Methodenartikel

Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties

DOI:

10.3791/56492

⸱

31 oktober 2017

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript wordt de procedure beschreven om te fabriceren en karakteriseren van Griffithsin gemodificeerde poly (melkzuur-co-glycolic zuur) electrospun vezels waaruit krachtige lijm en antivirale activiteit tegen humaan immunodeficiëntie virus type 1 infectie in vitro. Methoden die worden gebruikt voor het synthetiseren, oppervlakte-wijzigen, en de resulterende morfologie, conjugatie, karakteriseren en desorptie van Griffithsin van oppervlak gemodificeerde vezels worden beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electrospun vezels (EFs) hebben op grote schaal gebruikt in een verscheidenheid van therapeutische toepassingen; echter hebben ze pas onlangs zijn toegepast als een technologie ter voorkoming en behandeling van seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA's). Bovendien, vele EF technologieën gericht op encapsulating het actieve agens, ten opzichte van het gebruik van het oppervlak te geven biofunctionality. Hier beschrijven we een methode om te fabriceren en oppervlakte-poly(lactic-co-glycolic) zuur (PLGA) electrospun vezels, met de krachtige antivirale lectine Griffithsin (GRFT) te wijzigen. PLGA is een FDA-goedgekeurde polymeer dat wijd verbeid in drug delivery vanwege haar uitstekende chemische en biocompatibel eigenschappen gebruikt is. GRFT is een natuurlijke, krachtige, veilige lectine die bezit brede activiteiten tegen talrijke virussen met inbegrip van humaan immunodeficiëntie virustype 1 (HIV-1). Wanneer gecombineerd, hebben GRFT gemodificeerde vezels potente inactivatie van HIV-1 in vitroaangetoond. Dit manuscript worden de methoden beschreven om te fabriceren en karakteriseren van GRFT gemodificeerde EFs. Ten eerste, is de PLGA electrospun maken van een fiber-steiger. Vezels zijn vervolgens oppervlak-bewerkt met GRFT met 1-Ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) chemie. Scanning elektronen microscopie (SEM) werd gebruikt voor het beoordelen van de grootte en morfologie van oppervlak gemodificeerde formuleringen. Bovendien, een gp120 of hemagglutinine (HA)-gebaseerde ELISA kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de hoeveelheid geconjugeerd met GRFT, evenals GRFT desorptie van het oppervlak van de vezel. Dit protocol kan ruimer worden toegepast om het fabriceren van vezels die oppervlakte-bewerkt met een verscheidenheid van verschillende eiwitten zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van EFs als een actuele levering-platform heeft de potentie om beduidend te verminderen SOA's. Momenteel zijn er meer dan 36 miljoen mensen met HIV, met meer dan twee miljoen nieuwe gevallen van gemelde in 2015 alleen1,2. Bovendien, herpes simplexvirus type 2 (HSV-2) infectie beïnvloedt honderden miljoenen mensen wereldwijd en is aangetoond dat het verbeteren van de verwerving van HIV door 2-5 voudige3. Vanwege deze relatie tussen HSV-2 infecties en HIV verwerving is er significant belang bij de ontwikkeling van nieuwe werkzame stoffen die gelijktijdige bescherming tegen meerdere SOA's bieden. Bovendien, de ontwikkeling van nieuwe voertuigen ter verbetering van de levering van deze antivirale middelen biedt de mogelijkheid om beschermende en therapeutische potentie verder te verbeteren. Richting van dit doel, zijn EFs onderzocht als een nieuwe levering platform ter vermindering van de prevalentie van HIV-1 en HSV-2 infecties.

