Het combineren van de mitotische cel synchronisatie en hoge resolutie confocale microscopie om te bestuderen van de rol van multifunctionele celcyclus eiwitten tijdens de mitose

Summary

Presenteren we een protocol voor de dubbele thymidine synchronisatie van HeLa cellen gevolgd door analyse met behulp van hoge resolutie confocale microscopie. Deze methode is de sleutel tot het verkrijgen van groot aantal cellen die zich synchroon van S-fase naar mitose, studies over mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies bezitten inschakelen.

Abstract

Studie van de verschillende regelgevende gebeurtenissen van de celcyclus in een fase-afhankelijke manier biedt een duidelijk inzicht over celgroei en deling. De synchronisatie van cel populaties in specifieke stadia van de celcyclus is gevonden zeer nuttig in dergelijke experimentele inspanningen. Synchronisatie van cellen door behandeling met chemische stoffen die relatief minder giftig zijn kan nuttig zijn over het gebruik van farmacologische remmende geneesmiddelen voor de studie van de daaruit voortvloeiende celcyclus gebeurtenissen en specifieke verrijking van geselecteerde mitotische fasen te verkrijgen. Hier beschrijven we het protocol voor synchroniseren menselijke cellen in verschillende stadia van de cel cyclus, met inbegrip van zowel in S-fase en M fase met een dubbele thymidine blok en vrijgeven van de procedure voor het bestuderen van de functionaliteit van de mitotische eiwitten in chromosoom uitlijning en segregatie. Dit protocol is uiterst nuttig voor het bestuderen van de mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die gevestigde interfase functies bezitten. In ons geval, kan de mitotische rol van Cdt1, een proteïne essentieel voor replicatie oorsprong licentieverlening in de G1-fase, effectief alleen wanneer G2/M-specifieke Cdt1 kan worden uitgeput worden bestudeerd. We beschrijven het gedetailleerd protocol voor uitputting van G2/M-specifieke Cdt1 met dubbele thymidine synchronisatie. We hebben ook uitleggen van het protocol van cel fixatie, en leven cel geschikt zijn met behulp van hoge resolutie confocale microscopie na thymidine release. De methode is ook handig voor het analyseren van de functie van de mitotische eiwitten onder zowel fysiologische en verontrust voorwaarden zoals Hec1, een onderdeel van het Ndc80 complex, omdat het een tot het verkrijgen van grote steekproeven van mitotische cellen voor vaste en levende cel in staat stelt analyse zoals we hier laten zien.

Introduction

In de celcyclus ondergaan cellen een aantal sterk gereguleerde en stoffelijk gecontroleerde gebeurtenissen voor de nauwkeurige duplicatie van hun genoom en proliferatie. Bij zoogdieren bestaat de celcyclus uit interfase en M-fase. In de interfase, die bestaat uit drie fasen - G1, S en G2, de cel duplicaten zijn genoom en ondergaat groei die nodig is voor de normale celcyclus progressie^1,2. In de M-fase, die uit de mitose (profase, prometaphase, metafase, anafase, en telofase) en cytokinese bestaat, produceert een ouderlijke cel twee genetisch identieke dochtercellen. In de mitose, zuster chromatiden van gedupl....

Protocol

1. dubbele Thymidine blok en Release: reagens preparaten

1. Make 500 mL Dulbecco van bewerkt Eagle medium (DMEM) medium aangevuld met 10% FBS, penicilline en streptomycine.
2. Maak 100 mM voorraad van thymidine in steriel water en winkel in aliquots bij-80 ° C.

2. protocol voor vaste cel beeldvorming van mitotische progressie (figuur 1A)

1. Op dag 1, zaad ~ 2 x 10⁵ HeLa cellen in de putjes van de plaat van een 6-well met een slip van de cover (gesteriliseerd met 70% ethanol en UV-bestraling) en 2 mL DMEM voedingsbodem. Het groeien van cellen in een bevochtigde incubator ged....

Results

Studie van de mitotische progressie en microtubulus stabiliteit in cellen vast na vrijlating uit dubbele thymidine blok
Cdt1 is betrokken bij de licentiëring van DNA replicatie oorsprong in de G1-fase. Het tijdens de S-fase is afgebroken, maar opnieuw accumuleert in G2/M fase. Om te bestuderen zijn rol in de mitose, moet de endogene Cdt1 worden uitgeput specifiek gericht is op de met behulp van de meest geschikte cel synchronisatie techniek, de dubbele thymidine blok

Discussion

Het belangrijkste voordeel van dubbele thymidine synchronisatie is bevat het een uitgebreide steekproef-grootte van mitotische cellen in een korte tijd venster met veel van deze cellen invoeren van mitose in unison, waardoor ook analyses van chromosoom uitlijning, bipolaire spindel vorming en scheiding van het chromosoom met een veel hoger rendement.

Vele regelgevende eiwitcomplexen en signaalroutes zijn gewijd aan het waarborgen van de normale progressie door middel van mitose en deregulering.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000 dilution
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Store at 4 °C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B	Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toxic, needs caution
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clone JBW301	1:300 dilution
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
BioLite 6 well multidish	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Glass bottom dish	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope	Nikon Instruments
Spinning disc for confocal	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser	Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes	Tokai Hit	TIZB
NIS-elements software	Nikon Instruments