatuur = als gewenst, equilibratietijd = 0 sec, celtype = kwarts cuvette, meting hoek = 173° Backscatter, meting duur = automatische, Aantal metingen = 50 (kan worden verhoogd of verminderde afhankelijk van globalisatie tarief), vertraging tussen metingen = 0 sec, gegevensverwerking: analyse model = meerdere smalle modi (hoge resolutie). Gebruik de standaardinstellingen voor alle andere parameters.
  2. Selecteer de run pijl binnen de software te openen en de naam van een nieuw monster, en toestaan dat het instrument om te bereiken van het temperatuur evenwicht.
  3. Schorten de experimentele in 1 X PBS in een buis van de microcentrifuge bij een concentratie van 5 µg/mL en een volume van 200-500 µL. Vortex opschorting.
  4. Spin naar beneden van de opschorting van de VLP voor 5-10 s in een tafelblad centrifuge op ambtshalve gas. Dit helpt om te voorkomen dat de zeepbel formatie tijdens de warmtebehandeling dat met grootte metingen interfereert.
  5. Overdracht de VLP schorsing naar een klein volume kwarts cuvette-Vermijd bubbels en Pipetteer langzaam tegen de muur van de Cuvet. Nadat het instrument stand evenwicht van de temperatuur gekomen tot, de cuvette in de monsterkamer invoegen.
  6. Wacht 10 s voor de temperatuur van het monster tot equilibreer, start de run. Een timer aan het begin van de run te starten. Het stoppen van de timer op het einde van de eerste meting. Deze tijd als het eerste punt van de tijd in beslag nemen. Latere tijdstippen uit de tijd van de meting opgenomen door de software verkrijgen.
  7. Start van het uitvoeren en controleren van de correlogram, distributie passen en deskundig advies om te evalueren van de kwaliteit van de gegevens.
    Opmerking: De PDI niet noodzakelijkerwijs zal dat minder dan 0,3 voor deze metingen als het monster zit verwachte voor zitten polydisperse tijdens aggregatie.
    1. Zorg ervoor dat de correlatiecoëfficiënt is constante en dicht bij, maar niet meer dan 1 op korte tijd, en zet af scherp bij één of meer recentere tijden, karakteristiek van deeltjesgrootte.
    2. Zorg ervoor dat de verdeling passen lijn volgt de gegevenspunten nauw.
  8. Analyseren de groottegegevens.
    1. Bepalen telkens punt uit het verschil in tijd tussen elke meting en het oorspronkelijke tijdstip. De duur van de meting zijn niet allemaal precies hetzelfde.
    2. Met behulp van een verdeling van de intensiteit, de grootte van de pieken met de grootste gebieden voor elk punt meting/tijd opnemen.
    3. De diameters van de piek in nm vs. tijd in min. uitzetten

