Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meten van Influenza neutraliserende antilichamen reacties op A(H3N2) virussen in menselijke Sera door Microneutralization testen met behulp van MDCK-SIAT1 cellen

18.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56448

⸱

22 november 2017

 ,  ,  ,  , 
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

In dit artikel

Samenvatting

Influenza neutraliserende antilichamen correleren met bescherming van influenza-infecties. Microneutralization testen meten van neutraliserende antilichamen in menselijke sera en worden vaak gebruikt voor menselijke influenza-serologie. We beschrijven een microneutralization assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 voor het meten van neutraliserende antilichamen titers voor hedendaagse 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) virussen na griepvaccinatie of infectie.

Samenvatting

Neutraliserende antilichamen tegen hemagglutinine (HA) van influenza-virussen worden beschouwd als het belangrijkste immuun mechanisme dat met bescherming van influenza-infecties correleert. Microneutralization (MN) tests worden vaak gebruikt voor het meten van neutraliserende antilichamen reacties in menselijke sera na griepvaccinatie of infectie. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cellen zijn het meest gebruikte cel substraat voor MN testen. Echter op dit moment circuleren 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) influenza virussen hebben verworven gewijzigd receptor bindende specificiteit. De cellijn van de MDCK-SIAT1 met verhoogde α-2,6 sialic galactose wordt op het oppervlak heeft bewezen om verbeterde infectiviteit en meer trouw replicaties dan conventionele MDCK cellen voor deze hedendaagse A(H3N2) virussen. Hier beschrijven we een MN assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 die is geoptimaliseerd om te kwantificeren van neutraliserende antilichamen titers voor deze hedendaagse A(H3N2) virussen. In dit protocol, worden warmte geïnactiveerd sera met neutraliserende antilichamen eerst serieel verdund, vervolgens geïncubeerd met 100 TCID50/goed van de A(H3N2)-influenzavirussen om antilichamen in de sera te binden aan de virussen. MDCK-SIAT1 cellen worden vervolgens toegevoegd aan het mengsel van virus-antilichaam en 18-20 h bij 37 ° C, 5% CO2 toe A(H3N2) virussen te infecteren MDCK-SIAT1 cellen ge¨ uncubeerd. Na een incubatieperiode van overnachting, platen worden opgelost en de hoeveelheid virus in elk goed wordt gekwantificeerd door een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) met behulp van anti-griep een nucleoproteïne (NP) monoklonale antilichamen. Neutraliserende antilichamen titer wordt gedefinieerd als de reciproque waarde van de hoogste serumverdunning waarmee ≥50% remming van de besmettelijkheid van het virus.

Inleiding

Influenzavirussen blijven morbiditeit en mortaliteit in de menselijke bevolking jaarlijks veroorzaken. HA is de grote oppervlakte glycoproteïne influenza virussen. Neutraliserende antilichamen gericht op HA zijn de belangrijkste immuun mechanisme dat met bescherming voor influenza infecties1,2 correleert. Hemagglutination inhibitie (HI) testen en MN vitrotests zijn twee methoden gebruikte voor het meten van antilichaam reacties in menselijke sera na de infectie of vaccinatie griep3. De HI-test meet antilichaam inhibitie van virus hemagglutination van rode bloedcellen en wordt beschouwd als een surrogaat assay. In tegenstelling tot HI, kan de bepaling van MN direct de niveaus van antilichamen in menselijke sera die neutraliseren van besmetting van de griep in celculturen meten. MDCK cellen worden vaak gebruikt in de isolatie van het virus van de griep en MN testen4.

Influenzavirussen worden voortdurend antigene drift en shift, verwerven van mutaties op HA eiwitten die de receptor bindende specificiteit van virussen veranderen kunnen ondergaan. Sinds 2014 nieuwe clusters van A(H3N2) virussen ontstaan en blijven circuleren tot het huidige seizoen. De meeste van deze virussen behoren tot de genetische groep 3C.2a en 3C.3a gebaseerd op de fylogenetische analyse van de HA-eiwitten. Veel van de circulerende virussen 3C.2a had verminderd vermogen om hemagglutinate van rode bloedcellen en daarmee kunnen niet worden gekenmerkt door HI assays5. Neutralisatie testen moeten worden gebruikt voor het meten van de antilichaam-reacties op deze virussen die niet6 hemagglutinate doen. Bovendien, studies hebben aangetoond dat deze hedendaagse A(H3N2) virussen receptor bindende eigenschappen vergeleken met eerdere A(H3N2) virussen hebben veranderd en hebben de neiging om te accumuleren cultuur aangepast mutaties en polymorfisme bij gepasseerd in in vitro cel culturen7,8,9. Vergeleken met conventionele MDCK cellen, is MDCK-SIAT1 een cellijn ontwikkeld door Matrosovich et al. door de stabiele transfectie MDCK cellen met cDNA van menselijke alpha2, 6-sialtransferase (SIAT1). Deze cellijn spreekt verhoogde hoeveelheden alpha2, 6-sialic galactose wordt en verminderde hoeveelheid alpha2, 3-sialic zuur wordt dan het bovenliggende MDCK cellen10. Cellen van de MDCK-SIAT1 gebleken om isolatie tarieven voor A(H3N2) virussen in vergelijking met MDCK cellen11. Onlangs, Lin et al. gerapporteerd dat onlangs naar voren gekomen 3C.2a en 3C.3a menselijke A(H3N2) influenza virussen, meer trouwe virus replicaties en betere virus infectiviteit werden bereikt wanneer virussen gekweekt in cellijnen van de MDCK-SIAT1 in vergelijking met MDCK cellen7 werden. De MDCK-SIAT1 cellen zijn dus beter geschikt in MN testen te karakteriseren van antilichaam reacties op de recente clusters van A(H3N2) virussen.

