Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

10.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56508

⸱

6 februari 2018

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Samenvatting

Monoclonal antilichamen (mAbs) zijn krachtige instrumenten nuttig voor zowel fundamenteel onderzoek en medische biologie. Hun hoge specificiteit is onmisbaar wanneer het antilichaam moet onderscheid worden gemaakt tussen sterk verwante structuur (b.v., een normaal eiwit en een gemuteerde versie ervan). De huidige manier van het genereren van dergelijke discriminerende mAbs omvat uitgebreide screening van meerdere B Ab-producerende cellen, die is zowel duur en tijdrovend. Wij stellen hier een snelle en kosteneffectieve methode voor de generatie van discriminatoire, volledig mens mAbs vanaf menselijk bloed circuleren van B-lymfocyten. De originaliteit van deze strategie is te wijten aan de celselectie specifiek antigeen bindende B gecombineerd met de contra selectie van alle andere cellen, met behulp van gemakkelijk beschikbare perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Zodra bepaalde B-cellen geïsoleerd zijn, worden cDNA (bijkomende deoxyribonucleic acid) sequenties codering voor de overeenkomstige mAb verkregen met behulp van eencellige Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) technologie en vervolgens uitgedrukt in mens cellen. Binnen zo weinig als 1 maand is het mogelijk om te produceren milligram van hoogst discriminatoire menselijke mAbs gericht tegen vrijwel elke gewenste antigeen natuurlijk gedetecteerd door de B-cel-repertoire.

Inleiding

De hier beschreven methode kan de snelle en veelzijdige productie van volledig menselijke monoklonale antistoffen (mAbs) tegen een gewenste antigeen (Ag). mAbs zijn essentiële instrumenten in veel basisonderzoek toepassingen in vitro en in vivo: stroom cytometry, histologie, westelijke bevlekken en blokkerende experimenten bijvoorbeeld. Bovendien worden mAbs gebruikt meer en meer in de geneeskunde voor de behandeling van auto-immuunziekten, kanker, en zo de besturing van transplantatie afwijzing1. Bijvoorbeeld, werden de anti-CTLA-4 en anti-PD-1 (of anti-PD-L1) mAbs onlangs gebruikt als immuun checkpoint-remmers in kanker behandelingen2.

De eerste mAbs werden geproduceerd door immunoglobuline (Ig)-afscheidende hybridomas verkregen uit de milt cellen van geïmmuniseerde muizen of ratten. Echter, de sterke immuunrespons tegen RattenUitrustingen of rat mAbs belemmert hun therapeutisch gebruik bij de mens, als gevolg van hun snelle goedkeuring en de waarschijnlijke inductie van overgevoeligheid reacties3. Om dit probleem aan te pakken, zijn dierlijke eiwitten sequenties van mAbs gedeeltelijk vervangen door menselijke degenen voor het genereren van zogenaamde Chimeer muis-mens of gehumaniseerd antilichamen. Deze strategie vermindert echter slechts gedeeltelijk immunogeniciteit, terwijl zowel de kosten en de tijd-schaal van de productie aanzienlijk te verhogen. Een betere oplossing is het genereren van menselijke mAbs rechtstreeks uit menselijke B-cellen en verschillende strategieën daarvoor zijn beschikbaar. Een van hen is het gebruik van bacteriofaag of gist display. Hierbij weergeven van variabele domeinen vanuit een combinatorische bibliotheek met willekeurige menselijke Ig zware en lichte kettingen op bacteriofagen of gisten en het uitvoeren van een selectie stap met behulp van het specifieke antigeen van belang. Een groot nadeel van deze strategie is dat zware en lichte kettingen willekeurig gekoppeld zijn, leidt tot een zeer grote toename in de diversiteit van de gegenereerde antilichamen. Antilichamen verkregen zijn onwaarschijnlijk overeen moeten komen met degenen die uit een natuurlijke immuunrespons tegen een bepaalde Ag voortvloeien zou. Bovendien, menselijke eiwitvouwing en posttranslationele modificaties zijn niet systematisch gereproduceerd in prokaryoten of zelfs in gisten. Een tweede menselijke mAb productiemethode is de immortalization van natuurlijke menselijke B cellen, door Epstein - Barr virusinfectie of expressie van de anti-apoptotic factoren BCL-6 en BCL-XL4. Echter, deze methode is alleen van toepassing op geheugencellen B en is inefficiënt, vereisen screening van talrijke mAb-producerende vereeuwigd B cellen te identificeren van de weinig (eventuele) mAb-klonen met de gewenste antigene specificiteit. De methode is dus zowel dure en tijdrovende.

