Methodenartikel

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

DOI:

10.3791/56482

⸱

4 januari 2018

 , 
1Department of Convergence Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, 2Synaptic Circuit Plasticity Laboratory, Department of Structure and Function of Neural Network, Korea Brain Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de verschillende technieken die nodig zijn voor de transmissie-elektronenmicroscopie, met inbegrip van negatieve kleuring, uiterst dunne segmenteren voor gedetailleerde structuur en immuno-goud etikettering om te bepalen van de standpunten van bepaalde eiwitten in exosomes.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomes nano-sized extracellulaire blaasjes uitgescheiden door de lichaamsvloeistoffen zijn en staan bekend om weer te geven van de kenmerken van cellen die ze afscheiden. De inhoud en de morfologie van de secreted blaasjes reflecteren cell gedrag of fysiologische status, bijvoorbeeld celgroei, migratie, decollete en dood. De exosomes rol kan sterk afhangen van grootte en de grootte van exosomes varieert van 30 tot 300 nm. De meest gebruikte methode voor exosome imaging is negatieve kleuring, terwijl andere resultaten zijn gebaseerd op Cryo-transmissie-elektronenmicroscopie, Scanning elektronenmicroscopie en Atomic Force microscopie. De typische exosome morfologie beoordeeld via negatieve kleuring is een kop-vormig, maar verdere details zijn nog niet duidelijk. Een goed gekarakteriseerd door de studie van de structurele exosome is nodig vooral in medische en farmaceutische velden. Daarom, functie-afhankelijke morfologie gecontroleerd moet worden of door elektronenmicroscopie technieken zoals het labelen van een specifieke proteïne in de gedetailleerde structuur van exosome. Om te zien hoe de gedetailleerde structuur, werden uiterst dunne verdeelde beelden en negatieve gekleurde beelden van exosomes vergeleken. In dit protocol stellen wij transmissie-elektronenmicroscopie voor de beeldvorming van exosomes met inbegrip van negatieve kleuring, hele mount immuno-kleuring, blok voorbereiding, dunne sectie en immuno-goud etikettering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn lipide dubbelgelaagde blaasjes uitgescheiden door cellen en hun grootte varieert tussen 30 en 300 nm. EVW werden het eerst gemeld in 1978, met bewijs van blaasjes van patiënten met de ziekte van Hodgkin1. Deze blaasjes werden gemeld dat 40 tot 120 nanometer in grootte. In 1980, werd gemeld dat EVs zijn betrokken bij de stolling systeem en trombose, vorming van een bloedstolsel binnen een bloedvat in kanker patiënten2. Na 30 jaar EVs gemeld als een belangrijke factor om de invasie van de tumor, immuun ontsnappen en angiogenese3. Bovendien zijn de functies van het EVW bestudeerd als regelgevers in cellulaire interacties op het gebied van ontsteking, immuun aandoening, neurologische ziekte en kanker4. EVs bevatten specifieke biomoleculen zoals eiwitten, mRNA en microRNA5, is hun mogelijke toepassing in de diagnostiek en therapeutics sinds geanalyseerde6,7. EVW vormen een categorie bestaat uit subgroepen met inbegrip van exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, micropartikels, promininosomes, argosomes en exosome-achtige blaasjes, afhankelijk van hun cellulaire oorsprong en de biologische functie3. Bovendien, kunnen gebaseerd op hun biogenese, deze EVs worden onderverdeeld in microvesicles (loods microvesicles, 100-1000 nm) en exosomes (30-300 nm)8,9. Daaronder is de exosome gerapporteerd als een cel communicator voor immune reactie10, kanker11,12, en besmettelijke ziekte13.