Hier beschrijven we een MN-assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 voor het meten van antilichaam reacties op hedendaagse 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) virussen in menselijke sera. Virussen gegroeid in eieren of cellen kunnen worden gebruikt in deze test. Warmte geïnactiveerd sera met neutraliserende antilichamen worden eerst serieel verdund, vervolgens geïncubeerd met 100 TCID50/goed van A(H3N2) influenzavirus om antilichamen in de sera te binden aan het virus. MDCK-SIAT1 cellen worden vervolgens toegevoegd aan het mengsel van virus-antilichaam en 18-20 h bij 37 ° C, 5% CO2 om het A(H3N2)-virus besmetten MDCK-SIAT1 cellen te repliceren ge¨ uncubeerd. Na een incubatieperiode van overnachting, de platen worden opgelost en de hoeveelheid virus in elk putje wordt gekwantificeerd door een ELISA met anti-influenza A NP monoklonale antilichamen. De detectie van NP geeft aan de aanwezigheid van virusinfectie en het ontbreken van neutraliserende antilichamen. Neutraliserende antilichamen titer wordt gedefinieerd als de reciproque waarde van de hoogste serumverdunning waarmee ≥ 50% remming van de besmettelijkheid van het virus.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle influenzavirussen moeten worden behandeld volgens passende bioveiligheid niveau eisen (BSL-2 of hoger) als omschreven in de bioveiligheid op microbiologische en biomedische laboratoria (BMBL)12.