Onlangs werd een nieuw protocol voor de productie van menselijke mAbs van geïsoleerde één B cellen5beschreven. Zij beroept zich op een geoptimaliseerde eencellige Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) voor versterking van zowel de zware - en licht-keten segmenten van een enkele cel voor gesorteerde B-codering. Dit wordt gevolgd door het klonen en de uitdrukking van deze segmenten in een eukaryoot expressie systeem, waardoor de wederopbouw van een volledig mens mAb. Dit protocol is gebruikt met succes vanaf B cellen van gevaccineerde donoren. Cellen zijn enkele weken na de vaccinatie verkrijgen van hogere frequenties van B-cellen die gericht is tegen de gewenste Ag, en dus het beperken van de tijd die nodig is voor het screenen van6geoogst. Er zijn ook andere volledig menselijk mAbs verkregen uit HIV+ (Human Immunodeficiency Virus) besmette patiënten7 en melanoom patiënten8. Ondanks deze vooruitgang is er nog steeds geen procedure beschikbaar waarmee het isolement van de Ag-specifieke B cellen onafhankelijk van hun geheugen fenotype of frequentie.

De procedure beschreven hier leidt tot efficiënte ex vivo isolatie van menselijke circulerende B cellen op basis van hun BHG specificiteit, gevolgd door de productie van volledig menselijk antigeen-specifieke mAbs in hoog rendement en met een tijd van lage screening. De methode is niet beperkt tot de geheugencellen B of antilichaam-afscheidende B cellen na een immuunrespons veroorzaakte, maar kan ook worden toegepast op het repertoire van de B-cel menselijke naïef. Dat het werkt zelfs vanaf Ag-specifieke B-cellen aanwezig bij zeer lage frequenties is een goede indicatie van de efficiëntie. Het uitgangspunt van de methode is als volgt: perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) zijn gekleurd met twee tetramers het antigeen van belang presenteren, elk gemarkeerd met een verschillende fluorescerende (b.v.Phycoerythrin (PE) en Allophycocyanin (APC)), en een derde tetrameer presenteren een verwant antigeen geconjugeerd met een derde fluorescerende (bijvoorbeeldBrillant Violet 421 (BV421)). Om te verrijken voor antigeen-bindende cellen, cellen worden vervolgens geïncubeerd met kralen met anti-PE gecoat en anti-APC Abs, en in cel scheiding kolommen gesorteerd. De Fractie van de cel PE+ APC+ is geselecteerd, gekleurd met een scala aan mAbs specifiek voor verschillende PBMC celtypes toe te staan van de identificatie van B-cellen, en onderworpen aan stroom cytometry cel sorteren. B-cellen die PE+ en APC+, maar briljante Violet-, zijn geïsoleerd. Deze stap selecteert tegen cellen die geen B-cellen of niet binden aan de tetramerized antigeen, maar binden aan PE of APC (deze cellen zullen PE+ - APC of PE- APC+) of aan het deel van de niet-antigeen van de tetramers gebruikt (deze cellen zullen BV421+). B-cellen niet zeer specifiek voor de epitoop van belang zijn ook contra geselecteerd bij deze stap (deze cellen zullen ook BV421+). Dus, kan deze methode zeer specifieke B-cellen, uiting van B-cel receptoren (BCRs) te discrimineren tussen twee zeer nauw verwante antigenen kunnen zuiveren. Enkele specifieke B-cellen worden verzameld in buizen en hun PCR-versterkte Ig cDNAs (complementaire deoxyribonucleic zuren) wordt gekloond en wordt geuit door een menselijke cellijn als secreted IgG mAbs.