Tijdens de afgelopen twee decennia, hebben de EFs uitgebreid op het gebied van drug delivery en weefsel engineering4is gebruikt. Vaak, worden biocompatibel polymeren geselecteerd om gemakkelijk vertalen naar therapeutische toepassingen. Om te fabriceren polymere EFs, wordt het geselecteerde polymeer opgelost in een organisch oplosmiddel of waterige oplossing, afhankelijk van de mate van polymeer hydrophobicity5. Actieve stoffen van belang worden vervolgens toegevoegd aan de oplosmiddelen of waterige oplossing vóór het electrospinning proces. De polymeeroplossing is vervolgens aanzuiging in een spuit en langzaam uitgeworpen terwijl hij onder een elektrische stroom. Dit proces resulteert meestal in polymeer vezels met blad of cilindrische macrostructures (Figuur 1) en vezel diameters variërend van de micro - naar nano-schaal6. Voor de meest therapeutische toepassingen, werkzame stoffen zijn opgenomen in de vezels tijdens het electrospinning en worden vrijgelaten uit de vezel via diffusie en aantasting van de latere vezel. Het tempo van de degradatie of release kan worden gewijzigd met behulp van verschillende soorten polymeren of polymeer combineert om een profiel van de gewenste versie, unieke chemische en fysische eigenschappen7meegeven, en het bevorderen van de inkapseling van vrijwel elk samengestelde. Als zodanig, hebben EFs bewezen gunstig zijn voor de levering van kleine molecuul drugs en biologische agentia zoals eiwitten, peptiden, oligonucleotides en groeifactoren6,8,9.

Op het gebied van STI-preventie, zijn EFs onlangs gebruikt om te nemen en te zorgen voor aanhoudende - of afleidbare-release van antivirale middelen10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. In één van de vroegste studies, werden pH-responsieve vezels ontwikkeld om actieve agenten in reactie op veranderingen in het milieu binnen het vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT), vrij te geven als een methode op afroep van bescherming tegen HIV-111. Sinds, hebben andere studies onderzocht polymere blends samengesteld uit polyethyleen oxide (PEO) en poly-L-lactic acid (PLLA), om te evalueren van het afstembare vrijkomen van antivirale en contraceptieve agentia voor HIV-1 preventie en contraceptie in vitro 12. aanvullende studies hebben aangetoond dat de haalbaarheid van EFs te bieden het volgende: verlengd release van klein molecuul antivirale middelen14, sterke en flexibele mechanische eigenschappen20, 3D-levering platforms21 , remming van sperma penetratie12, en de mogelijkheid om te fuseren met andere levering technologieën13. Ten slotte heeft de vorige werk polymere vezels voor de aanhoudende-levering van antivirale middelen tegen gemeenschappelijk co-infective virussen, HSV-2 en HIV-114geëvalueerd. In deze studie geleverd polymeer vezels complementaire activiteit tot antivirale levering door behoud van hun structuur voor maximaal 1 maand en het verstrekken van een fysieke barrière aan virale post. Uit deze resultaten werd naar voren gebracht dat EFs kunnen worden gebruikt voor zowel fysisch en chemisch belemmeren virusinfectie.

Terwijl afstembare release eigenschappen polymere EFs een aantrekkelijke levering platform voor microbiciden levering maken, zijn EFs in andere toepassingen om te dienen als oppervlak gemodificeerde steigers7ontwikkeld. EFs gebruikt om na te bootsen de morfologie van de extracellulaire matrix (ECM), vaak op de hoedanigheid van steigers verbeteren van cellulaire regeneratie22, en verhogen hun nut in weefsel engineering23,24. Vezels bestaat uit polymeren zoals poly-ε-caprolacton (PCL) en PLLA zijn oppervlak-bewerkt met groeifactoren en eiwitten na electrospinning naar ECM-achtige eigenschappen met inbegrip van verhoogde cellulaire hechting en proliferatie25 , 26. Daarnaast antimicrobiële oppervlak gemodificeerde EFs zijn geëvalueerd om te voorkomen dat de groei van specifieke pathogene bacteriën27,28. Door deze veelzijdigheid en de mogelijkheid voor het opwekken van biologische effecten, blijft EF technologie uitbreiden in allerlei velden multi mechanistische functionaliteit te bieden. Nog, ondanks hun nut in een verscheidenheid van toepassingen, oppervlak gemodificeerde vezels hebben pas onlangs onderzocht in het microbicide veld29.