1. bereiding van reagentia en grondstof

  1. Voorbereiden van de MDCK-SIAT1 cellen en steriele cel kweekmedium
    1. Voorbereiden van de MDCK-SIAT1 cel kweekmedium 500 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met hoge glucose, 10% v/v warmte geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 1 mg/mL G418 (II) sulfaat (b.v. Geneticin), en 100 U/ml penicilline met 100 µg/mL streptomycine (optioneel). Steriliseren door filtratie door een membraan van 0,2 µM porie-grootte. G418 (II) sulfaat wordt toegevoegd aan het plasmide stabiliteit in de cellen van de MDCK-SIAT1.
    2. Bereiden de cellijn MDCK-SIAT1 . In een 162 cm,2- weefselkweek flask(s) met 30 mL steriele cel cultuurmedia, seed kolven met 2-2.5 x 106 MDCK-SIAT1 cellen en Incubeer bij 37 ° C in 5% CO,2 voor 2 dagen; Dit zal worden gebruikt voor de bepaling van weefselkweek infectieuze dosis (TCID) en MN testen.
      Opmerking: MDCK-SIAT1 cellen werden beschikbaar gesteld door Dr. M. Matrosovich, Marburg, Duitsland10. Deze cellijn ook commercieel kan worden verkregen (Zie de Tabel van de materialen).
  2. De steriele virus verspreiding media met behulp van DMEM hoge glucose 0,3% bovien serumalbumine (BSA) breuk V, 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine 500 mL en 20 mM HEPES voor te bereiden. Steriliseren door filtratie door een membraan van 0,2 µM porie-grootte.
  3. Bereiden van 0,75% (v/v), cavia rode bloedcellen (gpRBCs) in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,01 M PBS, met een pH van 7,2.
  4. De steriele virus verdunningsmiddel met DMEM hoge glucose, 1% boviene albumine breuk V (BSA), 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 20 mM HEPES voor te bereiden. Steriliseren door filtratie met een 0,2 µm poriegrootte membraan en vers bereiden voor elke assay.
  5. De koude cel fixeerspray voor te bereiden als 80% koude aceton in PBS (0,01 M PBS, pH 7,2).
  6. Bereiden de buffer wassen met PBS (0,01 M PBS pH 7,2) en 0,3% (v/v) tween-20.
  7. Voorbereiden van het antilichaam verdunningsmiddel met PBS (0,01 M PBS, pH 7,2), 0,3% (v/v) tween-20 en 5% non-fat droge melk.
  8. Gebruik anti-influenza A NP muis monoklonaal antilichaam kloon A1 en A3 zwembad als het primaire antilichaam. Verdun in het antilichaam verdunningsmiddel bij de optimale concentratie zoals bepaald door titratie.
  9. Gebruik geit anti-muis IgG geconjugeerd met paard radijs peroxidase (HRP) als het secundair antilichaam. Verdun in het antilichaam verdunningsmiddel bij de optimale concentratie zoals bepaald door titratie.
  10. Bereid het peroxidase substraat met behulp van o- fenyleendiamine dihydrochloride (OPD) in 0,05 M fosfaatbuffer citraat bij pH 5. Bereiden van 0,05 M fosfaatbuffer citraat door ontbinding van 1 capsule/100 mL gedeïoniseerd H2O. ontbinden 1 OPD tablet (10 mg) / 20 mL fosfaatbuffer citraat onmiddellijk vóór gebruik.
  11. 0,5 M zwavelzuur als de OPD stoppen oplossinggebruiken. Voeg 28 mL 18 M zwavelzuur voorraad tot 972 mL gedeïoniseerd H2O in een chemische kap.
  12. Behandeling van mens en dier sera
    1. Warmte inactivering van de menselijke sera gebruikt in de MN testen in een waterbad bij 56 ° C gedurende 30 minuten voorafgaand aan de test. Onmiddellijk gebruik of indien nodig, bewaar ontdooide sera bij 4 ° C gedurende ten hoogste 24 uur; als langere opslag nodig is, slaan sera bevroren bij-20 ° C of kouder.
    2. Behandelen van de dierlijke sera gebruikt in de MN testen met de Receptor vernietigen enzym (RDE) en inactivering van vóór de bepaling van warmte als volgt.
      1. De sera in een 37 ˚C waterbad ontdooien dan plaatst u op ijs. Meng 1 deel dierlijke serummonster met 3 delen van RDE. Incubeer bij 37 ˚C voor 18-20 h.
      2. Warmte inactivering van de sera rde-behandeld op 56 ˚C voor 30 min. toevoegen 6 volumes van PBS, pH 7,2 aan elk monster voor een definitieve pre verdunning 1:10. Indien nodig slaan ontdooide sera bij 4 ° C gedurende ten hoogste 24 uur; als langere opslag nodig is, slaan sera bevroren bij-20 ° C of kouder.
        Opmerking: Dierlijke sera kunnen bevatten verschillende sialic zuur glycanen die kunnen binden aan de HAs influenza virussen en de binding van influenza-specifieke anti-HA antilichamen. Daarom is het noodzakelijk om RDE alle dierlijke sera voorafgaand aan het testen van MN te verwijderen van deze niet-specifieke virale HA bindmiddelen in de serummonsters behandelen.

2. de passage van de cultuur van de cel van de MDCK-SIAT1

Opmerking: Alle celculturen moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast om verontreiniging te voorkomen.

  1. Decanteren in het kweekmedium cel uit de cel enkelgelaagde in 162 cm2 kolven. Trypsinize de cellen door het spoelen van de enkelgelaagde met trypsine-EDTA. Voeg toe 5 mL trypsine-EDTA ter dekking van de cel enkelgelaagde. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 totdat de enkelgelaagde los (5-10 min). Voeg toe 15 mL MDCK-SIAT1 cel voedingsbodems aan elke maatkolf met trypsinized cellen, pipet op en neer om te scheiden van de cellen.
  2. Gebruik een hemocytometer en trypan om dat de cel telt blauw en levensvatbaarheid. Zaad van de cellen in de nieuwe 162 cm2 weefselkweek kolven met 30 mL cel voedingsbodems met 2-2.5 x 106 cellen /flask en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 dagen voor gebruik in TCID en MN testen. Zaad van cellen op 4-5 x 106 cellen/kolf en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 dagen voor gebruik in vermeerdering van het virus.
    Opmerking: De seeding dichtheid kan worden aangepast als cultuur voor kortere of langere perioden zijn gewenst. Virus teeltmateriaal, cellen moeten oplopen tot meer dan 100% confluentie. De cellen moeten voor weefselkweek infectie dosis (TCID) en MN testen, 75-95% confluentie (Figuur 1).

3. verspreiding van A(H3N2) virussen in cellen van de MDCK-SIAT1

Opmerking: A(H3N2) virus kan worden doorgevoerd ofwel in 10-11-daagse oude duivin van bebroede volgens standaard protocol3of MDCK-SIAT1 cel culturen eieren. MDCK-SIAT1 cellen moeten oplopen tot meer dan 100% confluency voor virus inoculatie. Virus influenzakweken kan worden geënt met meerdere verdunningen van het entmateriaal. Het entmateriaal verdunningen met de beste oogst HA en infectiviteit kunnen worden gebruikt voor verdere MN testen.