Als een proof of concept, deze studie beschrijft de efficiënte generatie van menselijke mAbs, die herkennen een peptide gepresenteerd door een grote histocompatibility complex klasse ik (MHC-ik) molecuul en kan onderscheid maken tussen dit peptide en andere peptiden geladen op dezelfde MHC-ik allel. Hoewel het niveau van complexiteit van deze Ag is belangrijk, kunt met deze methode (i) hoge opbrengst herstel van Ag-specifieke mAbs; (ii) de productie van mAbs staat te discrimineren tussen twee structureel sluit Ags. Deze aanpak kan worden uitgebreid tot gevaccineerde en besmette patiënten zonder enige wijziging van het protocol, en ook al met succes is uitgevoerd in een gehumaniseerd rat systeem9. Deze studie beschrijft dus, een veelzijdige en efficiënte aanpak voor het genereren van volledig menselijk mAbs die kunnen worden gebruikt in basisonderzoek en immunotherapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle perifere bloedmonsters werden anonieme volwassen donoren verkregen na de geïnformeerde toestemming, volgens de plaatselijke ethische Commissie (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedure PLER NTS-2016-08).

1. isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen

Opmerking: Grondstof kunnen totale perifere bloed of cytapheresis monsters. Monsters mag niet ouder zijn dan 8 h en aangevuld met anticoagulantia (b.v., heparine).

  1. Verdun bloed met 2 delen (perifere bloed) of 5 volumes (monster cytapheresis) van RPMI (Roswell Park Memorial Instituut) medium.
  2. Zorgvuldig laag 35 mL verdunde celsuspensie op 15 mL van de kleurovergang medium dichtheid in een conische buis van 50 mL. Breng zo veel buizen waar nodig voor het distribueren van alle het verdunde bloed. Centrifugeer bij 1290 x g gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur in een swingende-emmer rotor met rem af.
  3. Zorgvuldig gecombineerd de mononucleaire cellaag op het raakvlak tussen het verloop medium dichtheid en de plasma laag, en de cellen naar een nieuwe conische tube van 50 mL.
  4. Vullen van de buis met RPMI medium, meng samen en centrifugeer bij 1290 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatant.
  5. Resuspendeer de pellet cel in 20 mL van RPMI medium en centrifuge bij 200 x g gedurende 10 minuten te verwijderen van de bloedplaatjes. Verwijder voorzichtig het supernatant. Herhaal deze stap eenmaal.
  6. Resuspendeer de pellet cel in RPMI medium met 10% foetale boviene Serum (FBS).
    Opmerking: Ga direct naar tetrameer labeling of houden cellen bij 4 ° C's nachts bij een concentratie van 107 cellen/mL.

2. tetrameer-geassocieerde magnetische verrijking van Ag-specifieke B-cellen

  1. Ag-tetramers voor te bereiden door het toevoegen van beide PE of APC-geëtiketteerden premium grade streptavidine of BV421-label daar bij een molaire verhouding van 1:4 tot en met biotinyleerd antigeen monomeren. Voeg de juiste hoeveelheid daar-conjugate in drie aparte gedeelten, één aliquot iedere 10 minuten bij kamertemperatuur toevoegen.
  2. Distribueren van cellen (maximaal 3 x 10,8 per buis) in 15 mL conische buisjes samen en centrifugeer bij 460 x g gedurende 5 min.
    Opmerking: Het volgende protocol is voor één buis.
  3. Resuspendeer de pellet cel in 200 µL van PBS (Phosphate Buffered Saline) met 2% FBS. PE-, APC- en BV421-geconjugeerde tetramers, elk met een eindconcentratie van 10 µg/mL toevoegen. Meng goed en laat 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
  4. Bereiden van ijskoude cel scheiding buffer (SB) met behulp van PBS met 0,5% BSA (bovien serumalbumine) en EDTA (ethyleendiamminetetra zuur) 2 mM.
  5. Voeg 10 mL SB. Pellet cellen door centrifugeren bij 460 x g gedurende 5 min.
  6. Resuspendeer de cellen in 500 µL van ijskoude SB. toevoegen 50 µL van anti-PE en 50 µL van anti-APC magnetische microbeads.
  7. Meng goed en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C.
  8. Herhaal stap 2.5 tweemaal.
  9. Het supernatant zorgvuldig elimineren andresuspend de cel pellet bij een concentratie van 2 x 108 cellen/mL in ijs koud SB.
  10. Een grote magnetische kolom geplaatst op een magneet met 3 mL SB equilibreer.
  11. Overdracht celsuspensie van 2.9 op de bovenkant van de equilibrated kolom en laat ze uitlekken volledig. KRITIEKE stap: Voorkom samendoen van de kolom, passeren cellen een 70 µm nylon gaas.
  12. Spoel de buis die de cellen met 3 mL ijs koud SB en overdracht van de buffer rechtstreeks op de kolom (in geval van filtratie, spoel de 70 µm nylon gaas).
  13. De buffer is volledig gedraineerd in de kolom, voeg een andere 3 mL van ijs koud SB naar de kolom.
  14. Herhaal stap 2.13 voor een andere 3 mL wassen.
  15. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats over een conische verzamelen buis 15 mL.
  16. Voeg 5 mL van de koude SB ijs op de top van de kolom en onmiddellijk spoelen de cellen uit de kolom met behulp van de zuiger. Herhaal deze stap eenmaal.
  17. Centrifugeer de verzamelde cellen (verrijkte relevante tetrameer positieve cel Fractie) bij 460 x g gedurende 5 min en ga naar extra antilichaam kleuring.
    Opmerking: Zwembad bijeengezocht cellen uit alle buizen, indien van toepassing.

