Methodenartikel

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta

DOI:

10.3791/56484

⸱

27 september 2017

 ,  , 
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maternale obesitas wordt geassocieerd met een verhoogd risico op nadelige perinatale uitkomsten die zijn waarschijnlijk gemedieerd door gecompromitteerde placenta functie die kan worden toegeschreven aan, in deel, de disregulatie van autophagy. Aberrant wijzigingen in de expressie van de regelgevers autophagy in de placentas van zwaarlijvige zwangerschappen kunnen bij inflammatoire processen gekoppeld aan zowel overgewicht en zwangerschap worden geregeld. Hier beschreven is een protocol voor de bemonstering van villous weefsel en isolatie van de villous cytotrophoblasts van de term menselijke placenta voor primaire celculturen. Dit wordt gevolgd door een methode voor het simuleren van de inflammatoire milieu in de zwaarlijvige uteriene omgeving door het behandelen van primaire trophoblasts van mager zwangerschappen met tumor necrose factor Alfa (TNFα), een proinflammatoire-cytokine dat is verheven in zwaarlijvigheid en in zwangerschap. Via de implementatie van het protocol beschreven hier, komt het voor dat de blootstelling aan exogene TNFα regelt de uitdrukking van Rubicon, een negatieve regulator van autophagy, in trophoblasts van mager zwangerschappen met vrouwelijke foetussen. Terwijl een aantal biologische factoren in de zwaarlijvige uteriene omgeving behouden het potentieel om te moduleren kritische trajecten in trophoblasts, is dit systeem ex vivo vooral handig voor het bepalen van als expressie waargenomen in vivo patronen in menselijke placentas met moeders obesitas zijn een direct gevolg van TNFα signalering. Uiteindelijk, deze aanpak biedt de mogelijkheid om te ontleden de regelgevings- en moleculaire implicaties van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over autophagy en andere kritische cellulaire routes in trophoblasts die de potentie hebben om invloed functie van de placenta.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obesitas is een inflammatoire staat gekenmerkt door chronische low-grade ontsteking, die voortkomen uit overtollige vetweefsel en de beschikbaarheid van nutriënten. In overgewicht, zijn proinflammatoire cytokines verheven in metabole weefsels en systemisch in omloop. Een robuust lichaam van bewijsmateriaal blijkt dat TNFα is aanzienlijk verhoogd in de omgeving van obesitas met gevolgen in insulineresistentie en metabole dysfunctie1. Activering van TNFα draagt ook bij aan de pathogenese van de ziekte in aandoeningen zoals kanker en autoimmuniteit, waardoor het een aantrekkelijke therapeutisch doel2.

Ontsteking in obesitas wordt verergerd door zwangerschap, ook een proinflammatoire staat3,4. Eerder is aangetoond dat de placenta TNFα inhoud met moeders vetmobilisering in zwangerschappen met vrouwelijke foetussen toeneemt. Bovendien remt TNFα behandeling mitochondriale ademhaling in vrouwelijke maar niet mannelijke trofoblast cellen, suggereren dat TNFα is betrokken bij de regulering van de placenta metabolisme in een seksueel dimorphic wijze5. Maternale obesitas wordt geassocieerd met de verhoogde incidentie van allerlei complicaties tijdens de zwangerschap, met inbegrip van doodgeboorte, met mannelijke foetussen worden de meest gevoelig3,6,7,8 . Als gevolg van haar belangrijke rol op de moeders-foetale interface, kunnen veranderingen in de functionele capaciteit van de placenta in de zwaarlijvige uteriene omgeving in reactie op inflammatoire signalering een belangrijke rol in het bemiddelen van de resultaten van zwaarlijvige zwangerschappen.

