Het combineren van de mitotische cel synchronisatie en hoge resolutie confocale microscopie om te bestuderen van de rol van multifunctionele celcyclus eiwitten tijdens de mitose

Summary

Presenteren we een protocol voor de dubbele thymidine synchronisatie van HeLa cellen gevolgd door analyse met behulp van hoge resolutie confocale microscopie. Deze methode is de sleutel tot het verkrijgen van groot aantal cellen die zich synchroon van S-fase naar mitose, studies over mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies bezitten inschakelen.

Abstract

Studie van de verschillende regelgevende gebeurtenissen van de celcyclus in een fase-afhankelijke manier biedt een duidelijk inzicht over celgroei en deling. De synchronisatie van cel populaties in specifieke stadia van de celcyclus is gevonden zeer nuttig in dergelijke experimentele inspanningen. Synchronisatie van cellen door behandeling met chemische stoffen die relatief minder giftig zijn kan nuttig zijn over het gebruik van farmacologische remmende geneesmiddelen voor de studie van de daaruit voortvloeiende celcyclus gebeurtenissen en specifieke verrijking van geselecteerde mitotische fasen te verkrijgen. Hier beschrijven we het protocol voor synchroniseren menselijke cellen in verschillende stadia van de cel cyclus, met inbegrip van zowel in S-fase en M fase met een dubbele thymidine blok en vrijgeven van de procedure voor het bestuderen van de functionaliteit van de mitotische eiwitten in chromosoom uitlijning en segregatie. Dit protocol is uiterst nuttig voor het bestuderen van de mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die gevestigde interfase functies bezitten. In ons geval, kan de mitotische rol van Cdt1, een proteïne essentieel voor replicatie oorsprong licentieverlening in de G1-fase, effectief alleen wanneer G2/M-specifieke Cdt1 kan worden uitgeput worden bestudeerd. We beschrijven het gedetailleerd protocol voor uitputting van G2/M-specifieke Cdt1 met dubbele thymidine synchronisatie. We hebben ook uitleggen van het protocol van cel fixatie, en leven cel geschikt zijn met behulp van hoge resolutie confocale microscopie na thymidine release. De methode is ook handig voor het analyseren van de functie van de mitotische eiwitten onder zowel fysiologische en verontrust voorwaarden zoals Hec1, een onderdeel van het Ndc80 complex, omdat het een tot het verkrijgen van grote steekproeven van mitotische cellen voor vaste en levende cel in staat stelt analyse zoals we hier laten zien.

Introduction

In de celcyclus ondergaan cellen een aantal sterk gereguleerde en stoffelijk gecontroleerde gebeurtenissen voor de nauwkeurige duplicatie van hun genoom en proliferatie. Bij zoogdieren bestaat de celcyclus uit interfase en M-fase. In de interfase, die bestaat uit drie fasen - G1, S en G2, de cel duplicaten zijn genoom en ondergaat groei die nodig is voor de normale celcyclus progressie^1,2. In de M-fase, die uit de mitose (profase, prometaphase, metafase, anafase, en telofase) en cytokinese bestaat, produceert een ouderlijke cel twee genetisch identieke dochtercellen. In de mitose, zuster chromatiden van gedupliceerde genoom zijn verkorte (profase) en op hun kinetochoren worden vastgelegd door de microtubuli van de geassembleerde mitotische spindel (prometaphase), drijft dat de uitlijning op de metafase-plaat (metafase), gevolgd door hun gelijk segregatie als zuster chromatiden zijn gesplitst naar en getransporteerd naar tegenovergestelde spindel palen (anafase). De twee dochtercellen worden fysiek gescheiden door de activiteit van een actine gebaseerde contractiele ring (telofase en cytokinese). De kinetochoor is een gespecialiseerde eiwithoudende structuur die in de centromeric regio van chromatiden assembleert en dienen als bijlage sites voor spindel microtubuli. Haar belangrijkste functie is te rijden van chromosoom vastleggen, uitlijning, en hulp bij het corrigeren van onjuiste spindel microtubulus bijlage, terwijl de spindel vergadering controlepost te handhaven van de trouw van het chromosoom segregatie^3,4te bemiddelen.