3. verkleuring van de Ag-specifieke menselijke B-cellen en cel sorteren

  1. Resuspendeer de pellet van de cel met een cocktail van anti-menselijke antilichamen tegen CD3 (eindverdunning: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), en 7AAD (1:1000) in een eindvolume van 100 µL van PBS met 2% FBS. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
  2. Voeg 10 mL PBS naar cellen, centrifuge op 460 x g gedurende 5 minuten, en elimineren de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap eenmaal. Resuspendeer de pellet cel in 200 µL van PBS, filter op 70 µm nylon gaas.
  3. Ga verder met het sorteren van bepaalde B-cellen op het niveau van de eencellige op de sorter cytometer van een cel met een 100 µm-mondstuk en een druk van 20 psi zonder meer dan 1000 evenementen/s9.
    Opmerking: De gating strategie gebruikt is afgebeeld in Figuur 1. Cellen werden voor het eerst gated op CD14-CD16-7AAD- cellen monocyten, NK, en dode cellen (niet afgebeeld in Figuur 1) te sluiten. Vervolgens CD19+ B cellen werden geselecteerd voordat het gating op dubbele gekleurde cellen door PE en APC relevante Ag-tetramers. Niet-specifieke B-cellen werden uitgesloten door het gating op BV421 negatieve cellen (onbevlekt door irrelevante Ag-tetrameer).
  4. Één B-cellen in 8-strip PCR buizen eerder gevuld met 10 µL van 1 x PBS en 10 eenheden van RNAse remmer en geplaatst op een rek voor 96 slangen verzamelen. Onmiddellijk bevriezen de PCR-buizen bij-80 ° C.
    Opmerking: De soort maskers gekozen op het cytometer-instrument zijn opbrengst masker: 0, zuiverheid masker: 32, en fase masker: 0. deze eencellige borg kon worden aangepast aan een 96 - of 384-well PCR plaat, indien nodig. Één B-cellen zo spoedig mogelijk moeten worden bevroren en kunnen worden overgelaten aan-80 ° C voor enkele weken, indien nodig.