Cytotrophoblasts en syncytiotrophoblasts in het villous weefsel van de placenta zijn kritisch voor endocriene signalering en voedingsstoffen en zuurstof uitwisseling tussen de moeder en de ontwikkeling van de foetus9. Verstoringen in de functionele capaciteit van villous cytotrophoblasts (hierna te noemen trophoblasts) in gevaar kunnen brengen foetale gezondheid en ontwikkeling. Dit protocol beschrijft een methode voor de bemonstering van villous weefsel van de placenta menselijke termijn door het ontleden weg de chorionic en basale platen samen met een geoptimaliseerde procedure voor de isolatie van de trophoblasts voor primaire celculturen. Dit protocol is afgeleid van gevestigde methoden waarbij enzymatische vertering van villous weefsel vrij te geven van de cellen van de extracellulaire matrix gevolgd door differentiële dichtheid centrifugeren te isoleren trophoblasts10, 11,12. De gegevens van dit protocol een aanpak waarin primaire trophoblasts van placentas van mager zwangerschappen worden behandeld met voedingsbodems aangevuld met TNFα te simuleren een onderdeel van de inflammatoire milieu gekoppeld aan moeders obesitas. Eindelijk, een eenvoudige procedure voor de oogst van de cel Totaal lysates van TNFα-behandeld trophoblasts gevolgd door Western blotting om de opsporing van wijzigingen in genexpressie is beschreven.

Dit model doet het obesogenic in utero milieu in zijn geheel niet recapituleren, geeft maar een gecontroleerde systeem dat een toelaat parseren uit de individuele bijdrage van TNFα-gemedieerde ontsteking naar aanleiding van de trophoblasts maternale obesitas. Dit model biedt zowel de mogelijkheid om te ontdekken of bevestigen van moleculaire targets direct geregeld TNFα signalering in trophoblasts evenals maakt het mogelijk om te testen of veranderingen in gen-expressiepatronen in vivo in placentas met moeders waargenomen overgewicht kan een gevolg zijn van TNFα-gemedieerde ontsteking.

De hier beschreven aanpak werd opgestart om te testen van het effect van TNFα-gemedieerde ontsteking op de regulering van autophagy in menselijke trophoblasts. Trophoblasts van zwaarlijvige zwangerschappen met mannelijke foetussen tentoonstelling verstoord autophagic omzet of autophagosome rijping13. Vallen proteïnen aan genaamd Rubicon (RUN domein eiwit Beclin1-interactie en cysteïne-rijke bevatten), die is gelokaliseerd in de lysosomen en laat Endosomen, is onlangs beschreven als een "rem" in het proces autophagic omzet omdat het functioneert als een negatief regulator van14,15van de rijping van de autophagosome. In feite, is Rubicon een zeldzaam voorbeeld van een eiwit dat weerhoudt autophagy, waardoor het een waardevolle therapeutisch doel. Zeer weinig informatie is beschikbaar over de pathofysiologische betekenis van Rubicon, met uitzondering van haar rollen in de ingeboren immune reactie op microbials16,17 en cardiomyocyte bescherming18. Met het protocol beschreven hier, het komt voor dat Rubicon upregulated in vrouwelijke primaire trophoblasts in reactie op behandeling is met toenemende concentraties van TNFα tot 250 pg/mL. De regulering van de Rubicon kan een rol spelen in hoe vrouwelijke foetussen fare beter dan mannetjes in zwangerschappen met moeders obesitas. Recapitulerend ontsteking geassocieerd met moeders obesitas ex vivo door blootstelling van menselijke trophoblasts aan exogene TNFα biedt een platform voor het bestuderen van de effecten van de zwaarlijvige uteriene milieu over de regulering van de kritische trajecten in trophoblasts en bij uitbreiding, placenta functie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

placentae werden verzameld uit de arbeid en de levering eenheid op universitair ziekenhuis onder een protocol dat is goedgekeurd door de institutionele Review Board van Oregon Health and Science University in Portland, Oregon, met geïnformeerde toestemming van de patiënten.