  1. Het kweekmedium cel verwijderen uit de cel enkelgelaagde (> 100% confluentie) in 162 cm2 kolven. De enkelgelaagde tweemaal met 15 mL steriele 0,01 M PBS, pH 7,2, wassen en decanteren.
  2. Label 1 kolf als besturingselement en Voeg 20 mL virus verspreiding media. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2kolf. Deze kolf ongewijzigd te laten en gebruik voor vergelijking na dag 1 van vermeerdering van het virus.
  3. 10 mL steriele virus verspreiding media toevoegen aan de flask(s) en alle flask(s) bij 37 ° C, 5% CO2uit te broeden. Een flesje van influenza virus voorraad op kamertemperatuur ontdooien dan plaatst u op ijs. Verdun met de virus verspreiding media aan de doelgroep verdunningen.
    Opmerking: Target verdunningen kunnen worden aangepast, gebaseerd op HA titers virusvoorraden. Ter voorbereiding van een 1:1000 verdund entmateriaal, voeg 100 µL van virus aan 9.9 mL steriele virus verspreiding media. Voorzichtig omkeren, 1 mL 1:100 verdunning tot 9 mL steriele virus verspreiding media verwijderen, voorzichtig een 1:1000 verdund entmateriaal omkeren. Plaats op het ijs.
  4. Verwijder alle kolven behalve controle kolf uit de incubator. Verwijder het medium van de propagatie virus van flask(s) van de MDCK-SIAT1 cellen en Inoculeer elke kolf met 10 mL verdunde virus. Incubeer de kolven bij 37 ° C, 5% CO2 voor 1 h, roteren de flask(s) elke 15 min.
  5. 5 mL van entmateriaal uit de flask(s) verwijderen en vervangen door 15 mL virus verspreiding media met 1 µg/mL TPCK-trypsine. Incubeer de flask(s) bij 37 ° C, 5% CO2 voor 16-18 h.
  6. Na de overnachting incubatie, observeren de flask(s) onder 100 X Microscoop vergroting en zoekt cytopathogeen effect (CPE) op de cellen. 15-17 mL virus supernatant uit de flask(s) verwijderen en vervangen door 15-17 mL vers bereide virus verspreiding media met 2 µg/mL TPCK-trypsine.
  7. Incubeer de kolven bij 37 ° C, 5% CO2. De CPE van de enkelgelaagde (ten opzichte van de cel controle kolf) controleren en de HA periodiek (elke 4 h) met 0,75% gpRBC tot oogst.
    1. Instellen van een HA 96-wells microtiterplaat plaat. Voeg 50 µL van 0,01 M PBS, pH 7,2 putjes A2 - A12 en B2 - B12 (duplicaten), en wells H1 - H12 voor controle.
    2. Voeg 100 µL van virus supernatant A1 en A2, uitvoeren van een 2-fold seriële verdunning vanaf de A1 en B1 tot en met A12 en B12. Gooi 50 µL na het mengen in A12 en B12. Voeg 50 µL van 0,75% gpRBCs naar rijen A, B en H.
    3. Tik op de plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
      1. HA van virus supernatant bepalen door het kantelen van de 96-wells microtiterplaat plaat duikt met een 45° tot 60° hoek.
      2. Lees platen voor hemagglutination; de hoogste verdunning van virus dat volledige hemagglutination bereikt wordt beschouwd als het eindpunt van de titratie HA voor het specifieke virus. Record de reciproke van de hoogste verdunning van het virus met volledige hemagglutination als de HA-titer van het virus.
        Opmerking: De vaste RBC in rij H (besturingselementen) moeten beginnen 'uitvoeren' en een vorm kleine teardrop-als gevolg van de zwaartekracht. Wacht maar tot de RBC in controle putten voltooien Lees actief is, dan de RBC-knoppen in het virus titratie wells. Die vertonen RBC knoppen en "run", bereiken hemagglutination niet. Zoek de hoogste verdunning van het virus dat de remmen volledig hemagglutination als het eindpunt HA-titer van het virus.
  8. Verzamel dan het virus wanneer de HA van de virus-cultuur randplateau of de virus cultuur het doelwit HA bereikt (bijvoorbeeld > 16 HAU), maar voor de cel enkelgelaagde begint weer te geven significante CPE.
    1. Centrifugeer het supernatant bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het cellulaire puin pellet virus-cultuur. Het geklaarde supernatant met de oogst van virus tot een schone koker overbrengen. Aliquot de bovendrijvende vloeistof met het virus oogst in eenmalig gebruik steriele cryogene flesjes en onmiddellijk bevriezen bij-70 ° C of kouder.
      Opmerking: De virusvoorraden gebruikt voor het testen van MN moeten hoge besmettelijke titer en minimale defecte deeltjes. De minimale verdunning virusvoorraden tot 100 µL van de50/50 van de TCID voor MN assay is 1:100.
      Opmerking: De virusvoorraden gebruikt in de MN testen moeten niet worden ontdooid en refrozen.