4. eencellige RT-PCR

  1. Lyse cellen door rechtstreeks de bevroren monsters in PCR strips bij 70 ° C gedurende 5 minuten in een droge bad Verwarming.
  2. Overdracht van strips om ijs en overgaan tot reverse transcriptie (RT) door toevoeging van 10 µL per buis van een 2 x master mix buffer met 1 mM dNTP, 25 µg Mo/mL oligod(T) inleidingen, 5 µM willekeurige hexamers, 20 eenheden van RNAse remmer en 400 eenheden van reverse-transcriptase.
    Opmerking: Na cel ontdooien, RT moet worden uitgevoerd snel om te voorkomen dat de aantasting van het RNA.
  3. Incubeer bij 25 ° C gedurende 5 minuten om willekeurige hexamers te vermengen, Incubeer gedurende 1 uur bij 50 ° C, en eindig met een incubatie bij 95 ° C gedurende 3 minuten om te stoppen met de reactie.
  4. Ga verder met twee rondes van geneste PCR versterking voor elk van de regio's-codering voor variabele zware (vH) en de kappa (vLκ) of de lambda lichte kettingen (vLλ).
    Opmerking: Als alternatief, RT monsters kunnen worden bevroren bij-20 ° C en gedurende één week.
    1. Voor de eerste ronde van PCR, voeg 3 µL van cDNA voor een 40 µL eindvolume met 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 eenheden van de Polymerase van DNA en 200 nM buitenste inleidingen (Zie Figuur 2 en Tabel van materialen voor primer sequenties).
      Opmerking: Samenstelling van de buitenste inleidingen mix. Voor zware ketting versterking: 4 inleidingen (5' LVH mix) vooruit en 2 achteruit inleidingen (3' CµCγ mix). Voor lichte kappa keten versterking, 3 toekomen inleidingen (5' LV | mix) en 1 achteruit primer (3' Cκ543-566). Voor lichte lambda ketting versterking, 7 vooruit inleidingen (5' LVl mix) en 1 achteruit primer (3' Cl).
      Opmerking: Primers zijn ontworpen door Tiller, et al. voor versterking van alle de zware en lichte keten familie genen5.
    2. De volgende fietsen voorwaarden: 94 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 40 cycli van 30 bij 94 ° C, 30 s s bij 58 ° C voor VH VLκ (60 ° C voor VLλ) en 55 bij 72 ° C, met een definitieve rek s stap bij 72 ° C gedurende 7 minuten.
    3. Voor de tweede ronde PCR, 3 µL van het eerste amplificatie product te gebruiken voor een eindvolume van 40 µL met 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 eenheden van de polymerase van DNA en 200 nM van innerlijke primers met restrictie-enzym sites over klonen in expressie vectoren (Zie Figuur 2 en Tabel van materialen voor primer sequenties).
      Opmerking: Samenstelling van innerlijke inleidingen mix. Voor zware ketting versterking: 9 inleidingen (5' AgeIVH mix) vooruit en 3 achteruit inleidingen (3' SalIJH mix). Voor lichte kappa keten versterking, 9 toekomen inleidingen (5' AgeIV | mix) en 3 omgekeerde inleidingen (3' BsiWIJκ mix). Voor lichte lambda ketting versterking, 6 vooruit inleidingen (5' AgeIVl mix) en 1 achteruit primer (3' XhoICl).
      Opmerking: Primers zijn ontworpen door Tiller et al., voor versterking van alle van de zware en lichte keten familie genen5.
    4. De volgende fietsen voorwaarden: 94 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 40 cycli van 30 bij 94° C, 30 s bij 58 ° C voor VH LCκ (60 ° C voor LCλ) en 45 s s bij 72 ° C met een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 7 minuten.
  5. Positieve wells identificeren door migreren 5 μL van PCR producten van vH, vLκ en vLλ op een 1,5% agarose gel (500 bp producten voor variabele zware ketting coderen segmenten) en een 350 bp product voor variabele lichtketting codering segmenten.
  6. De resterende 35 µL PCR producten resterende positieve putjes met behulp van ultrafiltratie membranen ontworpen voor zuivering van PCR producten te zuiveren.
  7. Elueer PCR producten met 60 µL van H2O.