1. collectie van placenta weefsel

  1. voorbereiding
    Opmerking: alle apparatuur die weefsel ontmoetingen moet steriel.
    1. Het ontleden uitrusting steriliseren in autoclaaf gedurende 60 minuten op 121 ° C.
    2. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM): lab jassen/jassen/scrubs, handschoenen en masker met een gelaatsscherm of bril.
    3. Inschakelen waterbad en ingesteld op 37 ° C.
    4. Warm twee 50 mL conische buizen, elk met 25 mL van volledige media (Iscove ' s gewijzigd Dulbecco ' s Medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine, tabel 3) in een waterbad 37 ° C.
    5. Met geïnformeerde patiënt toestemming, het verkrijgen van een placenta onmiddellijk na levering door keizersnede.
    6. Vertrouwd te raken met de placenta. De navelstreng wordt ingevoegd in de foetale kant (chorionic plaat) en bloedvaten kan worden gezien straalt uit van de navelstreng invoeging site. De overkant is de moeders kant, of basale plaat. Het omvat de decidua en structuren die vaartuig bomen, genaamd zaadlobben bevatten.
  2. Bemonstering van Villous weefsel
    Opmerking: Villous weefsel uit de placenta zo spoedig mogelijk na levering, bij voorkeur in 30 minuten of minder moet worden bemonsterd.
    1. Met de chorionic plaat naar boven, accijnzen 2-3 full-dikte secties (ongeveer 2,5 x 2,5 cm grootte) 2-3 cm vanaf de rand van de placenta op willekeurige, met Tang en schaar ( figuur 1A).
      Opmerking: Voorkomen dat delen van de placenta die verschijnen abnormaal (dat wil zeggen wit kalkafzettingen).
    2. Trim weg de chorionic en basale platen en de grote bloedvaten.
    3. Plaatst de resulterende villous weefsel ( figuur 1B, ongeveer 80-120 g totale) in warme volledige media en begint van trofoblast isolatie binnen 30 min van bemonstering.
      Opmerking: Sommige downstream testen en toepassingen worden beïnvloed door de lengte van de latentieperiode tussen levering, bemonstering en trofoblast isolatie. Het is het beste te houden deze termijnen zo kort als mogelijk en consistente tussen isolatie.
    4. Met behulp van de technieken beschreven in stappen 1.2.1 - 1.2.2, sample 5 willekeurige 1 x 1 cm secties van villous weefsel van over de placenta (inclusief het centrum).
    5. Knippen elk monster 1 x 1 cm villous weefsel in kleinere stukjes 4-5 (ongeveer 30 mg elke), plaats in 2 mL microcentrifuge buizen en flash bevriezen in vloeistof N 2. Winkel bij-80 ° C voor gebruik in latere analyses.

