Methodenartikel

Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56451

⸱

5 december 2017

1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

Cel migratie is essentieel voor de ontwikkeling, weefsel onderhoud en reparatie en tumorvorming en wordt gereguleerd door groeifactoren, chemokines en cytokinen. Dit protocol beschrijft de stip assay, een twee-dimensionale, onbeperkte migratie test om te beoordelen van de trekkende fenotype van geschakelde, samenhangende cel bladen in reactie op microenvironmental signalen.

Samenvatting

Hoewel er complexe organismen verschijnen statische, zijn hun weefsels onder een continue omzet. Als cellen leeftijd, verplaatsen sterven, en zijn vervangen door nieuwe cellen, cellen binnen weefsels in een strak georkestreerde wijze. Tijdens de ontwikkeling van de tumor, dit evenwicht wordt verstoord, en tumorcellen laat het epithelium van oorsprong te vallen van de lokale communicatie, te reizen naar verre locaties, en uiteindelijk gemetastaseerde tumoren op verre locaties. De stip-bepaling is een eenvoudige, tweedimensionale onbeperkte migratie assay, te beoordelen van de netto verkeer van cel bladen in een cel-vrije zone, en te analyseren parameters van cel migratie met behulp van time-lapse imaging. Hier, de bepaling van de dot is aangetoond door middel van een mens invasieve, Long kolonievormende borst kanker cellijn, MCF10CA1a, voor het analyseren van de cellen trekkende reactie op epidermale groeifactor (EGF), waarvan bekend is dat het kwaadaardig potentieel van borstkankercellen vergroten en de trekkende fenotype van cellen wijzigen.

Inleiding

Migratie testen worden veel gebruikt om te evalueren van de invasieve en gemetastaseerde potentieel van tumor cellen in vitro. Meestal, wordt de wond of kras assay gebruikt ter beoordeling van de migratie van epitheliale bladen in een cel gewist gebied1,2,3. Voor het uitvoeren van de kras assay, cellen zijn vergulde in een enkelgelaagde en een "scratch" of cel-vrije zone wordt gemaakt met een pipet tip. De kras assay is gemakkelijk aan opstelling met algemeen beschikbare weefselkweek leveringen en multi goed platen, waardoor voor de verwerking van meerdere monsters kan worden uitgevoerd. Echter, zoals de kras is gemaakt, cellen zijn fysiek verwijderd uit de enkelgelaagde en vaak ondergaan celdood. Extracellulaire matrix gekoppeld aan de plaat is bovendien vaak beschadigd tijdens het krassen. Ook het gebruik van silicium wordt ingevoegd (zoals Ibidi kamers4) of van stencils5,6,7 kan leiden tot mechanische verstoring van de cellen en de gedeeltelijke opheffing van matrix eiwitten gebruikt voor coating de platen. Een ander nadeel van tests toezicht op sluiting van wonden of krassen is hun beperkte tijdsverloop, zoals cel migratie kan alleen worden geanalyseerd totdat de kras is gesloten.

Bij het uitvoeren van de bepaling van de stip, zijn cellen vergulde als een circulaire kolonie op een bekleed of niet gestreken plaat8. De reden voor deze beplating strategie is het verkrijgen van cel bladen met gedefinieerde randen, die kunnen migreren of binnenvallen in de omliggende gebieden met cel-vrij zonder verstoring van de cultuur door verwijdering van cellen of inzetstukken. Het algemene doel van de bepaling van de dot is te observeren van de migratie van cel bladen zoals gemeten door de verplaatsing van de rand of kolonie diameter, alsmede uitvoeren time-lapse imaging voor het analyseren van de trekkende fenotype van cellen in een hogere spatio-temporele resolutie.

Cel migratie kan worden beïnvloed door een verscheidenheid van microenvironmental signalen zoals chemokines, cytokines en groeifactoren zoals EGF. EFG is een groeifactor dat oefent haar biologische effecten via binding aan de receptor, EGF receptor9, en verhoogt de invasieve en metastatische gedrag van de tumor cellen4,9,10. Hier, de stip-test wordt gebruikt om te studeren EGF gestimuleerd cel migratie in een menselijke invasieve, Long kolonievormende borst kanker cel lijn (MCF10CA1a)8,11,12.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. coating van gerechten (dag 1)

Opmerking: Zorg ervoor dat u niet laat vingerafdrukken of vuil op de bodem van de plaat bij het verwerken van het.