5. weergave klonen

  1. Bereiden van Inserts
    Opmerking: Verteren 60 µL van elke gezuiverde PCR product in een eindvolume van 100 µL met de juiste restrictie-enzym-buffer.
    1. Voor vH PCR producten, 50 eenheden van AgeI en 50 eenheden van SalI toevoegen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    2. Voor vLλ PCR producten, voeg 50 eenheden van AgeI en 50 eenheden van XhoI, en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    3. VLκ PCR producten, toevoegen van 50 eenheden van AgeI en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Zuiveren van geklaard met behulp van 96 PCR membranen en elueer met 60 µL van H2O. Digest het 60 µL eluaat in een eindvolume van 100 µL BsiWI restrictie-enzym buffer, toevoegen van 50 eenheden van BsiWI en incubeer gedurende 1 uur bij 55 ° C.
    4. Inactivering van de enzymen door verwarming bij 80 ° C gedurende 15 minuten.
  2. Voorbereiding van het uiten van vectoren
    Opmerking: vH PCR producten zijn gekloond in een vector met expressie (HCγ1) met de constante zware ketting Cγ1 van IgG1. vLκ PCR producten zijn gekloond in een vector met expressie (LCκ) met de constante lichtketting Cκ. vLλ PCR producten zijn gekloond in een vector met expressie (LCλ) met de constante lichtketting Cλ.
    1. De spijsvertering van het volgende uitvoeren:
      1. Meng 1 µg uitdrukking HCγ1 vector met 10 eenheden van AgeI en 10 eenheden van SalI enzym in een totaal volume van 20 µL van het restrictie buffer door de fabrikant aanbevolen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
      2. Meng 1 µg expressie vector LCκ met 10 eenheden van enzym van de beperking van de AgeI in een totaal volume van 20 µL van het restrictie buffer door de fabrikant aanbevolen en incubeer gedurende 1 uur bij 37° C. Voeg 10 eenheden van restrictie-enzym BsiWI toe en incubeer gedurende 1 uur bij 55 ° C.
      3. Meng 1 µg expressie vector LCλ met 10 eenheden van AgeI en 10 eenheden van XhoI enzym in een totaal volume van 20 µL van het restrictie buffer door de fabrikant aanbevolen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C
    2. Verwarm elk mengsel van de spijsvertering bij 65 ° C gedurende 10 min naar de inactivering van de enzymen van de beperking.
    3. Uitvoeren van afbinding van 5 µL van het PCR-product verteerd met 2 µL (100 ng) van overeenkomstige gelineariseerde expressie vector in een totaal volume van 20 µL 1 x DNA ligase buffer met 1 eenheid van T4 DNA-Ligase door incubatie 's nachts bij 4 ° C.
      Opmerking: U kunt ook Afbinding wordt uitgevoerd gedurende 3 uur bij 4° C.
  3. Klonen
    1. Electroporate 1 µL van het mengsel afbinding 20 µL in 45 µL van zelfgemaakte electrocompetent TOP10 E. coli (huidige protocollen in moleculaire biologie, sectie 1.8.4-1.8.8). Onmiddellijk Voeg 500 µL van 2 X YT medium en in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 min. verspreiding getransformeerd bacteriën op 2 x YT ampicilline platen uit te broeden. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    2. Scherm voor elke transformatie, acht kolonies door PCR.
      1. Instellen van een premix van de reactie als volgt op het ijs: 45 µL van 5 x 10 µL van voorwaartse primer (voorraad 10 µM) kwekers in de vector-reeks (primer Ab-vec-gevoel), PCR Buffer, 12 µL van MgCl2 (25 mM), 4 µL van dNTPs (uit een voorraad met 10 mM van elk) , en 10 µL van omgekeerde primer (voorraad 10 µM) gericht op de constante zware of lichte keten regio (Zie Tabel van materialen voor primer sequenties). Vul aan tot een eindvolume van 200 µL met H2O. Voeg vervolgens 4 µL van het enzym DNA-polymerase (5 U/µL).
      2. Distribueren van 25 µL van reactie premix per 8-strip PCR buis op ijs.
      3. Gebruik een steriel tandenstoker te halen van afzonderlijke kolonies. Strijk de tandenstoker op een 2 x TY ampicilline bord vormen een repliceren bord en dompel het vervolgens in een PCR reactiebuis.
      4. Uitvoeren van de screening PCR de volgende fietsen voorwaarden: 94 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 25 cycli van 30 bij 94 ° C, 30 s s bij 55 ° C en 50 s bij 72 ° C.
      5. Positieve bacteriën identificeren door migreren 5 µL van het PCR producten op een 1,5% agarose gel.
        Opmerking: Positieven kolonies geven een PCR product ongeveer 850 bp voor de zware ketting vector en 600 bp voor de lichtketting vector.
    3. Inoculeer vier positieve kolonies van de repliceren plaat in 2 mL van LB medium en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
    4. Pak plasmiden uit vloeibare culturen met behulp van een plasmide zuivering kit, zoals aangegeven door de fabrikant.
    5. Controleer of de juiste invoeging van variabele domeinen door Sanger sequencing van de plasmiden met de Ab-vec-zin-primer.
      Opmerking: Plasmiden met de juiste invoegen (het coderen van de HC en de bijbehorende LC) zijn cotransfected in de 293A cellen van secretie. De specificiteit van kleine schaal geproduceerde mAbs is bepaald door ELISA. Grootschalige productie wordt vervolgens uitgevoerd indien van toepassing.