Interesse in de exosomes als een biomarker voor vroegtijdige diagnose neemt snel toe, en de zuivering en karakterisering van exosomes moeten gepaard met moleculaire beeldvormingstechnieken. De verschillende maten en morphologies van exosomes, afhankelijk van hun oorsprong en functie14, kunnen worden onderscheiden door microscopie technieken met hoge resolutie, zoals elektronenmicroscopie. De meeste exosomes waren gevisualiseerd door negatief gekleurd transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)15,16,17, en deze resultaten werden bevestigd door immunolabeling van een bepaalde eiwit in hele mount vesikel 18. verschillende onderzoeksgroepen hebben melding gemaakt van de structuur door middel van Scanning elektronenmicroscopie en Atomic Force microscopie19,20Cryo-TEM21,22. Terwijl deze technieken nuttig zijn voor het bestuderen van de structuur van de exosome, zijn ze echter onvoldoende voor de observatie van de positie van specifieke proteïnen bevindt zich in de exosome. Daarom introduceerden we een protocol voor imaging-exosomes met een specifieke proteïne etikettering. We toegepast blok voorbereiding, uiterst dunne afdelen en immunokleuring voor het vaststellen van de gedetailleerde ligging van het eiwit in de exosome. Dit werd vergeleken met negatieve kleuring en hele mount immunokleuring, die traditioneel wordt gebruikt voor de karakterisering van de exosome.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. blok voorbereiding, afdelen, kleuring en beeldvorming van de Exosome

  1. De exosomes van cultuur supernatant van HCT116 cellen door centrifugeren bij 100.000 x g gedurende 1,5 h23pellet. Verwijder het supernatant cultuur en zorgvuldig de gezuiverde exosome pellet te bevestigen met 1 mL 2,5% Glutaaraldehyde in 0,1 M natrium cacodylate oplossing (pH 7.0) gedurende 1 uur bij 4 ° C. Los voor 0,1 M natrium cacodylate, de cacodylic zuur 4.28 g in 160 mL gedestilleerd water (DW). Breng de pH op 7.4 met 0,1 M HCl Breng met gedestilleerd water tot 200 mL.
  2. Verwijder de fixeer en spoel de korrels met 1 mL 0,1 M natrium cacodylate buffer bij kamertemperatuur. Herhaal drie keer met elke 10 min blijvende verandering.
  3. Na het bevestigen van de monsters met 1 mL 2% Osmium tetroxide gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  4. Verwijder de fixeer en spoel driemaal met 0,1 M natrium cacodylate buffer elke 10 min.
  5. Incubeer gedurende 10 minuten met een reeks graded aceton (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respectievelijk) op het schudapparaat.
  6. Verwijder de aceton en Incubeer de oplossing van 3:1 aceton: lage viscositeit insluiten mengsel gedurende 30 minuten. De exosome pellet is in de buis.
  7. Verwijder het medium en toevoegen van 1:1 aceton: lage viscositeit insluiten mengsel medium en incubeer gedurende 30 min.
  8. Verwijder het medium en toevoegen van 1:3 aceton: lage viscositeit insluiten mengsel medium en incubeer gedurende 30 min.
  9. Verwijder het medium en voeg 100% lage viscositeit mengsel te embedding en na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur.
  10. Insluiten van het monster in pure lage viscositeit insluiten mengsel met behulp van de insluiten schimmel en bak gedurende 24 uur bij 65 ° C.
  11. Bereiden secties met 60 nm dikte door middel van een ultra-microtoom.
  12. Dubbel-vlek met 2% uranyl acetaat voor 20 min en leiden citraat gedurende 10 minuten.
    Toevoegen voor de oplossing van de leiding van Reynolds, 1,33 g voorsprong nitraat en 1.76 g Natriumcitraat tot een totaal van 50 mL gedestilleerd water.
  13. Observeren van het raster onder transmissie-elektronenmicroscopie bij 80 kV.
  14. Klik "Verwerven" en klik op "Bestand" en "Opslaan als" in CCD camerasysteem onder de elektronenmicroscoop bij 80 kV. Volg automatische instellingen voor de blootstellingstijd.