2. Isolatie van Trophoblasts van Villous weefsel

  1. voorbereiding
    Opmerking: gebruiken van steriel injectiemateriaal en uitvoeren van procedures waarbij cellen in een laminaire flow-kap.
    1. Dooi vier bevroren dichtheid verlopen (tabel 1, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) bij 4 ° C de nacht voordat de placenta aankomt.
      Nota: Alternatief, dichtheid verlopen kunnen worden gemaakt op de dag van het isolement.
    2. Beurt op centrifuge en ingesteld op 20 ° C.
      Opmerking: Alle stappen van het centrifugeren worden op maximale acceleratie en vertraging, tenzij anders gespecificeerd.
    3. Voorbereiden 1 x HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBSS) aangevuld met Ca + 2 en Mg + 2 (tabel 3).
    4. Warme trypsine tot 37 ° C.
    5. DNase verdund tot ongeveer 2720 kilounits/mL in steriel aangevuld HBSS.
    6. Warme 50 mL Serum van pasgeboren kalf (NCS) tot 37 ° C.
    7. Warm volledige media tot 37 ° C.
    8. Warm bevriezing media (90% FBS, 10% DMSO, tabel 3) tot 37 ° C.
      Let op: DMSO is giftig en moeten worden behandeld met handschoenen.
    9. Voorbereiden spijsvertering buffer (tabel 2 en 3) door het mengen van 308 mL aangevuld HBSS, 50 mL trypsine (3751.7 BAEE eenheden/mL), en 0,5 mL DNase (379.4 kilounits/mL) in een steriele fles.
      Opmerking: Het geschatte benodigde tijd voor het isoleren van cellen uit villous weefsel is 7 h.
  2. Het Villous weefsel verwerking
    1. Rinse elk stuk van villous weefsel in een conische tube van 50 mL gevuld met kamertemperatuur fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal en de PBS vervangen als dit nodig is, totdat het overtollige bloed is verwijderd (PBS spoelen zullen worden licht rood of roze wanneer het weefsel is grondig afgespoeld).
    2. Het villous weefsel in een steriele petrischaal plaatsen en verwijderen als veel bloedvaten mogelijk door voorzichtig afschrapen korting op de villous weke delen van de vaartuigen die met behulp van een microscoopglaasje.
    3. Fijn gehakt het resulterende villous weefsel met behulp van schaar.
  3. Villous weefsel spijsvertering en ruwe isolatie van Trophoblasts
    1. het gehakt villous weefsel overbrengen in een steriele fles met spijsvertering oplossing volgens de berekende volumes op basis van de specifieke activiteit van trypsine en DNase (165 mL, tabel 2).
    2. Na 35 min van incubatie in een waterbad 37 ° C met 70 omwentelingen per minuut (rpm), schudden kantelen van de spijsvertering fles op zijn kant en laat de onverteerd stukjes weefsel te vestigen op de bodem van de fles. Zorgvuldig opstellen van de bovendrijvende substantie met een serologische Pipet, het vermijden van het vaste weefsel.
    3. Het supernatant afzien door een zeef cel 100 µm gelijkelijk tussen de conische buisjes 50 mL.
      Opmerking: Om tijd te besparen, is het raadzaam om te beginnen met de tweede vertering door spijsvertering oplossing (110 mL, tabel 2) toe te voegen aan de overige geregeld weefsel en hervatten van incubatie, zoals beschreven in stap 2.3.2.
    4. Laag 3-5 mL NCS onder het gespannen supernatant zachtjes door het langzaam verstrekking van een serologische pipet aan de onderkant van de buis. Een meniscus tussen de gespannen supernatant (met trophoblasts) en de NCS moet zichtbaar ( figuur 2A).
    5. Centrifugeren het supernatant over NCS bij 1250 x g gedurende 15 minuten bij 20 ° C. De resulterende pellet nemen rode bloedcellen in de laag van de lagere meest gevolgd door een wit laagje met de cellen van de trofoblast ( figuur 2B).
    6. Herhaal stap 2.3.2 - 2.3.5 voor elk van de spijsvertering van het tweede en derde (toevoegen van 110 mL en 83,5 m, respectievelijk van spijsvertering oplossing aan de fles van weefsel, tabel 2).
    7. Zodra alle supernatant hebben zijn gecentrifugeerd, resuspendeer elke pellet in 5 mL warme volledige media, en vervolgens samen bundelen de schorsingen.
    8. Splitsen de celsuspensie even tussen twee kegelvormige buizen van 50 mL en centrifuge op 1250 x g gedurende 15 minuten bij 20 ° C.
    9. Voorzichtig Verwijder het supernatant en resuspendeer elk van de cel pellets in 6 mL warme complETE media.
  4. Dichtheid centrifugeren
    1. verdelen de celsuspensie gelijkelijk tussen vier dichtheid verlopen (van elk 3 mL) door het langzaam en zorgvuldig stapelen de celsuspensie op de bovenkant van het verlopen van de dichtheid met een overdracht Pipetteer.
    2. Centrifugeren de dichtheid verlopen bij 1250 x g gedurende 20 minuten bij 20 ° C met minimale versnelling en vertraging. Dit moet produceren te onderscheiden bands van gesedimenteerd cellen (tabel 4).