6. produktie van mAbs

  1. Kleinschalige productie voor de controle op specificiteit
    1. Eergisteren de transfectie, zaad 15.000 menselijke embryonale nier 293A (HEK 293A) cellen in 200 µL van Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS per putje in 96-wells-platen. Na een nacht bebroeden in een CO2 incubator (5% CO2) bij 37 ° C.
    2. Cotransfect van 293A cellen in DMEM medium met 10% FBS met behulp van een lineaire polyethylenimine derivaat als transfectiereagens.
      Opmerking: Voer de transfectie in triplicates. Het volgende protocol is voor één putje van een vlakke onderkant 96-wells-plaat.
      1. Verdun de 0,5 µL van DNA transfectiereagens in 10 µL van 150 mM NaCl. Verdun 0,125 µg voor vH en vL waarin vectoren 0,125 µg in 10 µL van 150 mM NaCl. Vortex elke verdunning voor 10 s.
      2. Voeg toe 10 µL verdund DNA transfectiereagens in de 10 µL DNA oplossing. Vortex 15 s en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg de mix 20 µL drop-wise op 293A cellen, en meng door zachtjes zwenken van de plaat.
    3. Vervang de middellange 16 h na transfectie en cultuur cellen voor 5 dagen in serumvrij medium.
      Opmerking: Gebruik serumvrij medium om te voorkomen dat serum Igs besmetten de geproduceerde antistoffen.
    4. Cellen en puin te elimineren door middel van centrifugeren bij 460 x g gedurende 5 min.
    5. Oogst supernatant door aspiratie met een meerkanaals-pipet en ze vervolgens overbrengen naar een V-bodem 96-wells-plaat.
    6. Jas relevante Ag's nachts bij 4 ° C in 100 µL per putje van gereconstitueerde ELISA/ELISPOT coating buffer 1 x op een eindconcentratie van 2 µg/mL in 96-wells-platen voor ELISA. Zie voorbeelden in 9.
    7. Blok putjes met 10% FBS DMEM medium voor 2 uur bij 37 ° C
    8. Voeg 50 µL van supernatant van 293A transfected cellen uit stap 6.1.5 en incubeer gedurende 2 uur op RT.
    9. Voeg 100 µL van een anti-menselijke IgG Ab geconjugeerd met horseradish peroxidase (HRP) enzym bij 1 µg/mL en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voeg 50 µL chromogenic substraat (TMB), en incubeer gedurende 20 min.
    10. Lezen van optische dichtheid bij 450 nm in een spectrofotometer.
      Opmerking: De specifieke mAbs geopenbaard door analyse ELISA verder kan worden geproduceerd op grote schaal en gezuiverd op eiwit een kolom presenteren affiniteit voor menselijke IgG.
  2. Grootschalige productie en zuivering van specifieke mAbs
    1. Eergisteren de transfectie, zaad 6 x 106 menselijke embryonale nier 293A (HEK 293A) cellen in 175 cm2 flacons met 25 mL DMEM aangevuld met 10% FBS. Na een nacht bebroeden in een CO2 incubator (5% CO2) bij 37 ° C.
      Opmerking: De cellen moet 70% heuvels wanneer transfected.
    2. Cotransfect van 293A cellen in DMEM medium met 10% FBS met behulp van een lineaire polyethylenimine derivaat als transfectiereagens.
      1. Verdun 50 µL van DNA transfectiereagens in 450 µL van 150 mM NaCl. Verdun 10 µg voor vH en vL waarin vectoren 10 µg in 500 µL van 150 mM NaCl. Vortex 10 s elke verdunning.
      2. Verdunde DNA transfectiereagens aan de oplossing van DNA toevoegen. Vortex 15 s en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. De 1 mL mix drop-wise toevoegen aan de cellen, en meng door de erlenmeyer voorzichtig te zwenken.
    3. Vervang de middellange 16 h na transfectie en cultuur cellen voor 5 dagen in serumvrij medium.
    4. Oogst medium door zuigen met een precisiepipet 25 mL.
    5. Cellen en puin te elimineren door middel van centrifugeren bij 460 x g gedurende 5 min.
    6. Zuiveren van de antilichamen met behulp van een 1 mL kolom bekleed met EiwitA op een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) systeem bij 4 ° C.
      1. Equilibreer het eiwit een kolom sepharose met 20 mM fosfaatbuffer (pH 7).
      2. Filter het kweekmedium cel van 6.2.5 met behulp van een 1,22 µm filter, dan is het een 0,45 µm filter.
      3. Het laden van het gefilterde medium op de kolom.
      4. Wassen met 20 mM fosfaatbuffer (pH 7) en elueer met een 0,1 M citraat buffer (pH 3.5).
      5. Lezen van optische dichtheden op 280 nm op een absorptie spectrofotometer en onmiddellijk neutraliseren eiwithoudende breuken met 1 M Tris buffer (pH 9).
    7. Dialyze gezuiverde Ab's nachts bij 4 ° C in een cassette met een 3, 5 K moleculair gewicht cutoff tegen PBS buffer (pH 7.4).
    8. Steriliseren door 0,2 µm filtratie en controle zuiverheid in grootte-uitsluiting chromatografie, zoals aangegeven door de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vanaf PBMC van gezonde donoren, dit project presenteert de generatie van menselijke mAbs, die de peptide Pp65495 herkennen (Pp65, van menselijke cytomegalovirus) gepresenteerd door de grote histocompatibility complex klasse ik (MHC-ik) molecuul HLA - A * 0201 () HLA-A2). Deze mAbs kan onderscheid maken tussen deze complex en complexen die andere peptiden geladen op de dezelfde MHC-ik molecuul.