De techniek van cel synchronisatie fungeert als een ideaal hulpmiddel voor het begrijpen van de molecuul- en structuurformule gebeurtenissen die betrokken zijn bij de celcyclus. Deze aanpak is gebruikt om te verrijken cel populaties in specifieke fasen voor verschillende soorten analyses, met inbegrip van profilering van genexpressie, analyses van cellulaire biochemische processen, en detectie van subcellular localisatie van eiwitten. Gesynchroniseerde zoogdiercellen kunnen worden gebruikt, niet alleen voor de studie van individuele genproducten, maar ook voor een aanpak met betrekking tot de analyse van hele genomen, met inbegrip van microarray analyse van gen expressie⁵, miRNA expressie patronen⁶, translationeel verordening⁷, en Proteoom analyse van eiwit wijzigingen⁸. Synchronisatie kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de effecten van genexpressie of eiwit knock-down of knock-out, of van chemische stoffen op de celcyclus.

Cellen kunnen worden gesynchroniseerd in de verschillende stadia van de celcyclus. Zowel de fysische en chemische methoden worden veel gebruikt voor de synchronisatie van de cel. De belangrijkste criteria voor synchronisatie van de cel zijn dat synchronisatie noncytotoxic en omkeerbaar moet. Vanwege de mogelijke negatieve cellulaire gevolgen cellen door farmacologische agenten te synchroniseren, kunnen afhankelijk van de chemische methoden nuttig zijn voor de studie van de celcyclus belangrijke gebeurtenissen. Bijvoorbeeld hydroxyurea, amphidicolin, mimosine en Lovastatine, kunnen worden gebruikt voor de synchronisatie van de cel in G1/S fase maar vanwege hun effect op de biochemische pathways, die ze remmen, ze activeren celcyclus checkpoint mechanismen en doden een belangrijke Fractie van de cellen^9,10. Aan de andere kant, kan feedback remming van de DNA-replicatie door thymidine toe te voegen aan de groei-media, bekend als "thymidine blok", de celcyclus op bepaalde punten^11,12,13arresteren. Cellen kunnen ook worden gesynchroniseerd op G2/M fase door behandeling met nocodazole en RO-3306^9,14. Nocodazole, waardoor microtubulus vergadering, heeft een relatief hoge cytotoxiciteit. Bovendien kunnen nocodazole-gearresteerd cellen terug naar interfase precociously door mitotische ontsporing. Dubbele thymidine blok arrestatie cellen in G1/S fase en na vrijlating uit het blok cellen worden gevonden om door te gaan synchroon door G2 en in de mitose. De normale voortgang van de celcyclus voor cellen verlost van thymidine blok kan worden waargenomen onder hoge resolutie confocale microscopie door cel fixatie of levende imaging. Het effect van verstoring van de mitotische eiwitten kan worden bestudeerd specifiek wanneer cellen invoert en ga door mitose na vrijlating uit dubbele thymidine blok. Cdt1, een multifunctionele eiwit, is betrokken bij het DNA replicatie oorsprong licentieverlening in de G1-fase en is ook vereist voor kinetochoor microtubulus bijlagen tijdens de mitose¹⁵. Studeren de functie van Cdt1 tijdens de mitose, moet men een methode die het effect van de uitputting op replicatie licenties tijdens de G1-fase, terwijl tegelijkertijd het verrichten van de uitputting specifiek tijdens de G2/M fase alleen vermijdt te hanteren. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen die zijn gebaseerd op de dubbele thymidine blok te bestuderen van de mitotische rol van eiwitten die meerdere functies tijdens verschillende stadia van de celcyclus door zowel vaste als live-cel imaging.

Protocol

1. dubbele Thymidine blok en Release: reagens preparaten

1. Make 500 mL Dulbecco van bewerkt Eagle medium (DMEM) medium aangevuld met 10% FBS, penicilline en streptomycine.
2. Maak 100 mM voorraad van thymidine in steriel water en winkel in aliquots bij-80 ° C.

2. protocol voor vaste cel beeldvorming van mitotische progressie (figuur 1A)