    3. Langzaam en zorgvuldig verwijdert de bovenste lagen van dichtheid kleurovergang media (DGM) totdat het ondoorzichtige band(en) aan met cellen van de trofoblast (tussen 35-50% DGM) is bereikt (tabel 4).
    4. Overbrengen van de trofoblast bands in twee 50 mL conische buizen en vul met warme volledige media.
    5. Voorzichtig het omkeren van de buizen 3 - 6 keer te mengen en centrifugeer bij 1250 x g gedurende 15 minuten bij 20 ° C.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet van elke cel in 5 mL warme volledige media. Combineer de cel schorsingen en levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en de Trypan blauwe tellen (of voorkeur cel tellen methode).
  5. Cellen tellen met een Hemocytometer
    1. de celsuspensie Meng door op en neer met een serologische Pipetteer pipetteren of door zachtjes het omkeren van de buis meermaals.
    2. Combineren gelijke delen celsuspensie en Trypan blauw (dat wil zeggen 20 µL elke) in een aparte buis en meng voorzichtig.
    3. Voor 1-2 minuten bij kamertemperatuur Incubate.
    4. Voorzichtig afzien van 15-20 µL van de cel-Trypan blauwe mengsel tussen het dekglaasje aan en de hemocytometer en de cellen om te verspreiden over het raster door capillaire werking toestaan.
    5. Levensvatbare cellen (dode cellen zal worden gekleurd donkerblauw) in elk van de vier 4 x 4 kwadranten met een teller tally tellen. Een systeem om ervoor te zorgen dat cellen worden niet meegeteld meer dan eens te tellen (d.w.z. tellen niet cellen die de onderzijde of de linker grenzen raken).
      Opmerking: Elke 4 x 4-kwadrant moet tussen de 50-150 cellen bevatten. Te weinig of te veel cellen kunnen leiden tot een over of onderschatting van celaantal.
    6. Gemiddelde de cel totaal telt uit elk van de 4 x 4 kwadranten, te vermenigvuldigen met 10 4, en dan te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor (celsuspensie naar Trypan blue) voor het berekenen van aantal cellen per mL.
    7. Het aantal cellen per milliliter te vermenigvuldigen met het totale volume van de celsuspensie voor het berekenen van het rendement van de cel totaal.
      Opmerking: Ongeveer 100 miljoen cellen worden verwacht van isolatie beginnen met 80-120 g van villous weefsel.
  6. Plating cellen
    1. plaat 3 miljoen cellen per putje (3.3 x 10 5 cellen per cm 2) in een 6-well plaat (2 mL van een schorsing per putje) en zachtjes heen en weer rock en kant naar kant gelijkmatig verdelen de cellen.
      Opmerking: Trophoblasts vereisen Weefselkweek behandeld platen te houden goed. Een monolayer van cellen is vereist ter bevordering van syncytialization.
    2. Laat de vergulde cellen in de kap van de laminaire flow gedurende ongeveer 30 minuten om cellen te gelijkmatig te verspreiden, te regelen, en beginnen zich te houden aan de onderkant van de putten alvorens in de incubator.
    3. Cultuur cellen voor maximaal 72 uur (met dagelijkse wijzigingen van de media) in een incubator 37 ° C met 5% CO 2 en 95% vochtigheid.
      Opmerking: Controleer de trophoblasts onder een microscoop bij 10-20 x elke 24 h van cultuur. Trophoblasts niet vermenigvuldigen en niet kan worden gepasseerd. In de loop van 72 h van de cultuur, de ronde individuele trophoblasts zekering om te vormen van een syncytium ( figuur 3A en B).
  7. Bevriezing cellen
    1. Pellet ongebruikte cellen door centrifugeren bij 1250 x g gedurende 10 minuten bij 20 ° C.
    2. Gecombineerd zoveel media mogelijk van de pellet.
    3. Resuspendeer de pellet in de bevriezing van de media (tabel 3).
    4. Bevriezen de aliquots bij-80 ° C in een bevriezing container gevuld met 100% isopropanol. Overbrengen in de bevroren aliquots vloeistof N 2 de volgende dag voor lange termijn opslag.
      Opmerking: Cellen gekweekt kunnen worden na invriezen.
  8. Ontdooien cellen
    1. verwijderen van een aliquoot deel van bevroren cellen en ontdooien in een waterbad 37 ° C terwijl zwenken. Verwijderen van het afgepipetteerde deel uit het waterbad, net voordat het heeft volledig ontdooid tot een vloeistof.
    2. Onmiddellijk overbrengen in de ontdooide cellen een conische buis 15 ml. Begin vertragen aanvankelijk, voeg 10 mL van de volledige media met het mengen van intermitterende.
    3. Omkeren buis meerdere malen te mengen.
    4. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 20 ° C.
    5. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in warme volledige media 2-5 mL.
    6. Rekenen de cellen en de plaat zoals hiervoor is beschreven.