PBMC werden gekleurd met...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het voorgestelde protocol is een krachtige methode voor het genereren van menselijke mAbs rechtstreeks vanuit Ag-specifieke B-cellen in het bloed circuleren. Het combineert drie belangrijke aspecten: (i) het gebruik van een tetrameer-geassocieerde magnetische verrijking, waarmee een ex vivo isolatie van zelfs zeldzame Ag-bindende B cellen; (ii) een gating strategie die gebruikmaakt van drie Ag tetramers (twee relevante enen en één irrelevant) geëtiketteerd met drie verschillende fluorochromes te isoleren, door s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken de Cytometry faciliteit "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) voor deskundige technische bijstand. Wij danken ook al het personeel van de productie van recombinante eiwitten (P2R) en IMPACT platformen (INSERM 1232 SFR Santé, Biogenouest, Nantes) voor hun technische ondersteuning. Wij danken Emmanuel Scotet en Richard Breathnach voor constructieve opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd financieel ondersteund door het IHU-Cesti project gefinancierd door de Franse regering «Investissements d'Avenir» programma, beheerd door de Franse nationale onderzoek Bureau (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Het IHU-Cesti project wordt ook ondersteund door de Nantes Métropole en Région Pays de la Loire. Dit werk werd gerealiseerd in het kader van het programma van de LabEX IGO ondersteund door de National Research Agency via de investering van het toekomstige programma ANR-11-LABX-0016-01.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HEK 293A cell lineThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by life technologies21969-035(+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)Gibco by life technologies31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4AmbionAM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8Invitrogen by Life Technologies15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - lymphocytes separation mediumEuroBioCMSMSL01-01density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugateInvitrogen by Life TechnologiesS21388premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugateInvitrogen by thermoFisher scientificS323621mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidinBiolegend405225conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotorMiltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109Used dilution 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440Used dilution 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter CytometerBD Biosciences
8-strip PCR tubesAxygen321-10-061
Racks for 96 microtubesDominique Dutscher45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)Invitrogen by thermoFisher scientific10777-019qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase FreeGibco10977-035
Oligod(T)18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
Random hexamersInvitrogen by thermoFisher scientificN8080127qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptaseInvitrogen by thermoFisher scientific18080-044qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerasePromegaM7805
dNTP Set, Molecular biology gradeThermo ScientificR01824*100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers

Referenties

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532(2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Tags

Mononucleaire cellen uit perifeer bloedsingle-cell RT-PCRflowcytometrie-sorteringHLA-A2/Pp65-tetramerenscheiding met magnetische micro-beadsELISA-assayoppervlakteplasmonresonantieamplificatie van immunoglobulinegenen
Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.