Parallel met de ontwikkeling van nieuwe technologieën van de levering te voorkomen en behandelen van SOA's, nieuwe biologische therapeutics zijn ontwikkeld. Een van de meest veelbelovende microbicide kandidaten is de zelfklevende antivirale lectine, GRFT30. Oorspronkelijk afkomstig uit een soort van rode algen, GRFT heeft bewezen activiteit als een krachtige remmer van HIV, HSV-2, SARS, evenals het Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. In feite onder biologisch gebaseerde remmers, GRFT heeft de meest krachtige anti-HIV-activiteit, inactiveren HIV-1 bijna onmiddellijk bij contact30, terwijl het handhaven van de stabiliteit en activiteit in aanwezigheid van de voedingsbodems van vaginale microben voor maximaal 10 dagen37. Meer recentelijk, een 0,1% GRFT gel bleek te beschermen tegen intravaginal uitdaging van de HSV-2, waardoor het een veelbelovende kandidaat voor de eerste regel van de bescherming tegen HSV-2 zowel HIV-132 muizen, 38. voor HIV specifiek, GRFT remt infectie door fysiek gp120 of terminal mannose glycan N-gebonden residuen te binden op virale envelop oppervlakken om te voorkomen dat post38,39,40,41 ,42. Deze remming is zeer krachtig, met IC50s 3 ng/mL43naderen. Naast remming van HIV-infectie, hebben studies ook aangetoond dat GRFT tegen HSV-2 infectie beschermt door remming van de cel-naar-cel verspreiding van het virus-32. In alle gevallen, heeft GRFT aangetoond dat het lijm virale deeltjes, worden terwijl de hoge weerstand tegen denaturatie demonstreren. Laatste GRFT heeft aangetoond dat synergetische activiteit met combinaties van Tenofovir (TFV) en andere antivirale middelen44, waardoor het haalbaar en waarschijnlijk gunstig zijn voor mede beheren met EFs. De krachtige eigenschappen van GRFT maken een uitstekende biologisch gebaseerde antivirale kandidaat, waarin de levering kan worden verbeterd met EF-technologie.

Gebruik makend van deze kennis van de zelfklevende en aangeboren antivirale eigenschappen van GRFT, is een polymere vezel-steiger ontworpen, die deze eigenschappen integreert zodat de eerste laag van virus vermelding remming29. Het vinden van inspiratie in de weg dat cervicovaginal slijm virus vervoer voornamelijk door middel van mucoadhesive mucin interacties belemmert, hypothetische wij die met behulp van EFs als een steiger en covalent wijzigen het oppervlak met een hoge dichtheid van GRFT, oppervlakte-geconjugeerde GRFT zou knelpunten en inactivering van virus op haar toegangspunt45,46,47. Hier werden EFs ontwikkeld als een stationaire steiger een op basis van eiwitten, virale lijm-inactiveren barrière platform te bieden. Wij willen combineren de krachtige antivirale eigenschappen van GRFT met een biocompatibele, aanpasbaar en duurzaam polymeer-platform, maak je een roman virus "val".

Om deze doelen te bereiken, werden vezels bestaat uit PLGA electrospun, en EDC-NHS Scheikunde werd gebruikt om vervolgens het wijzigen van het oppervlak van de EF met GRFT. PLGA diende als een model polymeer vanwege haar uitgebreide gebruik in electrospinning48, gecombineerd met de biocompatibiliteit en kosteneffectiviteit. Bovendien, oppervlakte modificatie exploiteert de grote oppervlakte van EFs en biedt een nuttig alternatief dat kan worden gecombineerd met inkapseling te maximaliseren vezel hulpprogramma49. In tegenstelling tot traditionele inkapseling methoden waar slechts een gedeelte van de GRFT is beschikbaar (en slechts Transient presenteren in de FRT), kunnen de oppervlakte wijziging GRFT om maximale topicale tijdens de gehele duur van de behandeling. Bovendien, de opneming van hydrofiele stoffen zoals eiwitten, door traditionele electrospinning methoden, kan resulteren in lagere inkapseling efficiëntie en verlies van eiwit activiteit50. Daarom kunnen GRFT oppervlak gemodificeerde vezels bieden een veelbelovende alternatieve leveringsmethode die alleen of in combinatie met electrospinning kan worden gebruikt ter verbetering van de bescherming tegen SOA-infectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding en fabricage van de steiger van de vezel Electrospun

Let op: alle werkzaamheden met oplosmiddelen of Polymeeroplossingen moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast . Verwijzen naar materiële veiligheid gegevensblad van elk reagens voordat het protocol.