4. bepaling van de TCID van het Virus

  1. Dag 1: Virus titratie
    1. Een flesje van virus op kamertemperatuur ontdooien en onmiddellijk plaats op ijs.
    2. Testen van het virus in twee verschillende startende verdunningen: 10-2 en 10-3. Meng 100 µL van virus 9.9 mL virus verdunningsmiddel voor 10-2 -verdunning. Meng 1 mL 10-2 -verdunning 9.0 mL virus verdunningsmiddel voor 10-3 verdunning.
    3. Met behulp van twee microtiterplaat Breng platen (plaat 1 voor 10-2 -verdunning) en plaat 2 voor 10-3 verdunning, 100 µL van virus verdunningsmiddel in alle putjes met uitzondering van kolom 1 van de 96-wells microtiterplaat plaat.
    4. ½log10 verdunningen (10-210-2,5-, 10-3, enz.) uit te voeren. Voeg µL van de 146 van het virus vanaf verdunning aan alle putjes in kolom 1 en transfer van 46 µL serieel van kolom 1 tot en met kolom 11 (Figuur 2). Verandering de uiteinden van de pipet tussen putten. Na het mengen kolom 11, gooi de tips met de 46 µL verdunning.
    5. Column 12 gebruiken als de cel controle (CC); het bevat alleen virus verdunningsmiddel. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
  2. Dag 1: Voorbereiding van de MDCK-SIAT1 cellen
    Opmerking: De MDCK-SIAT1 cel enkelgelaagde moet bereiken 75-95% confluentie voor TCID en MN testen. Één 162 cm2 erlenmeyer op 95% confluentie moet voldoende cellen aan zaad opleveren ~ 4-5 microtiterplaat platen.
    1. Wassen van de 75-95% confluente enkelgelaagde met 20 mL PBS te verwijderen van de FBS in de cultuur-media. Trypsinize de cellen als volgt.
      1. Spoel de enkelgelaagde met steriel PBS, 7 mL trypsine-EDTA ter dekking van de cel enkelgelaagde toe te voegen. Leg de kolf flat en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 totdat de enkelgelaagde los (ongeveer 5-10 min). Voeg 7 mL verdunningsmiddel virus aan elke maatkolf met de trypsinized cellen.
    2. Wassen van de cellen met het virus te verwijderen van de FBS verdunningsmiddel.
      1. Pipetteer zachtjes op en neer om te scheiden van de cellen. De cellen overbrengen in een conische buis van 50 mL; Vul de buis met virus verdunningsmiddel.
      2. Centrifugeer bij 485 x g gedurende 5 min. Decant het virus verdunningsmiddel, vervangen door verse 50 mL virus verdunningsmiddel, en centrifugeer bij 485 x g gedurende 5 min. Decant het virus verdunningsmiddel en vervangen door verse virus verdunningsmiddel (10 mL/kolf) naar resuspendeer de pellet.
    3. Gebruik een hemocytometer en blauwe trypan om te bepalen van het aantal cellen en de levensvatbaarheid. Aanpassen van de concentratie van de cel met het virus aan 1.5 x 105 cellen/mL verdunningsmiddel.
    4. Voeg 100 µL van verdunde MDCK-SIAT1 cellen aan elk putje van de microtiterplaat platen (1.5 x 104 cellen/well) en betrekking hebben op de platen. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 18-20 h.
  3. Dag 2: ELISA
    1. Fixatie van de cellen
      1. Verwijder het medium van de microtiterplaat platen. Wassen elk goed met 200 µL van PBS. 300 µL koude 80% aceton toevoegen aan elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur voor 10 min. Verwijder de fixeer en laat de platen in de lucht droog.
    2. ELISA
      1. Primair antilichaam toevoeging
        Opmerking: Anti-influenza A NP monoklonaal antilichaam moet worden gebruikt in overmaat als het primaire antilichaam in ELISA. Bepaal de optimale antilichaam verdunning voor elke primaire antilichamen door het uitvoeren van antilichaam titraties in MN. Selecteer de concentratie primair antilichaam in overmaat en met het beste signaal naar verhouding van de achtergrond.