2. Immuno-kleuring van secties en Imaging (Figuur 1)

  1. Knip 60 nm uiterst dunne secties met behulp van een ultra-microtome, en verzamelen op de grid nikkel.
  2. Incubeer rasters in 50 µL druppels 0,02 M glycine voor 10 min om quench gratis aldehyde-groepen.
  3. Spoel in 100 μl van DW driemaal elk voor 10 min. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in PBS met 1% BSA.
  4. Rasters in 50-100 µL druppels anti KRS antilichaam24 (1:100 in PBS met 0,1% BSA) Incubeer gedurende 1 h (indien nodig, dat deze stap moet worden uitgevoerd bij 4 ° C's nachts.)
  5. Rasters met vijf afzonderlijke druppels (50 µL) wassen van PBS met 0,1% BSA voor elke 10 min.
  6. Rasters overbrengen in druppels 2nd antilichaam voor 1 h (anti-konijn IgG geconjugeerd met 10 nm gouden deeltje (1:100) in PBS met 0,1% BSA).
  7. Wash rasters met vijf aparte druppels PBS met 0,1% BSA (50 µL) elke 10 min.
  8. Dubbel-vlek met 2% uranyl acetaat gedurende 20 minuten onder donkere omstandigheden en met Reynold van lood citraat voor 10 min, respectievelijk.
  9. Klik "Verwerven" en klik op "Bestand" en "Opslaan als" in CCD camerasysteem onder een TEM bij 80 kV. Belichtingstijd gevolgd automatische instellingen.

figure-protocol-1
Figuur 1: proces voor de bereiding van de monsters en immunokleuring. (A) dubbele vaste exosome is uitgedroogd en geïnfiltreerd met lage viscositeit mengsel hars inbedding. (B) hars inbedding. (C) uiterst dunne sectie met diamant mes. (D) Setup voor Immuno-goud etikettering. De rasters met het uiterst dunne secties worden geplaatst op de vloeibare druppeltjes op een parafilm, die wordt geplaatst met de natte papieren handdoek. Elke sectie is geïncubeerd met druppels van 50-100 µL antilichaam, dan gewassen met buffer. (E) dubbel kleuring met uranyl acetaat en citraat leiden. Het deksel is bedekt met aluminiumfolie voor zware metalen kleuring. (F) kleurstofoplossing door filterpapier wordt verwijderd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. negatieve kleuring

  1. Gloed-kwijting de dunne formvar/carbon film bekleed 200 mesh koperen EM rasters voor 1 min door gloed lozer.
  2. Gezuiverde exosomes vast met 1 mL 2% Paraformaldehyde (PFA) gedurende 5 minuten.
    Let op: Paraformaldehyde dampen zijn giftig. Alles moet gebeuren in een geventileerde zuurkast.
  3. Laden van 5-7 µL exosome Luchtvering oplossing op de grid en incubeer gedurende 1 minuut. Als de concentratie van exosome te hoog is, Verdun de concentratie aan 1/2 - 1/5.
  4. Vlek onmiddellijk met de ~ 20 druppels van gefilterde 1% uranyl acetaat (UA)-oplossing op het oppervlak van het EM-raster door spuit.
  5. Verwijder de overtollige UA-oplossing op de grid door contact met de rand van het raster met filtreerpapier.
  6. Snel spoel het raster met een druppel water. Deze stap verwijdert het overtollige kleurstofoplossing.
  7. Plaats van het raster op de tafel door te houden met een pincet en dekking van het raster gedeeltelijk met een cultuur-schotel tot en met 10 min onder kamertemperatuur drogen.
  8. Het raster worden opgeslagen in een raster-Punts kader voor toekomstige waarneming door een TEM bij 80 kV.

4. hele Mount voor immunokleuring

  1. Gloed-kwijting de dunne formvar/carbon film bekleed 200 mesh koperen EM rasters voor 30 s.
  2. Gezuiverde exosomes vast met 1 mL 2% Paraformaldehyde (PFA) gedurende 5 minuten.
    Let op: Paraformaldehyde dampen zijn giftig. Alles moet gebeuren in een geventileerde zuurkast.
  3. Laden van 5-7 µL vaste exosome oplossing op de grid en incubeer gedurende 5 min. spoelen met 100 µL van PBS driemaal elk voor 10 min.
  4. Rasters met 50 µL van 0,05 M glycine voor 10 min om quench gratis aldehyde-groepen te behandelen.
  5. Transfer rasters op een daling van de buffer met blokkerend (PBS met 1% BSA) voor 30 min.
  6. Rasters met 50-100 µL anti PD-L1 antilichaam (1:100 in PBS met 0,1% BSA) Incubeer gedurende 1 h (indien nodig, dat deze stap moet worden uitgevoerd bij 4 ° C's nachts).
  7. Wassen raster met vijf afzonderlijke druppels (50 µL) van PBS met 0,1% BSA voor elke 10 min.
  8. Raster overbrengen in een daling van 2nd antilichamen tegen 1 h.
Anti-muis IgG geconjugeerd met 9-11 nm gouden deeltje verdund bij 1:100 in PBS met 0,1% BSA.
  • Wassen raster met vijf afzonderlijke druppels (50 µL) van PBS met 0,1% BSA voor elke 10 min. Wassen raster met twee afzonderlijke druppels (50 µL) van DW. Voer negatieve kleuring met 2% uranyl acetaat zoals beschreven van 3.4 tot 3.8.
  • Het raster worden opgeslagen in een raster-Punts kader voor toekomstige waarneming door een TEM bij 80 kV.

    • Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Op dit moment worden exosomes ingedeeld in categorieën van grootte en vorm van transmissie-elektronenmicroscopie. Figuur 2 toont negatief gekleurd exosome en immuun-gelabelde exosome hele mount status. Figuur 3 toont verdeelde exosome en immuno-gelabelde exosomes na dun segmenteren. Immuno-goud kleuring gebruikt antilichamen van specifieke proteïnen wordt gebruikt om positief een exosome identificeren en classificeren van de soor...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Dit artikel presenteert een protocol voor het observeren van de gedetailleerde exosome structuur en etikettering van haar specifieke proteïnen. Negatieve kleuring heeft beschouwd als de beste methode voor exosome imaging17. Deze conventionele techniek leert exosomes' cup-vormige structuur. Deze vorm van de kop is echter een vorm van artefact die als gevolg van het droogproces optreden kan. Cryo-TEM resultaten hebben aangetoond dat exosomes een perfect bolvormige structuur in waterige oplossing

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Dankbetuigingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Dit onderzoek werd gesteund door de Bio & medische technologie Development Program van de nationale Stichting voor onderzoek (NRF) & gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIP & MOHW) (nr. 2016M3A9B6904244). Wij danken ook leden van het onderzoekscentrum voor medicinaal Bioconvergence voor zuivering van exosome.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    GlutaraldehydeEMS16200
    Sodium cacodylate EMS12300
    Osmium tetroxide 1 g crystalEMS19100Gebruik alleen in afzuigkap
    acetoneJUNSEI1B2031
    Spurr mediumTED PELLA18108
    Ultra-microtomeLeicaUCT
    Uranyl acetateEMS22400Gevaarlijke chemische stof
    Lead citrateEMS17900
    Transmission Electron MicroscopyHitachiH7600
    nickel gridEMSG200-Ni
    Copper gridEMSG200-Cu
    glycineSIGMA022K5404
    Phosphate buffer salineSIGMAP4417
    Bovine serum albuminAurion25557
    1st Antibodyzuivering handmatig 
    Gezuiverd anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) AntilichaamBioLegend329710Whole mount Immumogold
    Gezuiverd muis IgG2b, κ Isotype CtrlBioLegend401202Whole mount Immumogold (Controle)
    2nd Anti-muis igG geconjugeerd 9-11 nm goudpartikelsigmaG7652
    Transmission Electron MicroscopyJEOLJEM2200FS
    Glow dischargerJEOLJFC1100E
    Carbon gridEMS121119
    ParaformaldehydeEMS19210
    Formvar koolstof gecoat koper raster (200 meh)EMSFCF200-CU
    Formvar koolstof gecoat  Nikkel raster (200 maas)EMSFCF200-NI

    Referenties

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
    2. Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
    3. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
    4. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
    5. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
    6. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
    7. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
    8. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
    9. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
    10. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
    11. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
    12. Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
    13. Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
    14. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
    15. Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
    16. Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
    17. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
    18. Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
    19. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
    20. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
    21. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
    22. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
    23. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
    24. Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
    25. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
    26. Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
    27. Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
    28. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
    29. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
    30. van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    Exosome ImagingNegative StainingImmunogold LabellingExosome PurificationUltrathin SectioningProtein LocalizationExosome MorphologyWhole Mount StainingBlock Preparation

    Gerelateerde artikelen