  1. Naar electrospin een polymeeroplossing 3 mL 15% w/w PLGA, weeg 720 mg 50:50 poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA; 0,55 tot 0,75 dL/g, 31-57 kDa) in een flesje van 10 mL scintillatie. Het volume van de oplossing is gebaseerd op de typische batch grootte gebruikt in huidige studies.
    Opmerking: De massa van het polymeer toe te voegen aan een bepaalde hoeveelheid oplosmiddel moet worden berekend door de eerste bepaling van de dichtheid van het oplosmiddel gebruikt te ontbinden van het polymeer. De dichtheid van het oplosmiddel Hexafluoro-2-propanol (HFIP) is 1,59 g/mL. Dus, het gewicht van het oplosmiddel, gebaseerd op een volume van 3,0 mL HFIP nodig, bedraagt 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Voor een 15% w/w-Fractie van PLGA naar HFIP, 720 mg PLGA moet worden toegevoegd aan 3,0 mL HFIP (0,15 x 4800 mg = 720 mg). Het voordeel van het gebruik van een % w/w/polymeeroplossing, in plaats van % w/v, is dat hierdoor een bepaald gewicht van de uiteindelijke oplossing. Deze gedefinieerde gewicht kunt nauwkeuriger oplosmiddel vervanging, in het geval van verdampend oplosmiddel tijdens stap 1.3.
  2. Aan de glazen Scintillatie ampul met PLGA (uit stap 1.1) 3.0 mL HFIP toevoegen met behulp van een precisiepipet serologische glas. Dekking van de flacon met plastic folie, dan meten en registreren van de flacon mass.
  3. Broeden de opschorting van de polymeer 's nachts bij 37 ° C om ervoor te zorgen volledige ontbinding van het polymeer. Als elk oplosmiddel verdampt, verminderen de flacon massa, HFIP toevoegen totdat de flacon bereikt haar oorspronkelijke massa in stap 1.2.
  4. Na een incubatieperiode van, het bereiden van het electrospinning apparaat ( Figuur 2). Hoewel een as van elke omvang kan worden gebruikt, hier een roterende 25 mm buitendiameter RVS as werd gebruikt als de collector.
    Opmerking: Een groter as diameter zal dalen de dikte van de vezel, gezien de dezelfde hoeveelheid electrospinning oplossing.
  5. De polymeeroplossing gecombineerd in een spuit met 3 mL.
  6. Een stomp 18-gauge, ½ inch naald tip verbinden met de spuit en afzien van de overtollige oplossing (meestal 0,25 mL) te verwijderen lege headspace de naald tip.
  7. Plaats van de spuit op een spuitpomp en het debiet instrument ingesteld op 2,0 mL/h.
    Opmerking: Dit debiet was eerder geoptimaliseerd op basis van polymeer viscositeit voor deze formulering.
  8. Verbinden met de krachtbron de naald van de spuit en electrospin de polymeeroplossing met behulp van een spanning van + 27 kV. De afstand tussen de naald en de verzamelaar moet worden ingesteld op ongeveer 25 cm ( Figuur 2 B).
    Let op: Het electrospinning-proces zorgt voor een oplosmiddel damp. Gebruik een zuurkast of een afgesloten apparaat ( Figuur 2) te verwijderen van de schadelijke damp .
  9. Zodra de hele oplossing electrospun is, uitschakelen van de krachtbron en laten van de as te draaien voor een extra 30 min te volledig verdampen oplosmiddel.
  10. Beurt uit de roterende as verzamelaar, en gebruik een scheermesje te snijden van de vezel van de as. Schil voorzichtig de vezel van de as van het mes kunt.
  11. De electrospun PLGA vezel in een gelabelde petrischaal verzamelen en plaatsen in een desiccatorovernight te verwijderen van de resterende oplosmiddel.

