Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten

Summary

Dit protocol biedt experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het hele genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) analyse van kopie nummer variaties in uit te voeren planten.

Abstract

Mutanten zijn onschatbare waarde genetische hulpbronnen voor gene functie studies. Voor het genereren van mutant collecties, kunnen drie soorten mutagene agentia worden gebruikt, met inbegrip van biologische zoals T-DNA of transposon, zoals ethyl methanesulfonate (EMS) chemische of fysische zoals ionisatie straling. Het soort mutatie waargenomen varieert afhankelijk van de mutagene stof gebruikt. Mutaties omvatten ionisatie straling geïnduceerde mutanten, verwijdering, duplicatie of omlegging. Terwijl T-DNA of op basis van transposon mutagenese beperkt tot de soorten die vatbaar voor transformatie is zijn, kan chemische of fysische mutagenese worden toegepast op een breed scala van soorten. De karakterisering van mutaties afgeleid van chemische of fysische mutagenese traditioneel is echter afhankelijk van een kaart-gebaseerde klonen benadering die arbeid intensief en tijdrovend is. Hier, laten we zien dat een high-density genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (aCGH) platform kan worden toegepast om efficiënt detecteren en karakteriseren van kopie aantal variaties (CNVs) in mutanten afgeleid van snelle neutronen bombardement (FNB) mutagenese in Medicago truncatula, een peulvrucht soorten. Volledige genoomanalyse van de reeks toont aan dat er meer dan 50.000 genen of gene modellen in M. truncatula. Bij de huidige, FNB-geïnduceerde mutanten in M. truncatula zijn afgeleid van meer dan 150.000 M1 lijnen, die van onschatbare waarde plantgenetische hulpbronnen voor functionele studies van genen in de genoom. Het platform van de aCGH hier beschreven is een doeltreffend instrument voor het karakteriseren van FNB-geïnduceerde mutanten in M. truncatula.

Introduction

Peulvruchten (Fabaceae) is de derde grootste familie van tweezaadlobbige planten, met vele economisch belangrijke soorten zoals sojabonen (Glycine max) en luzerne (Medicago sativa). Peulvruchten planten kunnen communiceren met stikstof-vaststelling bodem bacteriën, Rhizobium om root knobbeltjes waarin de atmosferische dinitrogen is gereduceerd tot ammoniak voor gebruik door de waardplant genoemd. Als zodanig, teelt van peulvruchten gewassen vereist weinig inbreng van stikstof meststoffen en draagt aldus bij aan duurzame landbouw. Peulvruchten gewassen produceren bladeren en zaden met een hoog eiwitgehalte, bijeenkomen uitstekend ruw....

Protocol

Opmerking: afbeelding 1 ziet u de vijf stappen voor de array CGH protocol. Ze zijn: 1) voorbereiding van plantaardig materiaal; 2) isolatie van DNA-monsters van hoge kwaliteit; 3) labelen en zuivering van DNA-monsters; 4) hybridisatie, wassen, en scannen van gehele genoom arrays; en 5) CGH data-analyse. M. truncatula hele genoom betegeling matrices bevatten een totaal 971,041 unieke oligo sondes gericht op meer dan 50.000 genen of modellen van het gen in het genoom (Zie tabel van materialen). De unieke sondes worden verdeeld ongeveer elke 150 basenparen (bp) in de exonic regio's en 261 bp in intronic gebieden v....

Results

Figuur 2 geeft de distributie van genormaliseerde log₂ verhoudingen van mutant versus WT signalen over het hele genoom. Analyse van CGH gegevens bleek benaderend 22 kb schrapping op chromosoom 4, die de gehele SUNN gene³³ en diverse andere omvat geannoteerde genen in de mutant FN6191 (Figuur 2, Figuur 3). De kandidaat-verwijderde regio werd gecoverd door 73.......

Discussion

We hebben een arraygebaseerd CGH platform ontwikkeld voor de detectie en karakterisatie van snelle neutronen bombardement (FNB)-geïnduceerde mutanten in M. truncatula cv. Jemalong A17. Om aan te tonen het gebruik van de array CGH methode voor het opsporen van genmutaties, we aCGH analyse van de mutant FN6191, die tentoongesteld van een hyper-nodulatie fenotype in tegenstelling tot wild type planten, wanneer geënt met S. meliloti Sm1021uitgevoerd. Voor segmentatie analyse, werd een segment beschouwd als .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M	Agilent	G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant)	In house	FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference)	In house	A17
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	1000D
SureTag DNA Labeling Kit	Agilent	5190-3400
Random primer	Agilent	5190-3399
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004-1L
Thermocycler	MJ research	PTC-200
Centrifuge	Labnet international Inc	Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution	Agilent	5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides	Agilent	G2505
Human Cot-1 DNA	Agilent	5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2	Agilent	5188-5221
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	G2534A
Hybridization oven	Agilent	G2545A
Purification Columns	Agilent	5190-3391
Laser scanner	Roche	MS200
NimbleScan 2.6	Roche Nimblegen	5225035001
Signal Map 1.9	Roche Nimblegen	Signalmap1.9