3. Behandeling van primaire Trophoblasts met TNFα collectie van cel Lysates en westelijke bevlekken

  1. voorbereiding
    1. Warm volledige media tot 37 ° C.
    2. Maken van een voorraad van 10 µg/mL van TNFα in volledige media en opslag bij-20 ° C tot parasols.
    3. Maak een 1 µg/mL werken voorraad van TNFα in volledige media als u klaar bent voor de behandeling van de cellen. Seriële Verdun de TNFα werken voorraad 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL en 125 pg/mL in volledige media.
      Opmerking: De TNFα concentratie van 10 4 pg/mL is matig cytotoxische. Aanpassing van de concentraties van de TNFα getest zal afhangen van de specifieke kenmerken van de gewenste downstream toepassingen.
  2. Behandeling van cellen met TNFα
    1. gecombineerd na 24 h van de cultuur, de media van de cultuur van de cellen en vervangen met 2 mL TNFα aangevuld medias per putje op 6-Wells-platen (ten minste twee putten per behandeling en voertuig Control).
    2. Na 24 h blootstellingsduur TNFα-48 h van cultuur, vervangen de medias TNFα aangevuld met volledige media.
  3. Oogst cellen en totale proteïne
    1. na 72 uur van cultuur (24 h verleden verwijdering van TNFα) gecombineerd media voorzichtig spoelen cellen met kamertemperatuur PBS en voeg 80 µL van ijskoud Radioimmunoprecipitation Assay Buffer (RIPA) met vers protease en phosphatase inhibitors (tabel 3) direct aan elk putje toegevoegd.
    2. Verwijder de cellen van de plaat met een cel schraper. De cellen overbrengen in een 1,5 mL microcentrifuge buis, bundeling van putten binnen behandelgroepen.
    3. Lyse de cellen door vortexing de buizen op hoge voor ten minste drie intervallen van 15 s.
    4. Incubeer de cellen bij 4 ° C met rockende voor 15 min.
      Opmerking: u kunt ook na stap 3.3.3., de cellen kunnen worden geïncubeerd op ijs gedurende 15 minuten met intermitterende agitatie door flicking de buis, vortexing, of pipetteren omhoog en doenWN.
    5. Herhaal stap 3.3.3.
    6. Centrifugeren van de buizen bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot cellulaire puin pellet.
    7. Overdracht het supernatant (met cellulaire eiwit) om een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis en sla op -80 ° C.
      Opmerking: Het protocol kan worden gestopt hier en op een later tijdstip hervat. Het is raadzaam om verschillende hoeveelheden van cellulaire EiwitSteekproeven om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli.
    8. Totaal eiwitconcentratie te bepalen door een voorkeur, zoals een bicinchoninic zuur assay (BCA, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal).
  4. SDS-pagina en het westelijke bevlekken voor Rubicon of eiwit van belang
    Opmerking: Volg Westelijke Bevlekkende Protocollen volgens fabrikant ' s-instructies met behulp van een systeem van aangewezen laboratorium.
    1. Belasting tussen 20-40 µg totaal eiwit in monster buffer (tabel 3) per putje op een 12% acrylamide gel. Afzonderlijke proteïnen door SDS-PAGE in rijklare buffer (tabel 3).
    2. Natte-overdracht de eiwitten uit de gel aan een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan volgens fabrikant ' s instructies in overdracht buffer (tabel 3).
    3. Incubeer het membraan in 5% melkpoeder in zoute Tris-Buffered met 0,1% Tween-20 (TBST, tabel 3) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur met rockende.
    4. Incubeer het membraan in een Rubicon primair antilichaam (zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) op 1:500 in 1% melkpoeder in TBST's nachts bij 4 ° C met rockende.
    5. Voorzichtig wassen het membraan 3 x 5 min in TBST en 1 x 5 min in TBS bij kamertemperatuur met rockende.
    6. Incubeer het membraan in 1:2000 - 1:5000 secundair antilichaam (HRP-gekoppeld of voorkeur zichtbaar conjugaat, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) in 5% melkpoeder in TBST gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur met Rocking.
    7. Herhaal de wassen procedure in stap 3.4.5 en visualiseren van de vlek met een passende visualisatie (d.w.z. chemiluminescentie) substraat op een imaging systeem.
    8. Herhaal de wassen procedure in stap 3.4.5 en sonde het membraan voor β-actine of een besturingselement voorkeur laden volgens de fabrikant ' s instructies.
    9. Op de software van de analyse van de preferent spiegelbeeld, analyseren de expressie van Rubicon door handmatige kwantificering van absorptie (band intensiteiten), controle aftrekken van de extinctie van de achtergrond en de normalisatie bij het laden van de bijbehorende band intensiteiten. Het uitvoeren van statistische analyses om te testen voor statistisch significante veranderingen in eiwitniveaus.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termijn van menselijke placentas van lean (pre-zwangerschap index van de lichaamsmassa (BMI) < 25) moeders met ongecompliceerde zwangerschappen uitvoering van vrouwelijke nakomelingen werden verzameld en bemonsterd binnen 15 minuten na levering door keizersnede (geen arbeid). De placentas werden onderzocht voor het ontbreken van kalkafzettingen en typische ontwikkeling: weegt tussen 300-600 g met de navelstreng en membranen verwijderd, ronde in vorm, tussen 15-25 cm in diameter en nav...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De placenta, verantwoordelijk voor de regulering van de groei van de foetus, vertoont gecompromitteerde functie in de zwaarlijvige milieu-6. Ondanks de hoge metabole eisen van trophoblasts vertonen placentas met moeders obesitas disfunctionele mitochondriale ademhaling6,19. Veranderingen in de placenta metabolisme kunnen bijdragen aan de toename van complicaties en negatieve foetale effecten waargenomen in zwaarlijvige zwangerschappen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken vrouwen die gedoneerd hun placentas voor dit onderzoek. Wij danken ook de arbeid en de afdeling van de levering bij OHSU en de moeders en foetale onderzoeksteam voor de coördinatie van de verzameling van placentas. Wij zijn dankbaar Eric Wang, Ph.D., en Kelly Kuo, MD voor ondersteuning en helpen met experimentele methoden en optimalisatie.