2. Oppervlakte-wijziging van vezels met GRFT

  1. voorbereiden oplossingen van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES buffer). PBS voor te bereiden door het oplossen van 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g nb 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 L ultrazuiver water. Op dezelfde manier los 19.52 g MES (vrij zuur, MW 195,2) en 29.22 g NaCl in 1 L ultrazuiver water, te bereiden MES buffer. Zorgen voor de definitieve pH van elke oplossing is tussen 7.2-7.5 en 5.0-6.0, respectievelijk met behulp van een pH-meter.
  2. Bereiden individuele werkende oplossingen van EDC (2 mM) en NHS (5 mM).
    1. De EDG en de NHS verwijderen uit de vriezer en laten equilibreer tot kamertemperatuur voordat weging.
    2. Weeg 4 mg EDC in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL.
    3. Weeg NHS in een ander microcentrifuge buis 6 mg.
    4. Add 1 mL MES buffer aan elke buis. Vortex beide buizen krachtig om ervoor te zorgen de reagentia worden volledig opgelost.
  3. Bereid een oplossing van hydroxylamine door weging van 70 mg in een conische centrifugebuis van 50 mL.
  4. Voeg toe 20 mL PBS aan de hydroxylamine en vortex te ontbinden.
  5. Massa uit een passend bedrag van PLGA vezel in een tube van 15 mL conische centrifuge. 75 mg van vezel wordt meestal gebruikt voor elke reactie partij.
  6. 8 mL MES buffer toevoegen aan de tube van 15 mL.
  7. Add 1 mL, elk van de oplossingen van het EDG en NHS eerder bereid om de buis. Het uiteindelijke volume van de oplossing moet 10 mL. De eindconcentraties van EDC en NHS moet 0.4 mg/mL en 0,6 mg/mL, respectievelijk.
  8. Dicht en verzegel de tube van 15 mL met plastic folie en plaats op een rotator zodat de oplossing moet voorzichtig worden omgekeerd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur ( Figuur 3 B). Deze stap activeert de carboxylgroepen op het polymeer te voorzien van covalente modificatie met het eiwit GRFT ( Figuur 3 A).
  9. Na activering, zorgvuldig doven de reactie door 14 µL van β-mercaptoethanol toe te voegen aan de buis. Omkeren van de buis meerdere malen om ervoor te zorgen volledige mengen.
    Let op: β-mercaptoethanol is zeer giftig en mag alleen worden gebruikt in een chemische zuurkast.
  10. Verwijder het supernatant en spoel de vezel PLGA tweemaal, met 10 mL PBS, verwijderen van alle resterende β-mercaptoethanol.
  11. Toevoegen na het spoelen, een passend bedrag van de stockoplossing van GRFT aan de buis. Bijvoorbeeld, zou een 5 nmol GRFT/mg vezel 6.35 µL van GRFT stockoplossing (uit een voorraad van de 10 mg/mL) per mg vezel vereisen. Dus een steekproef van de vezel 75 mg zou vereisen 476.25 µL van 10 mg/mL stockoplossing van GRFT.
    Opmerking: GRFT vezels met theoretische belastingen van 0.05, 0.5 en 5 nmol GRFT per mg vezel werden gefabriceerd.
  12. Toevoegen van genoeg PBS om het eindvolume tot 8 mL, sluit en omkeren van de buis om ervoor te zorgen dat grondig mengen.
  13. Zegel van de buis met plastic folie en leg op een rotor opnieuw, dit keer voor 2 h.
  14. Na de 2 h incubatie, doven de reactie door toevoeging van 2 mL van hydroxylamine oplossing in de centrifugebuis 15 mL. Per de instructies van de fabrikant, dient de eindconcentratie van hydroxylamine tijdens het blussen reactie 0,7 mg/mL.
  15. Meng de oplossing goed en verwijder het supernatant. Spoel het oppervlak gemodificeerde PLGA vezel tweemaal met 10 mL ultrazuiver water te verwijderen van een unconjugated GRFT.
  16. Overbrengen in de vezel een petrischaal en de plaats in een exsiccator tot de vezel volledig droog is. De petrischaal overbrengen in 4 ° C voor opslag.