        1. De anti-griep A NP monoklonaal antilichaam (primair antilichaam) verdunnen tot de concentratie van de doelgroep in het antilichaam verdunningsmiddel (bijvoorbeeld het toevoegen van 30 µL van primair antilichaam tot 30 mL van antilichaam verdunningsmiddel voor een verdunning van de doelstelling van 1:1000).
        2. Spoel de platen 3 keer met 300 µL van was buffer. Voeg 100 µL verdunde primair antilichaam aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
      2. Toevoeging van secundair antilichaam
        Opmerking: Geit anti muis IgG geconjugeerd met paard radijs in overmaat peroxidase (HRP) moet worden gebruikt als het secundaire antilichaam in ELISA. Bepaal de optimale antilichaam verdunning voor elke secundaire antilichamen door het uitvoeren van antilichaam titraties. Selecteer de concentratie secundair antilichaam in overmaat en met het beste signaal naar verhouding van de achtergrond.
        1. Verdun de geit-antimuis die IgG geconjugeerd met HRP antilichaam (secundair antilichaam) tot de concentratie van de doelgroep in het antilichaam verdunningsmiddel (bijvoorbeeld toevoegen 7.5 µL van secundair antilichaam aan antilichaam verdunningsmiddel voor een doel 1:4000 verdunning 30 mL).
        2. Wassen van de platen 3 keer met 300 µL was buffer. Voeg 100 µL verdunde secundair antilichaam aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
      3. Substraat toevoeging en plaat-lezing
        1. Wassen van de platen 5 keer met 300 µL was buffer en kraan op een pluisvrij doekje.
        2. Voeg 100 µL van vers bereide substraat aan elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur totdat de kleur ontwikkeling verzadigde vetzuren en de optische dichtheid (OD) van cel-controleputjes < 0.2.
        3. Voeg 100 µL van eindeoplossing toe aan alle putjes. Lees de OD van putten op 490 nm met behulp van een spectrofotometer microplate.
  4. TCID 50 berekening
    1. Bereken de gemiddelde OD-490 van de cel besturingselementen (kolom 12).
    2. Overwegen een test goed met een OD490 groter is dan tweemaal de mediaan OD490 van de CC-putjes als een "positieve"; anders, het wordt beschouwd als "negatief".
    3. De50 van de TCID van het virus met behulp van de methode Reed-Muench13te berekenen.
      1. Bepaal het aantal positieven en negatieven op elke verdunning.
      2. Het berekenen van de "cumulatieve positief", "Cumulatief negatieve", "Ratio" en "% positieve" als aangegeven in tabel 1.
      3. Berekenen van de "evenredige afstand" tussen de verdunning weergegeven: > 50% positieven en de verdunning, met vermelding < 50% positieven met behulp van de volgende handelingen uit:
        figure-protocol-1
        Opmerking: De correctiefactor voor ½ log verdunning is 0,5. Bijvoorbeeld, in tabel 1: (80 − 50) /(80 − 20) x 0,5 = 0,25
      4. Het virus TCID50 berekenen door de proportionele afstand toe te voegen met de verdunning tonen > 50% positief.
        Opmerking: in tabel 2, TCID50 is bijvoorbeeld 10-5+(-0.25) = 10-5.25. Opmerking dat dit is de50 van de TCID van het virus per 100 µL (of 10 µL van de-5.25/100).
    4. De verdunning van het virus berekenen. Verdun voor MN testen, het virus zich 200 TCID50/100 µL (equivalent aan 100 TCID50/50 µL per putje).
      Opmerking: In het voorbeeld in tabel 1is 1 TCID50 10-5.25 in 100 µL, en de verdunning te bereiken van 200 TCID50/100 µL is 1:891 op basis van de berekeningen: 200 x 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102.95 = 1 / 891