  1. Muis collageen IV op ijs ontdooien en Verdun het met 50 mM HCl (pH 1.3) ter voorbereiding van 3 mL van een 10 µg/mL collageen IV oplossing.
    Opmerking: Collageen neerslaat bij 37 ° C. Het is daarom belangrijk om de collageen-oplossing bij een lage temperatuur tijdens het ontdooien en het werken met het. Herhaalde bevriezen-ontdooien cycli door de voorbereiding van gepaste afmetingen aliquots voorkomen en op te slaan bij-80 ° C.
  2. 250 µL collageen IV oplossing toevoegen aan elk putje van 12-well glazen bodem platen en plaats hen in een gepaste afmetingen, strakke-sluiting plastic doos. Plaats van natte papieren handdoek over en rondom de platen voor de vervaardiging van een vochtige kamer en sluit het. Incubeer de platen 's nachts bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Als u alleen het groeigebied moet worden bekleed, volstaat alleen betrekking hebben op de cover slip, die is aan de onderkant van de plaat, met collageen oplossing gehecht (Zie Figuur 1A, B voor een schematische voorstelling van de plaat).
  3. Volgende ochtend, spoel platen met gedeïoniseerd H2O tweemaal te verwijderen niet-geabsorbeerd collageen en buffer. Direct het water tot aan de rand van de plaat goed, niet op de rand gevormd door de onderkant van de plaat en het dekglaasje aan (als water is afgepipetteerde in dit gebied die het zal splash). Het drogen van de platen in de laminaire flow kap. Platen onmiddellijk gebruik of bewaren bij 4 ° C voor maximaal 5 dagen.
    Opmerking: Verschillende cellijnen kunnen vereisen verschillende coating, zoals fibronectine of collageen ik.

2. plating de Dot Assay (dag 2)

  1. Voorbereiding van de celsuspensie
    1. Cellen die zijn geteeld in een schotel van 60 mm weefselkweek in DMEM/F12 medium aangevuld met 5% paard serum tot 80% samenkomst om te bereiden celsuspensie, gebruiken
    2. Spoel de cellen met de calcium - en magnesium-free Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) eens, voeg 500 µL trypsine-EDTA (kamertemperatuur) en Incubeer de cellen gedurende 3-5 min. in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer.
    3. Opschorten van de vrijstaande cellen in 4.5 mL gestolde voedingsbodem om te stoppen trypsine-activiteit en een 20 tellen µL aliquoot gedeelte van de celsuspensie in een hemocytometer.
    4. De resterende cellen in een conische tube van 15 mL pellet door centrifugeren bij 200 x g gedurende 3 min, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in een kweekvloeistof tot 3 x 106 cellen/mL.
      Opmerking: Om andere coating substraten en/of cellijnen, de optimale celdichtheid moet worden ingesteld in een verdunningsreeks. 3 x 106 cellen/mL wordt aanbevolen als uitgangspunt.
  2. Beplating cellen
    1. Plaats een druppel 10 µL celsuspensie in het midden van elke slip van de cover van de collageen IV gecoat glas 12-well bodemplaat zonder aanraken of krabben van de coating (Figuur 1A, B). Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C, bevochtigde sfeer, om de cellen te koppelen. Controleer in een omgekeerde Microscoop of de cellen zijn aangesloten.
      Opmerking: Dit kan worden best gezien aan de rand van de daling, waar vorming van een enkelgelaagde kan worden waargenomen (Figuur 1C). Indien nodig, incubeer tot de plaat 3 h. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid in de broedstoof hoog genoeg is, zoals de druppels snel kunnen uitdrogen. Als een vermindering van het volume daling tijdens deze stap wordt waargenomen, PBS aan de ruimten tussen de putten te verhogen van de vochtigheid toevoegen.
    2. Zachtjes was de putjes met 1 mL gestolde voedingsbodem tweemaal te verwijderen van de niet-ingeschrevenen cellen. Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem toe aan elk putje. Controleer in een omgekeerde Microscoop of geen zwevende cellen blijven, anders was de putjes goed weer. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer, verkrijgen van welomschreven cel bladen.
      Opmerking: De zwevende cellen zijn waarschijnlijk opnieuw koppelen aan de plaat en ongewenste cel kolonies vormen.

3. stimuleren van de cellen (dag 3)

  1. Controleer alle putjes met behulp van een omgekeerde Microscoop om ervoor te zorgen dat cel kolonies zijn behoorlijk gegroeid. Indien nodig, mark ongeschikt wells en kan ze niet gebruiken.
  2. Label elk putje van de plaat op de juiste wijze voor elke voorwaarde onderzocht. Elke voorwaarde in dubbele of drievoud uitgevoerd.
  3. Wijzigen van het medium om te verhongeren de cellen in de DMEM/F12 met 0,1% paard serum (hongerende medium) 3 h voordat cellen worden gestimuleerd.
  4. Stimuleren van de cellen door toevoeging van EFG (5 ng/mL eindconcentratie) of andere gewenste bemiddelaars/mediators en meng voorzichtig het medium gebruik van een micropipettor van 1 mL of door zwenken van de plaat.
  5. Incubeer de plaat voor 1-4 dagen te observeren van verplaatsing van de rand en rand contour zoals beschreven in punt 4.1 of time-lapse imaging uit te voeren zoals beschreven in paragraaf 4.2.

