Influenza neutraliserende antilichamen correleren met bescherming van influenza-infecties. Microneutralization testen meten van neutraliserende antilichamen in menselijke sera en worden vaak gebruikt voor menselijke influenza-serologie. We beschrijven een microneutralization assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 voor het meten van neutraliserende antilichamen titers voor hedendaagse 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) virussen na griepvaccinatie of infectie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meten van Influenza neutraliserende antilichamen reacties op A(H3N2) virussen in menselijke Sera door Microneutralization testen met behulp van MDCK-SIAT1 cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neutraliserende antilichamen tegen hemagglutinine (HA) van influenza-virussen worden beschouwd als het belangrijkste immuun mechanisme dat met bescherming van influenza-infecties correleert. Microneutralization (MN) tests worden vaak gebruikt voor het meten van neutraliserende antilichamen reacties in menselijke sera na griepvaccinatie of infectie. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cellen zijn het meest gebruikte cel substraat voor MN testen. Echter op dit moment circuleren 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) influenza virussen hebben verworven gewijzigd receptor bindende specificiteit. De cellijn van de MDCK-SIAT1 met verhoogde α-2,6 sialic galactose wordt op het oppervlak heeft bewezen om verbeterde infectiviteit en meer trouw replicaties dan conventionele MDCK cellen voor deze hedendaagse A(H3N2) virussen. Hier beschrijven we een MN assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 die is geoptimaliseerd om te kwantificeren van neutraliserende antilichamen titers voor deze hedendaagse A(H3N2) virussen. In dit protocol, worden warmte geïnactiveerd sera met neutraliserende antilichamen eerst serieel verdund, vervolgens geïncubeerd met 100 TCID50/goed van de A(H3N2)-influenzavirussen om antilichamen in de sera te binden aan de virussen. MDCK-SIAT1 cellen worden vervolgens toegevoegd aan het mengsel van virus-antilichaam en 18-20 h bij 37 ° C, 5% CO2 toe A(H3N2) virussen te infecteren MDCK-SIAT1 cellen ge¨ uncubeerd. Na een incubatieperiode van overnachting, platen worden opgelost en de hoeveelheid virus in elk goed wordt gekwantificeerd door een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) met behulp van anti-griep een nucleoproteïne (NP) monoklonale antilichamen. Neutraliserende antilichamen titer wordt gedefinieerd als de reciproque waarde van de hoogste serumverdunning waarmee ≥50% remming van de besmettelijkheid van het virus.
Inleiding
Influenzavirussen blijven morbiditeit en mortaliteit in de menselijke bevolking jaarlijks veroorzaken. HA is de grote oppervlakte glycoproteïne influenza virussen. Neutraliserende antilichamen gericht op HA zijn de belangrijkste immuun mechanisme dat met bescherming voor influenza infecties1,2 correleert. Hemagglutination inhibitie (HI) testen en MN vitrotests zijn twee methoden gebruikte voor het meten van antilichaam reacties in menselijke sera na de infectie of vaccinatie griep3. De HI-test meet antilichaam inhibitie van virus hemagglutination van rode bloedcellen en wordt beschouwd ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle influenzavirussen moeten worden behandeld volgens passende bioveiligheid niveau eisen (BSL-2 of hoger) als omschreven in de bioveiligheid op microbiologische en biomedische laboratoria (BMBL)12.
1. bereiding van reagentia en grondstof
-
Voorbereiden van de MDCK-SIAT1 cellen en steriele cel kweekmedium
- Voorbereiden van de MDCK-SIAT1 cel kweekmedium 500 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met hoge glucose, 10% v/v warmte geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 1 mg/mL G418 (II) sulfaat (b.v. G....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bepaling van de besmettelijkheid van het virusvoorraden is de eerste stap in de bepaling van MN. Figuur 2 illustreert de indeling van de plaat om te bepalen van de TCID50 de virusvoorraden. Voor virus bestanden met onbekende infectiviteit, kan het virus worden getitreerd uit meerdere pre verdunningen, bijvoorbeeld zowel 10-2 en 10-3, om te vangen de beste titratiecurve voor het berekenen van de besmettelijkheid van het virus. .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De bepaling van MN is een van de belangrijkste tests voor influenza serologie gebruikt voor het opsporen van antilichamen reacties na besmetting van de griep of vaccinatie. Titers gegenereerd op basis van MN tests worden vaak gebruikt als de primaire uitkomst van veel griep seroepidemiology studies. MN tests worden ook op grote schaal gebruikt voor sero-diagnose, en de evaluatie van de immunogeniciteit van het vaccin. Internationale inter lab studies zijn uitgevoerd om te vergelijken van MN testen uitgevoerd in meerdere .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs melden geen belangenconflict. De bevindingen en conclusies in deze publicatie zijn die van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de centra voor ziektepreventie en-bestrijding en de preventie en de financiering agentschap.
Dankbetuigingen
Wij danken Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu en Ms. Ashley Burroughs van de Influenza-divisie van de CDC voor hun kritische evaluatie en bijstand ter voorbereiding van dit manuscript. Wij danken Dr. Adrian Reber van Influenza afdeling van de CDC voor zijn hulp bij de voorbereiding van de grafische vormgeving van Figuur 3. Tot slot bedanken wij Dr. M. Matrosovich, Marburg, Duitsland voor het verstrekken van de MDCK-SIAT1 cellen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | Een essentieel onderdeel van steriele celcultuur, viruspropagatie en virusverdunningsmedia |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) Fractie V, Protase Vrij | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Natriumpyruvaat | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfaat zout | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicilline/Streptomycine | Life Science | 15140-122 | |
| Aceton | VWR | 67-64-1 | Gebruikt op een 80% concentratie |
| Fosfaat-Citraat Buffer met Sodium Perboraat | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Fenyleendiamin Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml celcultuur kwaliteit water |
| Zwavelzuur | Fisher Scientific | A510-P500 | Gebruikt 0.5M eindconcentratie |
| Ethanol, Gedenatureerd, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Gebruikt op een 70% concentratie |
| Trypsine-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP muis monoklonaal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-muis IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-wells platen met platte bodem | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Celcultuur fles 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
Referenties
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