3. SEM karakterisatie van de oppervlakte van de GRFT gemodificeerde vezels

  1. plaats een strook van koolstof dubbelzijdige tape op een SEM specimen mount. De onderkant van de berg specimen van een label met de monster identificerende informatie met behulp van een permanent marker.
  2. Drie monsters uit één oppervlak gemodificeerde vezel te snijden en leg ze op aparte specimen mounts. De dikte van elk monster is ongeveer 0,5 mm.
  3. Sputter jas de monsters met behulp van elektron-geïnduceerde deeltjes depositie van een plaat van goud. Sputter jas voor 90 s, van 2,4 kV.
    Opmerking: De sputter vacht tijd kan variëren afhankelijk van de parameters van de apparatuur, met inbegrip van de spanning en stroomsterkte.
  4. Beeld van de monsters bij 8 kV met een vergroting variërend van 1.000 tot en met 5, 000 X.

4. Winning van GRFT van oppervlak gemodificeerde vezels

  1. massa uit vezels in drievoud in 1,5 mL microcentrifuge buizen 2 mg.
  2. 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) toevoegen aan de buis, vervolgens vortex en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur te volledig het ontbinden van de vezel.
  3. Na incubatie, Verdun een hoeveelheid van 10 µL de oplossing van DMSO-vezel uit stap 4.2, ten minste 100-fold in Tris-EDTA (TE) buffer (pH = 8.0).
  4. Bewaren monsters bij-20 ° C tot laden karakterisering met ELISA.

5. Meten van GRFT desorptie van vezels

  1. te beoordelen van de hoeveelheid GRFT vrijgegeven of uit de vezel, gedesorbeerde Weeg 5-10 mg oppervlak gemodificeerde vezel en breng dit in een microcentrifuge buis. Opnemen van de massa van de vezels in elke buis.
  2. Voeg 1 mL van een geschikte oplossing die de fysiologische omgeving bootst (b.v., PBS, TE buffer, gesimuleerde vaginaal vocht (SVF), enz.) aan elk monster.
  3. Broeden de monsters gedurende 1 uur op een roterende shaker op 200 rpm, 37 ° C.
  4. Na incubatie, TE buffer met de gedesorbeerde GRFT uit de flacon en aliquot aan cluster verwijderen ongeveer 1 mL tubes. Opslag bij-20 ° C tot eiwit kwantificering.
  5. Overbrengen van het monster naar een nieuwe microcentrifuge-buis, voeg 1 mL verse bufferoplossing naar de fiber binnen de microcentrifuge buis en incubeer tot de volgende tijdstip.
  6. Typische tijd punten gebruikt voor het meten van release zijn onder meer: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h en 1 wk. te verwaarlozen desorptie in deze studies werd waargenomen na 4 h.