5. MN Assay cuvetten van de MDCK-SIAT1

  1. Dag 1: Test- en sera voorbereiding en plaat-indeling
    1. Ontdooi de sera in waterbad 37 ° C en verwijderen onmiddellijk na het ontdooien. Aliquot deel de bedrag van sera die moeten worden getest; een minimum van 10 µL van oorspronkelijke sera is nodig om te testen met een virus in singlet. Testsera dubbele indien mogelijk.
    2. Warmte inactivering van de menselijke sera gedurende 30 minuten in een waterbad van 56 ° C als in stap 1.12.1. Plaats sera op ijs warmte Inactivering boeken, het virus verdunningsmiddel toevoegen aan sera om een 1:10 verdunning pre.
    3. RDE behandelen en vooraf Verdun dierlijke sera tot en met 1:10 van besturingselementen per 1.12.2 gebruiken.
      Opmerking: Ontdooide en behandelde sera voor mens en dier kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor niet langer dan 24 h. Sera moeten worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C of kouder als langere duur van de opslag is nodig voorafgaand aan de test.
    4. Om te testen met een virus, voeg 100 µL 1:10 verdund sera naar kolommen A1 naar A10 (Figuur 4). 50 µL van virus verdunningsmiddel toevoegen aan rijen B tot en met H, met uitzondering van kolommen 11 en 12 (Figuur 4). Uitvoeren van een 2-fold seriële verdunning vanaf rijen A tot en met H, en negeren de laatste 50 µL bij rij H (Figuur 4).
      Opmerking: Wanneer meerdere virussen te beproeven, sera kunnen worden verdund in titer buizen. De verdunning van het serum, voor het doel van het bepalen van de titer van het serum, in goed A is 1:10, B 1:20 goed, goed C 1:40, ook D 1:80, goed E 1:160, goed van F 1:320, goed G 1:640, goed H 1:1,280 (Figuur 4).
    5. Voor de controle van het virus, breng 50 µL virus verdunningsmiddel in putjes A12, B12, C12 en D12 (geen sera). Voor de controle van de cel, voeg 100 µL virus verdunningsmiddel putjes E12, F12, G12 en H12 (geen virus, geen sera).
    6. Voeg 100 µL van verdunde controlesera goed een kolom 11 en breng 50 µL van virus verdunningsmiddel in putjes B11 - H11 voor de controlesera (bijvoorbeeld ferret sera controles). Seriële verdunde neer.
    7. Dekking van de platen, Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 tot klaar voor de toevoeging van het virus.
  2. Dag 1: Virus toevoeging
    1. Verdun het virus zich 100 µL van TCID50/50 met virus verdunningsmiddel.
    2. Breng 50 µL verdunde virus in alle putjes, met uitzondering van kolom 11 op de rug titratie (BT) platen en de controleputjes cel E12, F12, G12 en H12 op alle platen (Figuur 4). Voor deze platen met controlesera op kolom 11, voeg toe virus aan kolom 11.
    3. Terug titratie (BT)
      1. Omvatten een BT in kolom 11 van één set dubbele platen (bijvoorbeeld plaat 1A en 1B). Breng 50 µL van virus verdunningsmiddel in alle putjes in kolom 11. 50 µL van het virus op 100 µL van TCID50/50 toevoegen aan de eerste putje (A11). Meng door pipetteren omhoog en omlaag.
      2. Meng en breng 50 µL aan opeenvolgende putjes uit te voeren 2-fold seriële verdunningen. Het wijzigen van de uiteinden van de pipet tussen putten om te voorkomen dat de overdracht van het virus. 50 µL van goed H11 negeren.
      3. Voeg toe 50 µL van virus verdunningsmiddel naar kolom 11 het eindvolume om 100 µL. Tik op de platen te mengen.
    4. Incubeer de platen bij 37 ° C, 5% CO2 voor 1 h.
    5. Uitvoeren van de MDCK-SIAT1 cel toevoeging op dag 1 en ELISA op dag 2 zoals beschreven in stappen 4.2 en 4.3 (ook beschreven in 5.3 en 5.4)
  3. Dag 1: MDCK-SIAT1 cel, toevoeging
    1. Voorbereiden van de MDCK-SIAT1 cellen zoals beschreven in stap 4.2. Voeg 100 µL MDCK-SIAT1 cellen op 1.5 x 105 cellen/mL aan elk putje (1.5 x 104 cellen per putje). Incubeer de platen bij 37 ° C, 5% CO2 voor 18-20 h.
  4. Dag 2: ELISA
    1. Na een incubatieperiode van overnachting, op de tweede dag, monteren van de cellen met 80% koude aceton zoals beschreven in stap 4.3.
    2. Primair antilichaam toevoeging
      1. Wassen van de platen 3 keer met 300 µL was buffer. Verdun de anti-griep A NP monoklonaal antilichaam (primair antilichaam) tot de optimale concentratie zoals bepaald door titratie in antilichaam verdunningsmiddel (bijvoorbeeld het toevoegen van 30 µL van primair antilichaam tot 30 mL van antilichaam verdunningsmiddel voor een verdunning van de doelstelling van 1:1000).
        Opmerking: 100 µL van primair antilichaam is vereist per putje. ~ 10 mL is per plaat nodig.
      2. Voeg 100 µL verdunde primair antilichaam aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    3. Toevoeging van secundair antilichaam
      1. Spoel de platen 3 keer met 300 µL was buffer. Verdun de geit anti muis IgG geconjugeerd met HRP antilichaam (secundair antilichaam) tot de concentratie van de doelgroep in verdunningsmiddel (bijvoorbeeld toevoegen 7.5 µL van secundair antilichaam aan antilichaam verdunningsmiddel voor een doel-1:4000 30 mL.) van de antilichaam
        Opmerking: 100 µL van secundair antilichaam is goed per 96 vereist. ~ 10 mL is per plaat nodig.
      2. Voeg 100 µL verdunde secundair antilichaam aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    4. Substraat toevoeging en plaat-lezing
      1. Wassen van de platen 5 keer met 300 µL was buffer en kraan op pluisvrije doekje.
      2. Voeg 100 µL van vers bereide substraat aan elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur totdat het virus-controleputjes een OD490 bereikt = 0.8 - 3, met de controle van de cel op een laag achtergrond OD490 < 0.2.
      3. Voeg 100 µL van de stop-oplossing toe aan alle putjes. Lees de OD van putten op 490 nm met behulp van een spectrofotometer microplate.
  5. Data-analyse
    Opmerking: De berekeningen van MN zijn bepaald voor elke plaat individueel.
    1. Het bepalen van de neutraliserende antilichamen titer van elk serummonster.
      1. Bereken de OD490 licht-donkerscheiding van 50% virus neutralisatie voor elke plaat met behulp van de volgende vergelijking:
        figure-protocol-2
        Opmerking: Hier x = 50% van de licht-donkerscheiding neutralisatie. De wederzijdse serumverdunning overeenkomt met de hoogste verdunning met OD490 minder dan 50% van de licht-donkerscheiding (≥50% remming) wordt beschouwd als de neutralisatie antilichaam titer voor dat serummonster (Figuur 5).
    2. Controleer of de cel-controleputjes een OD490 hebt < 0.2 en het virus-controleputjes hebben een OD490 = 0.8 - 3.
    3. Controleer of de virus infectiviteit in elke assay (100 x TCID50) door virus BT. het acceptabele bereik van BT 50, 100 of 200 TCID. Als met behulp van de dezelfde licht-donkerscheiding als omschreven in stap 4.4.2, is de hoogste verdunning van het virus in de kolom van de BT met OD boven de licht-donkerscheiding moet in putten E11, F11, G11.
      Opmerking: De positieve controle van serum moeten geven titers binnen 2-fold van de waarden die zijn verkregen in de vorige tests. De490 van de OD van de negatieve controleserum moet ongeveer gelijk zijn aan die voor de controle van het virus is waargenomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bepaling van de besmettelijkheid van het virusvoorraden is de eerste stap in de bepaling van MN. Figuur 2 illustreert de indeling van de plaat om te bepalen van de TCID50 de virusvoorraden. Voor virus bestanden met onbekende infectiviteit, kan het virus worden getitreerd uit meerdere pre verdunningen, bijvoorbeeld zowel 10-2 en 10-3, om te vangen de beste titratiecurve voor het berekenen van de besmettelijkheid van het virus. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De bepaling van MN is een van de belangrijkste tests voor influenza serologie gebruikt voor het opsporen van antilichamen reacties na besmetting van de griep of vaccinatie. Titers gegenereerd op basis van MN tests worden vaak gebruikt als de primaire uitkomst van veel griep seroepidemiology studies. MN tests worden ook op grote schaal gebruikt voor sero-diagnose, en de evaluatie van de immunogeniciteit van het vaccin. Internationale inter lab studies zijn uitgevoerd om te vergelijken van MN testen uitgevoerd in meerdere ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen belangenconflict. De bevindingen en conclusies in deze publicatie zijn die van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de centra voor ziektepreventie en-bestrijding en de preventie en de financiering agentschap.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu en Ms. Ashley Burroughs van de Influenza-divisie van de CDC voor hun kritische evaluatie en bijstand ter voorbereiding van dit manuscript. Wij danken Dr. Adrian Reber van Influenza afdeling van de CDC voor zijn hulp bij de voorbereiding van de grafische vormgeving van Figuur 3. Tot slot bedanken wij Dr. M. Matrosovich, Marburg, Duitsland voor het verstrekken van de MDCK-SIAT1 cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high GlucoseLife Science11965Een essentieel onderdeel van steriele celcultuur, viruspropagatie en virusverdunningsmedia
Fetaal bovien serum (FBS)HycloneSH30070.03
Bovine Serum Albumine (BSA) Fractie V, Protase VrijSigma-Aldrich3117332001
L-GlutamineLife Science25030-081
NatriumpyruvaatLife Science11360-070
Geneticin G-418 disulfaat zout Sigma-AldrichA1720-5G  
HEPESLife Science15630-080
Penicilline/StreptomycineLife Science15140-122
AcetonVWR67-64-1Gebruikt op een 80% concentratie
Fosfaat-Citraat Buffer met Sodium Perboraat Sigma-AldrichSLBF2806V
O-Fenyleendiamin Dihydrochloride tabletSigma-AldrichSLBQ1086V1 tablet per 100ml celcultuur kwaliteit water
ZwavelzuurFisher ScientificA510-P500Gebruikt 0.5M eindconcentratie
Ethanol, Gedenatureerd, 4LVWREM-AX0422-3Gebruikt op een 70% concentratie
Trypsine-EDTALife Science1748048
RDE II "Seiken"Denka Seiken370013
Tween 20Sigma-AldrichP1379-500ml
Anti-NP muis monoklonaal AbMillipore poolMAB 8257 MAB 8258
Anti-muis IgG HRP KPL074-1802
96-wells platen met platte bodemThermo Scientific3455
Plate readerMolecular DeviceSpectromax 384 plus
Celcultuur fles 162 cm2/Vent CapCorning/VWR3151

Referenties

  1. Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
  2. Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine? Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
  3. WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf (2011).
  4. Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, discussion 73-34 39-51 (1999).
  5. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201703_recommendation.pdf?ua=1 2017-2018 (2017).
  6. Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
  7. Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
  8. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment? J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  9. Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112(2016).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
  12. US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
  13. Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
  14. Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
  15. Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
  16. van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
  17. WHO. Recommended composition of infleunza virus vaccines for use in the 2015-2016 northern heamisphere infleunza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2015_16_north/en 2015-2016 (2015).
  18. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2016-2017 northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201602_recommendation.pdf?ua=1 2016-2017 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

MicroneutralisatiewasH3N2-virusELISA-detectieTCID50-berekeningviruspropagatieserumverdunningantilichaamtiter
Meten van Influenza neutraliserende antilichamen reacties op A(H3N2) virussen in menselijke Sera door Microneutralization testen met behulp van MDCK-SIAT1 cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.