1. Op dag 1, zaad ~ 2 x 10⁵ HeLa cellen in de putjes van de plaat van een 6-well met een slip van de cover (gesteriliseerd met 70% ethanol en UV-bestraling) en 2 mL DMEM voedingsbodem. Het groeien van cellen in een bevochtigde incubator gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO₂.
2. 1^st thymidine blok: op dag 2, meng grondig het vereiste volume van thymidine in verse DMEM media (100 mM voorraad, 2 mM eindconcentratie).
3. Voeg toe 2 mL thymidine-bevattende media aan de cellen in elk putje van de 6-put plaat en incubeer gedurende 18 h.
4. Op dag 3, gecombineerd het medium en wassen de cellen tweemaal met 2 mL 1 x PBS en eenmaal met verse voorverwarmde DMEM; het groeien van cellen in verse voorverwarmde DMEM medium voor 9u tot vrijlating van de cellen van het blok.
5. 2^nd thymidine blok: opnieuw, voeg 2 mL van thymidine-bevattende media (definitieve concentratie van 2 mM) aan de cellen in elk putje van de plaat 6-well.
6. Incubeer gedurende een ander 18 h.
7. Op dag 4, gecombineerd het medium en wassen de cellen tweemaal met 2 mL 1 x PBS en eenmaal met verse voorverwarmde DMEM.
8. Verdunde siRNAs (controle en Cdt1) en transfectiereagens in serum gratis groeimedium voor 10 min. afzonderlijk meng ze samen en incubeer gedurende 20 min op RT. De uiteindelijke concentratie van siRNA gebruikt in elke transfectie was 100 nM. Het reactiemengsel toevoegen aan de cellen die zijn gewassen uit Thymidine.
9. Incubeer bij 37 ° C gedurende 9-10 uur vrij te blokkeren en herstellen van de cellen op de cover slips met 4% cellen PFA voor 20 min op RT.
   Let op: PFA is giftig, adequate bescherming dragen.
10. Immunokleuring cellen, na permeabilizing met 0,5% (v/v) wasmiddel voor 10 min op RT en wassen van de cellen tweemaal met 1 x PBS voor elke 5 min.
    1. Het blokkeren van cellen met 1% BSA (w/v) in 1 x PBS voor 1 h bij RT gevolgd door behandeling van de cellen met 50 µL van primaire antilichamen (muis anti-α-tubuline antilichaam verdund op 1:1, 000, konijn anti-Zwint1 antistof verdund op 1:400 en muis anti-phospho-ɣ H2AX verdund op 1:300) bij 1% (m/v) BSA in 1 x PBS gedurende 1 uur bij 37 ^oC.
    2. Na het wassen uit de cellen met 1 x PBS driemaal, cellen met 50 µL van secundaire antilichamen voor elk cover-glas (Alexa 488 en Rhodamine rood in 1:250 verdunningen in 1% (m/v) BSA in 1 x PBS) behandelen gedurende 1 uur op RT.
    3. Na het wassen de cellen met 1 x PBS tweemaal voor elke 5 min, cellen met DAPI behandelen (0.1µg / mL in 1 x PBS) voor 5 min op RT.
    4. Plaats de cover slip geconfronteerd met cellen aan de juiste montage media op een duidelijke microscopische dia na het wassen de cellen met 1 x PBS tweemaal voor elke 5 min.
11. Beeld de cellen voor de eiwitten immunostained met 60 X of 100 X 1.4 nb Plan-apochromatische DIC olie onderdompeling doelstelling gemonteerd op een omgekeerde hoge resolutie confocal microscoop uitgerust met een passende camera als nodig is voor de kwaliteit van beelden vereist.
12. Verwerven beelden bij kamertemperatuur zoals z-stacks met dikte van 0,2 µm met behulp van software geschikt zijn voor de Microscoop.

3. protocol voor levende cellen beeldvorming van mitotische progressie (figuur 3A)