4. visualisatie van kolonies van de cel en de cel migratie

  1. De Haematoxyline-eosine (HE) kleuring voor het meten van de groei van de kolonie (dag 4-7)
    1. Fix cellen in 70% ethanol (1 mL/putje) voor ~ 2 min.
    2. Vlek kernen met haematoxyline (1 mL/putje), ~ 2 min.
    3. Wassen cellen met leidingwater (1 mL/putje) tot kernen zijn blauw, 5-10 min.
    4. Vlek cytoplasma met eosine (1 mL/putje), ~ 2 min.
    5. Spoel af met gedeïoniseerd water (1 mL/putje).
      Opmerking: De haematoxyline en eosine oplossingen kunnen worden verzameld en gebruikt meerdere malen totdat de kleuring wordt vaag.
    6. Luchtdroog plaat.
    7. Draai de plaat en de dot-diameter meten met een liniaal. Als alternatief, neem foto's van de plaat met een camera, en analyseren van de diameter van de dot in ImageJ.
  2. Time-lapse microscopie (dag 3)
    1. De incubator Microscoop inschakelen en aanpassen van de temperatuur tot 37 ° C. Vul de luchtbevochtiger met dH2O. verkleinen/vergroten de CO2 tot 5%. Zorg ervoor dat de zaal incubator is bevochtigde en dat de gemotoriseerde fase zich vrij kan bewegen. Sluit de incubator kamer en laat de Microscoop te passen tot 37 ° C.
      Opmerking: De Microscoop (Zie de tabel van materialen) gebruikt hier moet worden verwarmd tot 37 ° C gedurende ten minste 3 uur, voordat de cellen zijn beeld om te voorkomen dat het drijven van de focus.
    2. Plaats de plaat in het werkgebied van de incubator Microscoop en instellen van de fase-lijst. Afbeelding twee tegengestelde randen en het centrum van elke cel stip(Figuur 1).
    3. Neem beelden elke 3 minuten, voor 15-24 h met gebruikmaking van de 10 X doelstelling. Downloaden van de gegevens en ga verder met beeldanalyse in een programma van keuze, bijvoorbeeldImageJ of Matlab.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De bepaling van de dot (Figuur 1) hier gepresenteerd werd uitgevoerd met behulp van invasieve, Long kolonievormende borstkankercellen (MCF10CA1a) als een modelsysteem. De stip-assay levert zeer reproduceerbaar cel stippen zelfs in de hand van beginners, waardoor het een handig en eenvoudig worden gerealiseerd assay (Figuur 1D). De stip-bepaling in combinatie met hij kleuring, of time-lapse imaging en latere parti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tijdens de progressie van de tumorcellen migreren uit de buurt van het weefsel van oorsprong metastaseren naar verre locaties15te vallen van het omringende weefsel. Migratie van cellen uit de buurt van de kolonie van een cel kan worden waargenomen in de dot-bepaling. Hier, wordt de stip bepaling geïllustreerd door het analyseren van de trekkende fenotype van menselijke borstkankercellen in reactie op EGF.

Nauwkeurige en repliceerbaar om resultaten te verkrijgen verschil...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteur wil Bhagawat Subramanian, Yi (Jason) Chang, Paul Randazzo, en Carole Parent bedanken voor het lezen en commentaar op het manuscript. Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van het National Cancer Institute, National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MCF10CA1a cellenKarmanos Research InstituteN/Acellen gebruikt voor het testen
muis collageen IVBD Biosciences354233gebruikt om platen te coaten
trypsine / EDTAThermo Fisher25300054gebruikt om cellen van weefselcultuurplaten te verwijderen
DPBS Mediatech21-031-CVgebruikt om cellen te wassen
DMEM / F12Thermo Fisher11320082gebruikt als kweekmedium
paardenserumThermo Fisher26050088gebruikt om kweekmedium aan te vullen
12 wel glazen bodemplaatMatTekP12G-1.5-14-Fgebruikt om cellen voor beeldvorming te laten groeien
EGF (epidermale groeifactor, humaan recombinant)PeprotechAF-100-15gebruikt om cellen te stimuleren
vetzuurvrije BSASigmaA8806-1Ggebruikt om buffer voor EGF te maken
hematoxylineSigmaHHS32gebruikt om kolonies te kleuren
eosineElectron Microscopy Sciences26051-10gebruikt om kolonies te kleuren
37 °C, 5% CO2 incubatorSanyomodel MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver met incubatorkamer en gemotoriseerde standaardZeissmodel Axio Observer.Z1gebruikt voor time lapse beeldvorming
ORCA Flash LT sCMOS cameraBioVisionC11440-42U-KITgebruikt voor timelapse beeldvorming in combinatie met Zeiss AxioObserver
MetamorphBioVisionMMACQMICsoftware gebruikt voor time lapse beeldvorming
inversie microscoopOlympusmodel IX70gebruikt om cellen te tellen en om kolonies in weefselkweek te controleren
kunststof doosLock&LockN/Agebruikt als vochtige kamer (elke kunststof doos met strakke sluiting die past bij de platen kan worden gebruikt)

Referenties

  1. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  2. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
  3. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  4. Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859(2013).
  5. Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
  6. Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  7. Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
  8. Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832(2010).
  9. Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
  10. Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501(2013).
  11. Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
  12. Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
  13. Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001(2016).
  14. Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
  15. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  16. Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
  17. Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CelmigratieEGF stimulatietime lapse imagingH E kleuringcollageen IV coatingMCF10CA1a cellenanalyses van celsnelheidrandverplaatsing

Gerelateerde artikelen