Dit werk werd gefinancierd door de NIH HD076259A (AM) en AHA GRNT29960007 (AM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10X HBSSGibco14185-052
CaCl2 (anhyd.)Sigma-AldrichC1016-100G
MgSO4 (anhyd.)Sigma-AldrichM7506-500G
HepesFisher ScientificBP310-500
TrypsinGibco15090-046
DNAseWorthington Biochemical Corp.LS002139
Protease/Phosphatase inhibitorsThermofisher Scientific88668
Tris HClInvitrogen15506-017
EDTAInvitrogen15576-028
NaClSigma-AldrichS7653-1KG
SDSFisher ScientificBP166-600
Sodium deoxycholate.Fisher ScientificAAJ6228822
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)Gibco12440-046
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-010-CV
Neonatal Calf Serum (NCS)Gibco26010-074
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)Gibco15140-122
10% FormalinFisher Scientific23-427-098
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
TNFαSigma-AldrichSRP3177-50UG
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco70013-032
K2EDTA vacutainer blood collection tubesBD366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM)GE Healthcare17-0891-01
6 well platesCorning353046
Cell strainersFisher Scientific22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, naturalFisher Scientific22363352
Trypan BlueCorning25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot CellBio-Rad1658033
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad1610175
Mini-Protean 3 Multi-Casting ChamberBio-Rad1654112
4X Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148-100ML
GlycineBio-Rad1610718
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ML
Instant Nonfat Dry MilkCarnation
Rubicon (D9F7) Rabbit mAbCell Signalling Technology8465S
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouseSigma-AldrichA2228-100UL
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signalling Technology7074S
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signalling Technology7076S
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34578

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
  4. Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
  5. Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
  6. Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
  7. Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
  8. Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
  9. Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
  10. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  11. Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
  12. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  13. Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
  14. Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
  15. Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
  16. Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
  17. Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
  18. Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
  19. Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
  20. Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
  21. Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
  22. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
  23. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
  24. Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
  25. Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975(2014).
  26. Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
  27. Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

TrophoblastisolatievillusweefselbemonsteringTNF alfabehandelingprimaire celkweekWestern blottingimmunocytochemische analysedichtheidsgradi ntcentrifugatieRubicon expressiematernaal obesitasmodelautofagieregulatie

Gerelateerde artikelen