5. Bereiding van de monsters van de TEM

  1. verkrijgen koolstof ondersteuning film (nikkel) rasters ontworpen voor TEM.
    Opmerking: Raadpleeg de faciliteit van de core op aanbevolen reagentia en hun behandeling voor gebruik met de Microscoop faciliteit. Bewaar rasters in een doos met droogmiddel of een vacuuemcel tot een minimum beperken van blootstelling aan vocht.
  2. Scheuren ongeveer 5 x 5 cm stukken filtreerpapier. Verkrijgen van glas petrischalen en juiste zelfsluitende reverse pincet ontworpen voor gebruik in microscopie.
  3. Knip ongeveer 2,5 x 5 cm stukje van paraffine film. Plaats op de benchtop.
    4. Warmtebehandeling van norovirus GII.4 Sydney capsids
    2. de procedure warmte behandeling precies zoals hierboven beschreven in stappen 1.1.1 - 1.1.5 behalve: 10 mM HEPES (pH 7.4) gebruiken voor de behandeling in plaats van PBS en doen niet verder verdunnen met capsids na de behandeling (Houd oplossing bij 50 µg/mL). De daling van de gehele ~ 15 µL van behandelde Eiwitmantel oplossing op paraffine film Pipetteer.
  4. Pak van de rand van het raster met een pincet, waardoor ze te dicht op de rand te houden van het raster en plaats de raster koolstof-side-down op de top van de daling van de behandelde oplossing. Laat Incubeer gedurende 10 minuten zodat de Eiwitmantel te hechten aan het raster.
    1. Afhankelijk van de zuiverheid van het preparaat Eiwitmantel, voeg wasbeurten van de 10 mM HEPES oplossing indien nodig in de vorm van 10-15 µL druppels geplaatst in lijn na de behandelde Eiwitmantel druppel.
    2. Na 10 min, pick-up in het raster met de druppel. Schakel het raster bijna loodrecht op een stuk papier van de filter te pit weg de druppel. De druppel van 10-15 µL HEPES-buffer halen met het raster, houdt voor 30 s, dan wick weg met een ander stuk filtreerpapier aan wash.
  5. Een droplet 15 µL van 2% uranyl acetaat oplossing opleggen de paraffine-film in een leeg gebied.
    1. Halen de druppel uranyl acetaat met het raster ingedrukt voor 45 s. Wick weg de uranyl-acetaat, controleren of het verwijderen van de meeste van de oplossing. Plaats het raster koolstof-kant omhoog op een vel filtreerpapier, voorzichtig te zorgen dat het raster niet " stick " om het vocht op de pincet. Breng het filter met het raster op het in een open glazen petrischaaltje.
      Opmerking: Gebruik geen plastic petrischaaltjes, zoals de rasters via een elektrostatisch proces aangetrokken naar hen worden zal en vastgelopen aan dish.
  6. Herhaal voor alle behandelingen. Plaats de petrischaal helften met de rasters in een exsiccator 's nachts drogen voordat het observeren met TEM.
  7. Raadplegen de microscopie faciliteit in de respectieve instelling met betrekking tot de bereid rasters observeren. Sommige voorzieningen toestaan dat de gebruiker om te worden opgeleid over de werking van hun faciliteit ' s instrument. Specifieke details over de installatie en de observatie van een specifieke Microscoop is beyond het toepassingsgebied van dit artikel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De structurele integriteit van menselijke norovirus GII.4 Sydney capsids (experimentele) werd beoordeeld met behulp van verschillende nieuwe methoden, zoals gepresenteerd door Moore et al. 17. ten eerste, een experiment werd gedaan die de integriteit van de capsids als een functie van hun vermogen om te binden een vermeende receptor/co-factor (HBGA) of ssDNA aptamer (M6-2) werden vergeleken (Figuur 1). De getoonde resultaten z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol en de hier beschreven technieken bieden een middel om de beoordeling menselijke norovirus Eiwitmantel integriteit/functionaliteit. Deze methoden kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in de effecten van inactivatie behandelingen tegen het virus, en potentieel meer traditionele inactivatie evaluatiemethoden zoals RT-qPCR of plaque bepaling kunnen aanvullen. Bijvoorbeeld, biedt de evaluatie van chemische of fysische inactivatie door plaque assay alleen een zekere mate van virus i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de landbouw en voedsel onderzoek initiatief concurrerende Grant nr. 2011-68003-30395 van de United States Department of Agriculture, de nationale Instituut van de voedselvoorziening en de landbouw door middel van het NoroCORE-project. Voor open toegang gratis financiering werd verstrekt door het Amerikaanse ministerie van landbouw. We zouden graag bedanken Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) voor vriendelijk ons het gezuiverde capsids en Valerie Lapham voor haar hulp bij de TEM-beelden. Ook bedank we Frank N. Barry voor het helpen ons start de experimenten gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Plate-Based Binding Assay voor het evalueren van verlies van hogere orde Norovirus-capsidestructuur
96-well, medium-binding polystyreen EIA-plaatFisher (Costar)07-200-36
Deksel voor 96-well plaatThermo Fisher3098
Paraffine film (Parafilm)Thermo FisherPM999
1x PBS (pH 7.2)Life Technologies20012-050
Polysorbaat 20Sigma-AldrichP9416
1x PBS (pH 7.2) + 0,05% Polysorbaat 20N/AN/A
Gepuurde, geassembleerde humane norovirus GII.4 capsidenN/AN/A
Individuele 0,2 ml PCR-buizenGenesee Scientific22-154G
2 thermocyclersBio-Rad1861096
Mini centrifuge voor op tafelFisher Scientific12-006-901
Vlokken magermelkThermo FisherLP0031B
Synthetisch histo-bloedgroep type A-disaccharide, gebiotinyleerdGlycotech01-017
Gebiotinyleerd aptamer M6-2 (stockconcentratie 100 µM in nuclease-vrij water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’Integrated DNA TechnologiesN/A
Streptavidine-paardenradish peroxidase-conjugaat (ELISA-kwaliteit), We gebruiken Life Technologies SNN2004Life TechnologiesSNN2004
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substraat, kamertemperatuurThermo Fisher50-76-00
1 M fosforzuurN/AN/A
Microplaatlezer geschikt voor het lezen van 450 nmTecanInfinite m200 Pro
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Analyse van plate-based assay resultaten
Microsoft Excel of soortgelijk programmaN/AN/A
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dynamische lichtspreidingsexperimenten
Zetasizer ZSP, of een soortgelijk instrument voor deeltjesgrootteanalyseMalvern InstrumentsN/A
VortexFisher Scientific02-215-365
Kwarts cuvetHellma104-002-10-40
Klein volume wegwerp cuvet (om VLP-gebruik te verminderen)Malvern InstrumentsZEN0040
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Transmissie-elektronenmicroscopie monstervoorbereiding
Nikkel elektronenmicroscopie roosters met koolstof ondersteunende filmLadd Research10880-100
Zelfsluitende omgekeerde elektronenmicroscopie pincetTed Pella5372-NM
Kwaalitatief filterpapierSigma-Aldrich (Whatman)WHA1002055
Glazen petrischalenSigma-AldrichBR455743
100 mM stock HEPES-oplossing (pH 7.2)N/AN/A
2% uranylacetaatN/AN/A

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920(2015).
  2. Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
  3. Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
  4. Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770(2015).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
  7. Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
  8. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  9. Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124(2017).
  10. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586(2014).
  11. Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
  12. Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
  13. Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
  14. Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
  15. Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
  16. Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
  17. Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
  18. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
  19. Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
  20. Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087(2013).
  21. Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
  22. Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805(2014).
  23. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
  24. Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
  25. Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
  26. Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
  27. Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
  28. Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
  29. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
  30. Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
  31. Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
  32. Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
  33. Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
  34. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  35. Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
  36. Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
  37. Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Human NorovirusViral CapsidLigand BindingDynamic Light ScatteringTransmission Electron MicroscopyAptamer BindingCapsid IntegrityHeat TreatmentVirus InactivationCapsid Aggregation

Gerelateerde artikelen