1. Op dag 1, ongeveer 0,5-1 x 10⁵ HeLa cellen stabiel mCherry-H2B en GFP-α-tubuline (iets variabele op basis van celtype en de eiwitten die zij uitdrukken) uitdrukken in 35 mm glas onder gerechten met 1,5 mL van DMEM medium zaad en ze groeien in een bevochtigde Incubator voor 24u op 37 ^oC en 5% CO₂.
2. 1^st thymidine blok: op dag 2, voeg 1,5 mL thymidine-bevattende media aan de cellen in de schotel (100 mM thymidine, definitieve concentratie van 2 mM,).
3. Incubeer gedurende 18 h.
4. Op dag 3, het medium met thymidine gecombineerd en wassen van de cellen driemaal, tweemaal met 2 mL 1 x PBS en eenmaal met verse voorverwarmde DMEM.
5. Verdunde siRNAs (controle en Hec1) en transfectiereagens met gratis groeimedium serum voor 10 min. afzonderlijk meng ze samen en incubeer gedurende 20 min op RT. De uiteindelijke concentratie van siRNA gebruikt in elke transfectie was 100 nM. Het reactiemengsel toevoegen aan de cellen die zijn gewassen uit Thymidine.
6. Het groeien van cellen in 1,5 mL verse voorverwarmde DMEM voedingsbodem voor 8 h tot het vrijgeven van de cellen van het blok.
7. 2^nd thymidine blok: Voeg 1,5 mL thymidine-bevattende media (definitieve concentratie van 2 mM) aan de cellen in de schotel.
8. Incubeer gedurende een ander 18 h.
9. Op dag 4, gecombineerd het medium en wassen van de cellen driemaal, tweemaal met 2 mL 1 x PBS en eenmaal met verse voorverwarmde DMEM. Vervolgens groeien van cellen in verse voorverwarmde Leibovitz is (L-15) medium aangevuld met 10% FBS en 20 mM HEPES bij pH 7.0 voor 8 h tot het vrijgeven van de cellen van het blok.
10. Zet de schotel in de temperatuur controle kamer instellen in de hoge resolutie confocal microscoop die ten minste 30 minuten voordat u begint met de beeldvorming om te stabiliseren de on-stage en experimentele temperaturen al heeft ontstoken.
11. Focus op heldere gebied met 60 x doelstelling totdat cellen zichtbaar zijn, dan handmatig de on-stage ziften naar de regio van keuze.
12. Instellen van het licht en laser macht/blootstelling, afbeelding overname parameters en duur van het experiment met behulp van de Microscoop afbeelding acquisitie software van keuze. Gebruik filters voor GFP (488 excitatie; 385 nm emissie) en mCherry (561 nm excitatie en 385 nm emissie) te verwerven van de beelden.
13. De time-lapse experiment uitvoeren door afzonderlijk verwerven gepulseerde doorvallend licht en fluorescentie beelden elke 10 min voor een periode tot 16 h.
14. Verwerven van beelden zoals twaalf 1.0 µm-gescheiden z-vliegtuigen om 9 h na vrijlating uit het blok van de dubbele thymidine softwarematig aan de Microscoop aangepast.
15. Analyseren van de beelden voor het bijhouden van afzonderlijke cellen voor de mitotische progressie en tenslotte de bijbehorende film met de sourcesoftware Fiji/ImageJ monteren.

Results

Studie van de mitotische progressie en microtubulus stabiliteit in cellen vast na vrijlating uit dubbele thymidine blok
Cdt1 is betrokken bij de licentiëring van DNA replicatie oorsprong in de G1-fase. Het tijdens de S-fase is afgebroken, maar opnieuw accumuleert in G2/M fase. Om te bestuderen zijn rol in de mitose, moet de endogene Cdt1 worden uitgeput specifiek gericht is op de met behulp van de meest geschikte cel synchronisatie techniek, de dubbele thymidine blok

Discussion

Het belangrijkste voordeel van dubbele thymidine synchronisatie is bevat het een uitgebreide steekproef-grootte van mitotische cellen in een korte tijd venster met veel van deze cellen invoeren van mitose in unison, waardoor ook analyses van chromosoom uitlijning, bipolaire spindel vorming en scheiding van het chromosoom met een veel hoger rendement.

Vele regelgevende eiwitcomplexen en signaalroutes zijn gewijd aan het waarborgen van de normale progressie door middel van mitose en deregulering...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Bewaar bij 4 °C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Bewaar bij 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Bewaar bij 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Bewaar bij 4 °C
Penicillin en streptomycine	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1.000 verdunning
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Bewaar bij 4 °C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Opgelost in steriele gedistilleerd water
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
HeLa cellen die GFP-H2B tot expressie brengen
HeLa cellen die GFP-α-tubulin en mCherry H2B tot expressie brengen	Genereus geschenk van Dr. Kozo Tanaka van Tohoku universiteit, Japan
Formaldehyde-oplossing	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toxisch, voorzichtigheid geboden
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toxisch, voorzichtigheid geboden
Muis anti-α-tubuline	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	1:1.000 verdunning
Konijn anti-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 verdunning
Muis anti-fosfo-γH2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clone JBW301	1:300 verdunning
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 verdunning
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 verdunning
BioLite 6 welplaat	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Glasbodem schotel	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE omgekeerd microscoop	Nikon Instruments
Spinning disc voor confocale	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 golflengte laser	Agilent Technologies
Incubatie systeem voor microscopen	Tokai Hit	TIZB
NIS-elements software	Nikon Instruments