6. Kwantificering van GRFT extractie en desorptie via ELISA

  1. jas een 96-Wells-ELISA plaat met 0,1 mL HA (10 µg/mL) per putje zoals eerder beschreven 51. Afdichting van de plaat met plastic folie en na een nacht bebroeden bij 4 ° C ( Figuur 4).
  2. De buffer coating verwijderen en toevoegen van 0.3 mL blokkeerbuffer (2-3% bovien serumalbumine (BSA) in PBS met 0,05% Polysorbaat 20) aan elk putje. De plaat gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  3. Na incubatie, spoel de plaat 3 keer met 1 x PBS met 0,1% Polysorbaat 20 (PBS-P). Na het spoelen, afzien 0,1 mL van het monster, standard of PBS als negatieve controle in de respectieve putten. De plaat opnieuw gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  4. Spoel de plaat weer 3 keer met PBS-P. Na het spoelen, Voeg 0,1 mL primair antilichaam (geit anti-GRFT antiserum) in elk putje en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur. Typisch, de oplossing van primair antilichaam wordt verdund door 1:10,000 in PBS.
  5. Nadat het broeden de monsters met primair antilichaam spoelen de platen weer 3 keer met PBS-P. Voeg 0,1 mL secundair antilichaam (horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd konijn anti-geit IgG) aan elk goed en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De oplossing van secundair antilichaam wordt verdund door 1:10,000 in PBS.
  6. Wassen de plaat 3 keer. Voeg 0,1 mL TMB 2-peroxidase substraat toe aan elk putje. Monitor kleur ontwikkeling (ongeveer 2 min), dan toevoegen van 0,1 mL H 2 dus 4 (1 N) om quench de reactie. Lees plaat bij 450 nm op een afleesapparaat.
  7. Gemiddelde OD-waarden van de achtergrond (wells waaraan alleen PBS), en dit aftrekken van de experimentele groepen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morfologie van de vezel heeft een significant effect op het vermogen van EFs oppervlak gemodificeerde bescherming te bieden tegen virussen. Hoewel electrospinning een handige en eenvoudige procedure is, niet-geoptimaliseerde polymeer formuleringen kunnen leiden tot onregelmatige vezel morfologie (Figuur 5B-C). Wijzigingen in electrospinning omstandigheden die leiden de vorming van kralen of amorfe mat-achtige morphologies tot, worden vaak ver...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als gevolg van hun poreuze structuur en een groot oppervlak, hebben EFs gevonden een scala aan toepassingen in de gezondheidszorg, waarvan er één portie als therapeutische leverende voertuigen omvat. Drugs en andere actieve stoffen kunnen worden opgenomen binnen EFs voor afstembare levering, terwijl biologics en chemische liganden kunnen worden geconjugeerd met het oppervlak van de vezel voor cel-specifieke targeting52 of biosensing53. Hier gemodificeerde de fabricage van G...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn dankbaar aan het joodse erfgoed Fonds voor uitmuntendheid voor financiering van dit onderzoek. Wij danken Dr. Stuart Williams II royaal voorzien van gebruik van het electrospinning-systeem. Wij danken ook Dr. Kenneth Palmer voor ons te voorzien van Griffithsin. Daarnaast danken we Dr. Nobuyuki Matoba en zijn lab voor opleiding die ons in de GRFT ELISA werken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50LactelB6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Scientific 147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2Brico Medical SuppliesBN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tipVWR309657
Parafilm (plastic film)Sigma AldrichP7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)Sigma AldrichM3671 
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Potassium ChlorideSigma AldrichP9333
Sodium phosphate dibasicSigma AldrichS7907
Potassium phosphate monobasicSigma AldrichP0662
Hydroxysuccinimide (NHS)Thermo Scientific 24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo Scientific 22980
2-MercaptoethanolFisherBP176
Griffithsin (GRFT)Kentucky BioprocessingNAop maat gemaakt, geen productnummer
Dimethyl SulfoxideMilipore317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)Sigma AldrichP9416 
Tris EDTA BufferSigma Aldrich93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well PlatesThermo Scientific 3355
Influenza Hemagglutinin (HA)Kentucky BioprocessingNAop maat gemaakt, geen productnummer
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)Kentucky BioprocessingNAop maat gemaakt, geen productnummer
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)Santa Cruz2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL52-00-00

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792(2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108(2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635(2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fabricage van elektrogesponnen vezelsPLGA elektrospinnenOppervlaktemodificatiechemieGriffithsin HIV 1 inactivatieScanning elektronenmicroscopie analyseELISA eiwitkwantificeringEDC NHS conjugatieKarakterisering van vezelmorfologieAntivirale geneesmiddelentoediening

Gerelateerde artikelen